CN104946714A - 微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原多肽的工艺方法 - Google Patents

微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原多肽的工艺方法 Download PDF

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付学军
金海珠
由翠荣
王丹丹
张京楼
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本发明公开了一种微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原多肽的工艺方法，其特点是，利用从酒曲、纳豆、菌肥、海鱼肠道中提取的四种益生菌对鳕鱼皮进行混合菌发酵，利用益生菌产生蛋白酶、脂肪酶的作用水解鳕鱼皮蛋白，利用酵母菌的作用降低乃至去除鱼腥味，制备得到鳕鱼皮多肽；对鳕鱼皮的水解度可达50.65%，鱼腥味较轻微。

Description

微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原多肽的工艺方法
技术领域：
　　本发明涉及鳕鱼深加工技术领域，具体地讲是微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原多肽的工艺方法。
背景技术：
鱼品在加工的过程中，必然会产生大量的下脚料,(包括鱼头、鱼皮、鱼鳍、鱼尾、鱼骨及其残留鱼肉),其重量约占原料鱼的40%-55%。随着渔业的发展，水产品的综合利用也越来越引起人们的重视。鱼皮中胶原蛋白的含量最高可达蛋白质总量的80％以上，较鱼体其它部位高许多。除鸿巢章二等报道用鳕鱼皮制备明胶和酶解法制备蛋白多肽粉外，其它有关鱼皮胶原蛋白的制备和应用的文献报道较少。
目前制备鱼皮多肽多用酶解法，如东方海洋胶原蛋白多肽。但酶解法生产的多肽产品存在苦味大和口感差等缺点。
发明内容：
本发明的目的是克服上述已有技术的不足，而提供微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原多肽的工艺方法；主要解决现有的酶解法制备鱼皮多肽产品存在苦味大和口感差等问题。
本发明的技术方案是：微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原多肽的工艺方法，其特殊之处在于，包括如下工艺步骤：
a培养基：鳕鱼鱼皮加水，120-150℃高压蒸汽灭菌3s-30min，得基础发酵培养基，备用；
b样品的处理：纳豆、酒曲、醋曲的处理，将纳豆、酒曲、醋曲分别加入无菌生理盐水中，振荡10-20min，分别10倍梯度稀释，得纳豆、酒曲、醋曲样品稀释液；
c蛋白质高效降解菌的分离纯化：
1）具蛋白酶活性的细菌的分离，分别取稀释度10-5～10-7各种样品稀释液，涂布于脱脂牛奶培养基上，35-37℃培养24-48h；挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线2-3次并镜检获得纯种，挑取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面，培养后备用；
2）具蛋白酶活性的霉菌和酵母菌的分离，分别取稀释度10-3～10-5各种样品稀释液，分别涂布于马铃薯和YPD培养基上，28-30℃培养2-5d；挑取单菌落接种于培养基上，经2-3次平板划线并镜检获得纯种；纯化的菌株分别点种于脱脂牛奶培养基平板上，挑取透明圈直径与菌落直径之比大的菌落，霉菌接种于马铃薯培养基斜面，酵母菌接种于YPD培养基斜面，培养后备用；
d产脂肪酶细菌的分离纯化：分别取各种样品稀释液，涂布于脂肪酶筛选培养基上，35-37℃培养24-48h；挑取菌落周围具有白色沉淀圈的菌落，经2-3次平板划线并镜检确认为纯种，挑取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面，培养后备用；
e多菌种鳕鱼皮发酵工艺：微生物种子制备，将选取的菌种活化后接种至分别装有相应液体培养基的容器中，霉菌接种至装有马铃薯液体培养基的容器中，酵母菌接种至装有YPD液体培养基的容器中，细菌接种至装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的容器中；霉菌和酵母菌28-30℃，细菌35-37℃，160-210r/min摇床培养，制得种子液；将种子液按照一定的菌体个数比，接种于基础发酵培养基中，160-210r/min摇床培养30h，测定水解度；所述的种子液菌体个数比，细菌：霉菌：酵母菌约为2:1:1；
f水解度的测定：总蛋白含量的测定，采用微量凯氏定氮法；可溶性多肽含量的测定采用福林—酚法；水解度的测定，采用TCA（三氯乙酸）法；
水解度（DH）%=(N 2-N 1)/(N 0-N 1)，其中N 0为鱼皮的总蛋白，N 1为酶解反应前鱼皮蛋白中的TCA可溶性多肽，N 2为酶解液中的TCA可溶性多肽。
进一步的，所述的基础发酵培养基的料液比（W/V）为1:1.5，料液比为鱼皮：发酵液总体积比。
进一步的，e步骤所述的种子液接种量为8%。
进一步的，e步骤所述的发酵温度为30℃。
本发明所述的微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原多肽的工艺方法与已有技术相比具有突出的实质性特点和显著进步，1、采用微生物发酵鱼皮蛋白制备鱼皮多肽，通过控制发酵条件可将蛋白质降解成短肽，同时利用微生物使某些苦味物质进行转化，起到脱苦的作用，可以克服酶解法生产的多肽产品苦味大和口感差等缺点，既可提高鱼皮胶原蛋白多肽的得率并保证发酵过程中没有有害物质产生，还得到具有更好功能性的蛋白多肽；2、采用多菌种益生菌发酵，通过不同微生物的相互作用，可将鱼皮中的腥味物质分解，达到脱腥的目的，这是酶法生产的活性多肽不能达到的；3、利用水产品加工下脚料，提高产品的附加值，既能减少环境的污染，降低水产加工的成本，又可以促进水产加工废弃物的综合利用；4、鳕鱼皮的水解度可高达50.65%。
具体实施方式：
为了更好地理解与实施，下面结合实施例详细说明本发明；所举实施例仅用于解释本发明，并非用于限制本发明的范围。
分离微生物用培养基的制备：
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g， NaCl5 g，蒸馏水1000mL，pH7.2～7.4,琼脂20g，121℃ 高压蒸汽灭菌20min；
马铃薯培养基：马铃薯 200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL ，琼脂20g，pH自然，121℃ 高压蒸汽灭菌20min；
YPD培养基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂粉20g, 蒸馏水1000mL,121℃ 高压蒸汽灭菌20min；
脱脂牛奶培养基：A.牛奶5 g，蒸馏水50 mL；B.琼脂2g，蒸馏水50mL；将A、B分别115℃高压蒸汽灭菌30min，冷却至60℃混匀后倒平板；
脂肪酶筛选培养基：蛋白胨5g，CaCl 2 0.1g，酵母膏1g，Tween-80 10mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL，121℃ 高压蒸汽灭菌20 min。
实施例1，微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原多肽的工艺方法，步骤如下：
1、基础发酵培养基：鳕鱼鱼皮100g，蒸馏水50mL，121℃高压蒸汽灭菌20min，得基础发酵培养基，备用；
2、样品的处理：纳豆、酒曲、醋曲的处理，分别取市售纳豆、酒曲、醋曲1g，并分别加入99mL无菌生理盐水中，振荡15min，分别10倍梯度稀释，得纳豆、酒曲、醋曲的样品稀释液；
3、蛋白质高效降解菌的分离纯化：1）具蛋白酶活性的细菌的分离，分别取10-5～10-7各种样品稀释液100μL，涂布于脱脂牛奶培养基上，36℃培养36h；挑取透明圈直径与菌落直径之比大的单菌落，在牛肉膏蛋白胨培养基上平板划线，重复2-3次平板划线并镜检确定为纯种，挑取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面，培养后备用；2）具蛋白酶活性的霉菌和酵母菌的分离，分别取10-3～10-5各种样品稀释液100μ L，分别涂布于马铃薯和YPD培养基上，29℃培养3.5d；挑取单菌落，经2-3次平板划线并镜检确认为纯种；纯化的菌株分别点种于脱脂牛奶培养基平板上，挑取透明圈直径与菌落直径之比大的单菌落，霉菌接种于马铃薯培养基斜面，酵母菌接种于YPD培养基斜面，培养后备用；
4、产脂肪酶细菌的分离纯化：分别取10-5～10-7各种样品稀释液100μL，涂布于脂肪酶筛选培养基上，36℃培养36h；挑取菌落周围具有白色沉淀圈的单菌落，经2-3次平板划线并镜检确认为纯种，接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面，培养后备用；
5、多菌种鳕鱼皮发酵工艺：微生物种子制备，将选取的菌种活化后接种至装有100mL相应液体培养基的500mL的三角瓶中，霉菌接种至装有马铃薯液体培养基的三角瓶中，酵母菌接种至装有YPD液体培养基的三角瓶中，细菌接种至装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中；霉菌和酵母菌29℃，180r/min摇床培养，细菌36℃，180r/min摇床培养，分别制得种子液；将各菌株的种子液按照一定的菌体个数比，细菌：霉菌：酵母菌约为2:1:1，接种量8%，接种于基础发酵培养基中，基础发酵培养基的料液比（w/v）为1:1.5，180r/min摇床培养30h，发酵温度为30℃，测定水解度；
6、水解度的测定：总蛋白含量的测定，采用微量凯氏定氮法；可溶性多肽含量的测定采用福林—酚法；水解度的测定，采用TCA（三氯乙酸）法；
水解度（DH）%=(N 2-N 1)/(N 0-N 1)，其中N 0为鱼皮的总蛋白，N 1为酶解反应前鱼皮蛋白中的TCA可溶性多肽，N 2为酶解液中的TCA可溶性多肽。
关于上述实施例1的具蛋白酶和脂肪酶活性菌株的分离和纯化：从纳豆、酒曲和醋曲中共分离到170株具有蛋白酶和脂肪酶活力的微生物，其中细菌25株，霉菌25株，酵母菌120株。其中细菌BNⅣ-1, JF0Y3; 黑曲菌H-2；酵母菌JM白，具有较高产酶活性，4株微生物的菌落形态和产酶特性见表1。
实施例2，微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原多肽的工艺方法，步骤如下：
1、基础发酵培养基：鳕鱼鱼皮100g，蒸馏水50mL，120℃高压蒸汽灭菌30min，得基础发酵培养基，备用；
2、样品的处理：纳豆、酒曲、醋曲的处理，分别取市售纳豆、酒曲、醋曲1g，并分别加入99mL无菌生理盐水中，振荡10min，分别10倍梯度稀释，得纳豆、酒曲、醋曲的样品稀释液；
3、蛋白质高效降解菌的分离纯化：1）具蛋白酶活性的细菌的分离，分别取10-5～10-7各种样品稀释液100μL，涂布于脱脂牛奶培养基上，35℃培养48h；挑取透明圈直径与菌落直径之比大的单菌落，在牛肉膏蛋白胨培养基上平板划线，重复2-3次平板划线并镜检确定为纯种，挑取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面，培养后备用；2）具蛋白酶活性的霉菌和酵母菌的分离，分别取10-3～10-5各种样品稀释液100μ L，分别涂布于马铃薯和YPD培养基上，28℃培养5d；挑取单菌落，经2-3次平板划线并镜检确认为纯种；纯化的菌株分别点种于脱脂牛奶培养基平板上，挑取透明圈直径与菌落直径之比大的单菌落，霉菌接种于马铃薯培养基斜面，酵母菌接种于YPD培养基斜面，培养后备用；
4、产脂肪酶细菌的分离纯化：分别取10-5～10-7各种样品稀释液100μL，涂布于脂肪酶筛选培养基上，35℃培养48h；挑取菌落周围具有白色沉淀圈的单菌落，经2-3次平板划线并镜检确认为纯种，接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面，培养后备用；
5、多菌种鳕鱼皮发酵工艺：微生物种子制备，将选取的菌种活化后接种至装有100mL相应液体培养基的500mL的三角瓶中，霉菌接种至装有马铃薯液体培养基的三角瓶中，酵母菌接种至装有YPD液体培养基的三角瓶中，细菌接种至装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中；霉菌和酵母菌28℃，210r/min摇床培养，细菌35℃，210r/min摇床培养，分别制得种子液；将各菌株的种子液按照一定的菌体个数比，细菌：霉菌：酵母菌约为2:1:1，接种量8%，接种于基础发酵培养基中，基础发酵培养基中的料液比（w/v）为1:1.5，160r/min摇床培养30h，发酵温度为30℃，测定水解度；
6、水解度的测定：总蛋白含量的测定，采用微量凯氏定氮法；可溶性多肽含量的测定采用福林—酚法；水解度的测定，采用TCA（三氯乙酸）法；
水解度（DH）%=(N 2-N 1)/(N 0-N 1)，其中N 0为鱼皮的总蛋白，N 1为酶解反应前鱼皮蛋白中的TCA可溶性多肽，N 2为酶解液中的TCA可溶性多肽。
实施例3，微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原多肽的工艺方法，步骤如下：
1、基础发酵培养基：鳕鱼鱼皮100g，蒸馏水50mL，150℃高压蒸汽灭菌3s，得基础发酵培养基，备用；
2、样品的处理：纳豆、酒曲、醋曲的处理，分别取市售纳豆、酒曲、醋曲1g，并分别加入99mL无菌生理盐水中，振荡20min，分别10倍梯度稀释，得纳豆、酒曲、醋曲的样品稀释液；
3、蛋白质高效降解菌的分离纯化：1）具蛋白酶活性的细菌的分离，分别取10-5～10-7各种样品稀释液100μL，涂布于脱脂牛奶培养基上，37℃培养24h；挑取透明圈直径与菌落直径之比大的单菌落，在牛肉膏蛋白胨培养基上平板划线，重复2-3次平板划线并镜检确定为纯种，挑取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面，培养后备用；2）具蛋白酶活性的霉菌和酵母菌的分离，分别取10-3～10-5各种样品稀释液100μ L，分别涂布于马铃薯和YPD培养基上，30℃培养2d；挑取单菌落，经2-3次平板划线并镜检确认为纯种；纯化的菌株分别点种于脱脂牛奶培养基平板上，挑取透明圈直径与菌落直径之比大的单菌落，霉菌接种于马铃薯培养基斜面，酵母菌接种于YPD培养基斜面，培养后备用；
4、产脂肪酶细菌的分离纯化：分别取10-5～10-7各种样品稀释液100μL，涂布于脂肪酶筛选培养基上，37℃培养24h；挑取菌落周围具有白色沉淀圈的单菌落，经2-3次平板划线并镜检确认为纯种，接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面，培养后备用；
5、多菌种鳕鱼皮发酵工艺：微生物种子制备，将选取的菌种活化后接种至分别装有100mL相应液体培养基的500mL的三角瓶中，霉菌接种至装有马铃薯液体培养基的三角瓶中，酵母菌接种至装有YPD液体培养基的三角瓶中，细菌接种至装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中；霉菌和酵母菌30℃，160r/min摇床培养，细菌37℃，160r/min摇床培养，分别制得种子液；将各菌株的种子液按照一定的菌体个数比，细菌：霉菌：酵母菌约为2:1:1，接种量8%，接种于基础发酵培养基中，基础发酵培养基中的料液比（w/v）为1:1.5，210r/min摇床培养30h，发酵温度为30℃，测定水解度；
6、水解度的测定：总蛋白含量的测定，采用微量凯氏定氮法；可溶性多肽含量的测定采用福林—酚法；水解度的测定，采用TCA（三氯乙酸）法；
水解度（DH）%=(N 2-N 1)/(N 0-N 1)，其中N 0为鱼皮的总蛋白，N 1为酶解反应前鱼皮蛋白中的TCA可溶性多肽，N 2为酶解液中的TCA可溶性多肽。

Claims (4)

1.微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原多肽的工艺方法，其特征在于，包括如下工艺步骤：
a培养基：鳕鱼鱼皮加水，120-150℃高压蒸汽灭菌3s-30min，得基础发酵培养基，备用；
b样品的处理：纳豆、酒曲、醋曲的处理，将纳豆、酒曲、醋曲分别加入无菌生理盐水中，振荡10-20min，分别10倍梯度稀释，得纳豆、酒曲、醋曲样品稀释液；
c蛋白质高效降解菌的分离纯化：
1）具蛋白酶活性的细菌的分离，分别取稀释度10-5～10-7各种样品稀释液，涂布于脱脂牛奶培养基上，35-37℃培养24-48h；挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线2-3次并镜检获得纯种，挑取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面，培养后备用；
2）具蛋白酶活性的霉菌和酵母菌的分离，分别取稀释度10-3～10-5各种样品稀释液，分别涂布于马铃薯和YPD培养基上，28-30℃培养2-5d；挑取单菌落接种于培养基上，经2-3次平板划线并镜检获得纯种；纯化的菌株分别点种于脱脂牛奶培养基平板上，挑取透明圈直径与菌落直径之比大的菌落，霉菌接种于马铃薯培养基斜面，酵母菌接种于YPD培养基斜面，培养后备用；
d产脂肪酶细菌的分离纯化：分别取各种样品稀释液，涂布于脂肪酶筛选培养基上，35-37℃培养24-48h；挑取菌落周围具有白色沉淀圈的菌落，经2-3次平板划线并镜检确认为纯种，挑取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面，培养后备用；
e多菌种鳕鱼皮发酵工艺：微生物种子制备，将选取的菌种活化后接种至分别装有相应液体培养基的容器中，霉菌接种至装有马铃薯液体培养基的容器中，酵母菌接种至装有YPD液体培养基的容器中，细菌接种至装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的容器中；霉菌和酵母菌28-30℃，细菌35-37℃，160-210r/min摇床培养，制得种子液；将种子液按照一定的菌体个数比，接种于基础发酵培养基中，160-210r/min摇床培养30h，测定水解度；所述的种子液菌体个数比，细菌：霉菌：酵母菌约为2:1:1；
f水解度的测定：总蛋白含量的测定，采用微量凯氏定氮法；可溶性多肽含量的测定采用福林—酚法；水解度的测定，采用TCA（三氯乙酸）法；
水解度（DH）%=(N 2-N 1)/(N 0-N 1)，其中N 0为鱼皮的总蛋白，N 1为酶解反应前鱼皮蛋白中的TCA可溶性多肽，N 2为酶解液中的TCA可溶性多肽。
2.根据权利要求1所述的微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原多肽的工艺方法，其特征在于，所述的基础发酵培养基的料液比（W/V）为1:1.5，料液比为鱼皮：发酵液总体积比。
3.根据权利要求1所述的微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原多肽的工艺方法，其特征在于，e步骤所述的种子液接种量为8%。
4.根据权利要求1或2或3所述的微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原多肽的工艺方法，其特征在于，e步骤所述的发酵温度为30℃。
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