CN114480533A - 一种复合菌发酵法制备鱼骨多肽的方法及发酵液 - Google Patents

Abstract

本发明属于鱼骨发酵技术领域，公开了一种复合菌发酵法制备鱼骨多肽的方法及发酵液。本发明以鲑鱼骨作为研究对象，首先考察不同芽孢杆菌、酵母菌、霉菌对鱼骨蛋白肽转化率的影响，进而研究复合菌株发酵对制备鱼骨多肽影响，并优化其发酵条件，筛选出鱼骨肽抗氧化活性最高的发酵方法，以此条件制备的发酵液多肽转化率为71.86％，具有强抗氧化能力。

Description

一种复合菌发酵法制备鱼骨多肽的方法及发酵液

技术领域

本发明属于鱼骨发酵技术领域，具体涉及一种复合菌发酵法制备鱼骨多肽的方法及发酵液。

背景技术

在鱼类水产品加工过程中，会产生大量的鱼类废弃物，如鱼骨、鱼头、鱼鳍、鱼皮和鱼内脏等，这些废弃物的重量约占原料鱼的40％～50％，其中鱼骨占废弃物总量的70％左右。废弃的鱼骨中不仅含有大量钙元素，同时鱼骨中蛋白质的含量可达干物质重量的30％～50％。

鲑鱼具有很高的营养价值且口感好，是最受欢迎的食用鱼品种之一。全球每年鲑鱼产量达到260多万吨，鲑鱼加工过程中产生的鲑鱼骨富含多肽，其分解后可产生多种低聚肽、小肽和氨基酸。研究表明，鱼骨蛋白水解物具有抗氧化、抗高血压、抗微生物和抗贫血性等功能。因此，开发鱼骨类蛋白质产品，不仅可以提高鱼类加工的利用率，开发鱼类加工高附加值产品，且对保护生态环境具有重要的积极意义，也可以促进我国水产养殖业和渔业的发展可持续健康发展。

微生物发酵制备多肽是近年来多肽制备工艺的研究热点，针对不同的发酵原料，微生物发酵多肽的含量和活性不同。目前利用微生物发酵法制备鱼骨多肽的研究，多采用单菌发酵或酶解-发酵结合方法，应用复合菌发酵法制备鱼骨多肽的研究鲜见报道，对不同分子量范围的鱼骨肽抗氧化活性的研究也较少。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明以鲑鱼骨作为研究对象，首先考察不同芽孢杆菌、酵母菌、霉菌对鱼骨蛋白肽转化率的影响，进而研究复合菌株发酵对制备鱼骨多肽影响，并优化其发酵条件，筛选出鱼骨肽抗氧化活性最高的发酵方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种复合菌发酵法制备鱼骨多肽的方法，包括如下步骤：

步骤S1：鱼骨粉的制备

将附着部分鱼肉的鲑鱼骨，50℃低温蒸2h后，将鲑鱼骨分成4～5cm的小段，剔除鲑鱼骨表面的鱼肉，将去肉的鲑鱼骨进行低温烘干，温度为50℃，时间为6h，用粉碎机进行粉碎，制备成鲑鱼骨粉，-20℃保存备用，在每次使用前烘干；

步骤S2：菌种的活化

细菌培养基LB液体培养基，主要含有胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，酵母菌YPD液体培养基，主要含有葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，两种培养基在121℃，灭菌20min后，将枯草芽孢杆菌接种于细菌培养基LB液体培养基，放入37℃的恒温箱中培养72h后，制备菌体悬液备用；将面包酵母接种于酵母菌YPD液体培养基，放入25℃的恒温箱培养72h，制备孢子悬液备用；

步骤S3：鱼骨发酵培养基的制备

按照料液比1:2添加鱼骨粉和蒸馏水，混合均匀；

步骤S4：分别将步骤S2中的菌体悬液和孢子悬液按照菌种比例1:1混合，将混合菌液按接种量7％接入步骤S3鱼骨发酵培养基中，在32℃的温度条件下发酵，发酵时间168h后制得发酵液。

进一步的，所述步骤S1制备成鲑鱼骨粉后过60目筛子。

进一步的，所述步骤S1在鲑鱼骨粉每次使用前50℃烘干30min。

进一步的，所述步骤S2枯草芽孢杆菌菌体悬液中细菌浓度为10⁸CFU/mL。

进一步的，所述步骤S2面包酵母菌孢子悬液中酵母菌浓度为10⁸CFU/mL。

一种含有鱼骨多肽的发酵液，由枯草芽孢杆菌和面包酵母菌混合菌发酵制备而成。

进一步的，所述发酵液按步骤S1-S4的方法制备。

本发明与现有技术相比的有益效果是：

为了检验复合菌株发酵制备鱼骨多肽优化工艺的可靠性，在结合实际生产的前提下，按照响应面法优化条件，将反应体系条件简化为温度32℃，菌种比例1:1，料液比1:2，发酵时间168h，接种量7％，进行发酵验证实验，进行3次平行实验，得到多肽转化率为71.86％。与理论最大值的相对误差为3.85％，说明所建模型准确性和可靠性较好。因此，该模型能较好的拟合复合微生物发酵制备鲑鱼骨多肽的发酵工艺。

优化了枯草芽孢杆菌和面包酵母菌复合发酵制备鲑鱼骨多肽的工艺条件为温度32℃，菌种比例1:1，料液比1:2，发酵时间168h，接种量7％。此条件下多肽转化率为71.86％。

不同菌株鱼骨发酵液在不同分子量范围的样品对DPPH自由基、O₂ ^-·自由基清除能力。结果表明，具有强抗氧化能力的鱼骨肽集中在分子量＜3kDa组，其中复合微生物发酵制备的鲑鱼骨多肽清除O₂ ^-·自由基能力最弱，IC₅₀值为0.21mg/mL；其次是清除DPPH自由基，IC₅₀值为0.11mg/mL；清除OH·自由基的能力最强，IC₅₀值为0.0078mg/mL。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1为不同菌株发酵48h后对鱼骨多肽转化率的影响，12种菌分别为：面包酵母Saccharomyces cerevisiae A1，酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae B1，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，维尔兹芽孢杆菌Bacillusvelezensis，枯萎芽孢杆菌Bacillus atrophaeus，红曲霉Monascus anka NakazawaetSato，植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，米曲霉Aspergillus oryzae，红曲霉Monacus anka，根霉Rhizopus oryzae、毛霉Mucormucedo，CK：空白对照组；

图2为不同发酵时间对多肽转化率的影响；

图3为枯草芽孢杆菌和面包酵母菌不同混合比例对多肽转化率影响；

图4为不同料液比对多肽转化率影响；

图5为不同发酵温度对多肽转化率影响；

图6为不同接种量对多肽转化率影响。

具体实施方式

下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。

实验菌种：

以下菌株均为已知菌种，商业途径可得，分别购于中国微生物菌种保藏中心和中国农业微生物菌种管理中心：

芽孢杆菌类：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis YP1501、凝结芽孢杆菌Bacilluscoagulans、维尔兹芽孢杆菌Bacillus velezensis、枯萎芽孢杆菌Bacillus atrophaeus；乳酸菌类：嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus、植物乳杆菌Lactobacillusplantarum；酵母菌：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、霉菌：米根霉Rhizopus oryzae、大毛霉Mucor mucedo米曲霉Aspergillus oryzae，红曲霉Monascusanka；面包酵母Saccharomyces cerevisiae购于安琪酵母股份有限公司经菌种鉴定获得。

实施例1

1.鱼骨粉的制备

将附着部分鱼肉的鲑鱼骨，50℃低温蒸2h后，将鲑鱼骨分成4～5cm的小段，剔除鲑鱼骨表面的鱼肉。将去肉的鲑鱼骨进行50℃，6h的低温烘干，用粉碎机少量多次的进行粉碎，制备成鲑鱼骨粉，过60目筛子，-20℃保存备用，在每次使用前50℃烘干30min。

2.菌种的活化及培养基

细菌培养基为LB液体培养基，含有胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 5g/L，酵母菌培养基为YPD液体培养基，含有葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L，霉菌培养基为PDA培养基，含有葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L，琼脂粉17g，鲑鱼鱼骨发酵培养基，按照一定料液比添加鱼骨粉和蒸馏水，混合均匀，所有培养基均在121℃，灭菌20min备用。分别将各种微生物接种于相应的培养基中，霉菌和酵母菌放入25℃的恒温箱培养72h，细菌放入37℃的恒温箱中培养72h后，制备相应的菌体/孢子悬液备用，霉菌孢子浓度为10⁶CFU/mL，细菌浓度为10⁸CFU/mL，酵母菌浓度为10⁸CFU/mL。

3.鱼骨的基本成分分析

鱼骨中水分、蛋白质含量、粗脂肪、灰分的测定分别采用GB 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中的直接干燥法、凯氏定氮法、索氏抽提法、马弗炉灼烧法。

鱼骨多肽含量的测定采用福林-酚法。以未接菌的鱼骨培养基的水提取物为对照。取1mL鱼骨粉发酵样品，加入5mL福林酚甲试剂，立即摇匀，30℃水浴保温10min。加入福林酚乙0.5mL，立即摇匀，30℃水浴30min，测A₆₅₀值。分别按公式2.1和2.2计算鱼骨多肽含量以及多肽转化率

式中，X：从标准曲线中算出相对应的蛋白含量，μg；n：稀释倍数，m：鲑鱼骨重量，g

可溶性蛋白含量，根据公式2.2计算可溶性蛋白提取率。

鲑鱼鱼皮的基础营养测定结果见表1。由此可知，鱼骨中除了水分外，还含有大量的蛋白质，粗蛋白含量为33.49±0.59g/100g。

表1鲑鱼骨基础物质组成(g/100g)

4.单菌株发酵

分别将12株细菌、酵母菌和霉菌按照料液比1:2接入鱼骨发酵培养基中，在基础发酵条件：接种量3％，发酵温度28℃，转速50r/min，发酵时间48h下进行发酵，并测定发酵产物中多肽含量，以筛选制备鱼骨多肽的优异发酵菌株。每个实验设3次重复。发酵结束后，将各处理的发酵液经4℃、8000r/min离心20min后，取其上清液，分别测定鱼骨多肽含量。实验重复3次。

采用基础发酵条件发酵鲑鱼骨，考察12株菌对鱼骨多肽转化率的影响，结果见图1。鱼骨经不同菌株发酵后，多肽转化率均高于对照组。其中，枯草芽孢杆菌发酵产物中鱼骨多肽含量最高，为22.06g/100g，多肽转化率为69.03％。其次是是凝结芽孢杆菌和枯萎芽孢杆菌，且多肽转化率均超过60％，植物乳杆菌的多肽转化率也较高，为56.35％。在酵母菌中，面包酵母菌的多肽含量较高，达到14.14g/100g，多肽转化率达到35.77％。鉴于酵母菌具有较好的脱腥作用，发酵过程中酵母菌产生的醛脱氢酶、醇脱氢酶能将鱼肉中有腥味的醛类分别转化成无腥味的酸类和醇类；同时考虑不同菌株的产酶特点，如枯草芽孢杆菌可产中性蛋白酶，植物乳杆菌存在寡肽运输酶可以将寡肽水解为短肽或游离氨基酸，因此，实验选择了枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和面包酵母菌作为下一步复合菌株制备鱼骨多肽的发酵菌株。

5.不同发酵方式对鱼骨多肽转化率的影响

在获得优异发酵菌株的基础上，选取多肽转化率较高的2～3株菌，在基础发酵条件下进行混菌发酵和分步混菌发酵。混菌发酵为选取2种菌组合，按照等比例同时接种于鱼骨发酵培养基中发酵。分步混菌发酵是在第一种菌接种24h后，接种第二种菌再发酵24h后，测定发酵产物中鱼骨多肽的转化率，确定最优混菌组合和最适发酵方式。每个实验设3次重复。

实验研究了枯草芽孢杆菌，植物乳杆菌和面包酵母菌进行混菌同步发酵与分步发酵对鱼骨多肽转化率的影响，结果如表2。不论混菌同步发酵还是分步发酵，均能明显提高鱼骨多肽的转化率，其中，同步发酵的组合2，即面包酵母菌+枯草芽孢杆菌的复合菌发酵的多肽转化率最高，达到68.29±0.83％。故选用组合2进行后续发酵实验。

表2混菌不同发酵方式对鱼骨多肽转化率影响

6.混菌发酵条件的优化

以上述筛选的混合发酵菌种作为发酵条件优化菌种，与上述同样的培养条件和发酵液处理方式收集发酵液上清液，测定上清液中鱼骨多肽含量，确定最佳菌种比例、料液比、接种量、发酵时间和发酵温度。菌种比例包括：枯草芽苞杆菌：面包酵母菌分别为1:1、1:1.5、1.5:1、1:2、2:1，料液比包括：鱼骨：水分别为1:1、1:1.5、1:2和1:2.5的比例，接种量分别为：1.0％、3.0％、5.0％、7.0％和9.0％，发酵温度分别为24℃、28℃、32℃、36℃，发酵时间是在开始发酵后的24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h取样测定鱼骨多肽含量。

(1)发酵时间对多肽转化率的影响

在料液比为1:2的鱼骨培养基中，枯草芽孢杆菌和面包酵母菌按1:1比例和3％混合接种量，在50r/min，28℃连续发酵216h，多肽转化率如图2所示。多肽转化率随时间的增加呈增加趋势，在168h趋于平缓，综合考虑发酵成本和多肽转化率，选择发酵时间为168h。

(2)菌株不同混合比例对多肽转化率的影响

根据图3可知，两株菌不同的混合比例对鱼骨多肽转化率影响显著，5种混合比例对多肽转化率间存在显著差异(P＜0.05)，当混合比例为枯草芽孢杆菌：面包酵母菌1:1和1.5:1时，差异最显著，但混合比例1.5:1时多肽含量最高，为21.75g/100g，多肽转化率为58.47％。因此选择菌株混合比例为枯草芽孢杆菌：面包酵母菌＝1.5:1进行后续实验。

(3)不同料液比对多肽转化率的影响

发酵培养基料液比不同，将影响培养基的粘度和通气性，进而影响微生物的生长和代谢。不同料液比对多肽转化率影响如图4。不同料液比对多肽转化率有一定影响，但各组间差异性不显著(P＜0.05)。当料液比为1:1.5时，多肽转化率达到66.81％，此时多肽含量为24.54g/100g。因此，选择料液比为1:1.5进行后续实验。

(4)不同发酵温度对多肽转化率的影响

根据图5可知，不同温度对多肽转化率影响显著(P＜0.05)，在24℃和28℃时发酵对多肽转化率无显著差异。但发酵温度为28℃时，发酵液中多肽含量最高，为21.27g/100g，多肽转化率为57.04％。因此，选择发酵温度为28℃进行实验。

(5)接种量对多肽转化率的影响

由图6可知，多肽转化率随接种量的增加而增大，在接种量达到7％时趋于平缓，因此，选择接种量为7％进行后续实验。

7.响应面实验优化实验

在单因素实验确定最佳发酵条件的基础上，利用响应面法进行鲑鱼骨发酵条件优化以鱼骨多肽含量作为评价对象，采用Box-Behnken实验设计5因素3水平优化试验，并对实验结果采用Design Expert软件进行结果分析，确定最佳发酵条件。同时，在确定的最优条件下进行验证实验。

在单因素优化的基础上，利用响应面实验进一步优化鱼骨多肽的最佳发酵条件。实验设计了5因素3水平实验，针对温度(A)即24℃、28℃和32℃，菌种比例(B)即枯草芽孢杆菌：面包酵母菌混合比例分别为1:1、1.5:1和2:1，料液比(C)分别为1:1、1::1.5和1:2、时间(D)120h、144h和168h，接种量(E)分别为3％，5％和7％，共得到46个实验组。运用Design-Expert8.0.6程序软件进行方差分析，结果见表3。

表3回归方程方差分析表

注：R²＝0.9371，R² _Adj＝0.8868，**表示极显著(P<0.01)；*表示显著(P<0.05)

由表3可知，该模型F＝18.62，P＜0.0001，表现为极显著，说明与实际情况拟合良好。失拟项P＞0.05，表示不显著，说明未知因素对实验结果干扰小，模型选择的恰当。该模型决定系数R²＝0.9371，较好的反映了温度、菌种比例、料液比、时间和接种量之间的相互作用关系，可以用来预测5个因素对复合菌株发酵制备鲑鱼骨多肽的影响。拟合方程为：Y＝67.68-0.16A+1.44B+5.81C-0.23D+4.50E-1.24AB+4.55AC-0.54AD-0.24AE-1.11BC-0.89BD+0.68BE+2.85CD-0.95CE+0.075DE-1.53A²-0.39B²-5.12C²-1.43D²-0.28E²。由一次项偏向回归系数的绝对值可知，5个因素对鲑鱼骨发酵液多肽转化率影响的大小依次为：料液比＞接种量＞菌种比例＞时间＞温度，并且存在着因素的二次关系和不同因素之间交互关系。对回归模型进行分析，求得最佳的发酵条件为：温度32℃、菌种比例1:1，料液比1:2，发酵时间168h，接种量7％时，理论上多肽转化率为75.71％。

为了检验复合菌株发酵制备鱼骨多肽优化工艺的可靠性，在结合实际生产的前提下，按照响应面法优化条件，将反应体系条件简化为温度32℃，菌种比例1:1，料液比1:2，发酵时间168h，接种量7％，进行发酵验证实验，进行3次平行实验，得到多肽转化率为71.86％。与理论最大值的相对误差为3.85％，说明所建模型准确性和可靠性较好。因此，该模型能较好的拟合复合微生物发酵制备鲑鱼骨多肽的发酵工艺。

实施例2鲑鱼皮发酵产品的抗氧化性能分析

1.不同分子量范围的鲑鱼皮蛋白肽制备

鲑鱼骨干粉经过发酵后，将发酵液按照体积比2:1加入10％三氯乙酸，4℃，6000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液经0.45μm滤膜初步过滤，去除其中未水解完全的鲑鱼骨蛋白等杂质后，再采用截留分子量分别为3kDa和10kDa的超滤离心管依次对样品液进行分级超滤，获得分子量范围分别为<3kDa，3-10kDa以及10kDa以上的截留液，分别依次标记为CSPI、CSP II和CSP III三组样品。以不接菌的鱼骨培养基水提取物作对照。

复合菌株发酵样品原始发酵液中多肽产率高于单菌发酵和对照组。各处理发酵样品经超滤离心分段分离，所得分子量＜3kDa、3kDa-10kDa和＞10kDa的3个部分多肽浓度结果见表4。复合菌株发酵液＜3kDa和＞10kDa的多肽浓度最高，其次为枯草芽孢杆菌发酵液。复合菌株发酵液中浓度最高，为1.68±0.40mg/mL。枯草芽孢杆菌发酵液中分子量＜3kDa的小分子肽组分浓度其次，为1.46±0.75mg/mL。

表4各分子量范围多肽浓度

2.不同分子量鱼骨肽对DPPH自由基清除活性评价

空白对照组A₀：取2mL不同分子量的截留液与混匀。样液组A_X：加入2mL不同分子量的鱼皮蛋白肽截留液与2mL DPPH溶液充分混匀。分别以95％乙醇代替DPPH溶液A₀和以蒸馏水代替截留液A_x0为对照，DPPH自由基清除率计算公式如下。实验重复三次。比较不同组分的IC₅₀值(半数清除率浓度)，IC₅₀值为自由基清除率为50％时所需要的样品浓度为参比，IC₅₀值越低，则表示自由基的清除率越高，抗氧化性能越强。

由表5可以看出，相比不同菌株发酵液，多肽样品对DPPH自由基清除率均有所提高，IC₅₀值均下降，表明抗氧化能力均有所提高。不同处理后、不同分子量范围鲑鱼骨多肽样品对DPPH自由基清除率的IC₅₀值差异显著，其中，鱼骨多肽样品分子量＜3kDa组的IC₅₀值最小，表明具有更强清除DPPH自由基的多肽主要集中于＜3kDa的分子量内。同时由表5可以看出，鱼骨多肽相对于鱼骨发酵液对DPPH自由基清除率的IC₅₀值差异较大。以分子量＜3kDa中复合菌株发酵样品为例，鱼骨多肽的IC₅₀值0.11mg/mL小于单菌发酵的IC₅₀值，其对DPPH自由基清除能力显著高于单菌发酵。虽然复合菌株发酵样品中各分子量的IC₅₀值高于对照的IC₅₀值，但鱼骨发酵后其多肽的产率远高于对照，综合分析，混合菌株发酵后其DPPH自由基清除率仍高于对照。

表5不同鱼骨多肽样品清除DPPH自由基的IC₅₀

3.不同分子量鱼骨肽对羟自由基清除活性评价

采用水杨酸法对鱼骨肽的羟自由基清除率进行测定。样液组A_X：先加入2mL2mmol/L FeSO₄、2mL 1mmol/L H₂O₂，再加入0.5mL不同分子量的鱼皮蛋白肽，充分混匀后最后加入2mL 6mmol/L水杨酸再次混匀。于37℃水浴锅中水浴加热反应15min，在510nm处测定吸光值，分别以不添加H₂O₂A_X0和以蒸馏水代替截留液A₀为对照，根据下列公式计算其羟自由基清除率，比较不同组分的IC₅₀值，实验重复三次。

根据表6可知，不同处理且不同分子量范围样品对O₂ ^-·自由基清除率的IC₅₀值差异显著。鱼骨多肽样品分子量＜3kDa组的IC₅₀值最小，其次是分子量3kDa-10kDa组，表明具有更强清除O₂ ^-·自由基的鱼骨肽主要集中于＜3kDa和3kDa-10kDa的分子量范围内。其中，分子量＜3kDa组中复合菌株发酵鱼骨多肽样品清除O₂ ^-·自由基的IC₅₀值最小，为0.21mg/mL，具有最强清除O₂ ^-·自由基的能力。根据表6的数据可以看出，复合菌株发酵的鱼骨发酵液各分子量样品的IC₅₀值为0.21mg/mL，小于单菌的枯草芽孢杆菌，高于对照和单菌的面包酵母，但复合菌株各分子量的多肽产率远高于对照和单菌的面包酵母。综合分析，复合菌株清除O₂ ^-·自由基的能力最好。

表6不同鱼骨多肽样品清除O₂ ^-·自由基的IC₅₀

4.不同分子量鱼骨肽对超氧阴离子自由基活性评价

对鱼骨肽的超氧阴离子自由基清除率进行测定。样液组A1：取截留液0.1mL，加入2.8mLpH为8.2的50mmol/LTris-HCl充分混匀，进行25℃水浴反应10min，最后加入0.1mL3mmol/L的25℃水浴预热好的焦性没食子酸溶液。放置反应4min后立即在320nm处测吸光值。分别以蒸馏水代替截留液A2，HCl代替焦性没食子酸溶液A3为对照，根据下列公式计算出超氧阴离子自由基清除率，比较不同组分的IC₅₀值，实验重复3次。

根据表7可知，不同菌株发酵液经三氯乙酸沉淀去除蛋白后的鲑鱼骨多肽对OH·自由基表现出来极强的清除能力，具有极强的抗氧化性。其中样品分子量＜3kDa组的IC₅₀值最小，清除OH·自由基能力最强；分子量为＞10kDa组的IC₅₀值最大，清除OH·自由基的能力最弱。在分子量＜3kDa组中，微生物复合发酵制备的鲑鱼骨多肽的IC₅₀值仅仅为0.78×10^-2，低于枯草芽孢杆菌发酵制备鲑鱼骨多肽和面包酵母菌发酵制备鲑鱼骨多肽的IC₅₀值3.84×10^-2和1.66×10^-2的5倍和2倍，具有极强的清除OH·自由基的能力和极强的抗氧化性。

表7不同鱼骨多肽样品清除OH·自由基的IC₅₀

以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (7)

1.一种复合菌发酵法制备鱼骨多肽的方法，其特征是，包括如下步骤：

步骤S1：鱼骨粉的制备

将附着部分鱼肉的鲑鱼骨，50℃低温蒸2h后，将鲑鱼骨分成4～5cm的小段，剔除鲑鱼骨表面的鱼肉，将去肉的鲑鱼骨进行低温烘干，温度为50℃，时间为6h，用粉碎机进行粉碎，制备成鲑鱼骨粉，-20℃保存备用，在每次使用前烘干；

步骤S2：菌种的活化

细菌培养基LB液体培养基，主要含有胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，酵母菌YPD液体培养基，主要含有葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，两种培养基在121℃，灭菌20min后，将枯草芽孢杆菌接种于细菌培养基LB液体培养基，放入37℃的恒温箱中培养72h后，制备菌体悬液备用；将面包酵母接种于酵母菌YPD液体培养基，放入25℃的恒温箱培养72h，制备孢子悬液备用；

步骤S3：鱼骨发酵培养基的制备

按照料液比1:2添加鱼骨粉和蒸馏水，混合均匀；

步骤S4：分别将步骤S2中的菌体悬液和孢子悬液按照菌种比例1:1混合，将混合菌液按接种量7％接入步骤S3鱼骨发酵培养基中，在32℃的温度条件下发酵，发酵时间168h后制得发酵液。

2.如权利要求1所述的一种复合菌发酵法制备鱼骨多肽的方法，其特征是，所述步骤S1制备成鲑鱼骨粉后过60目筛子。

3.如权利要求1所述的一种复合菌发酵法制备鱼骨多肽的方法，其特征是，所述步骤S1在鲑鱼骨粉每次使用前50℃烘干30min。

4.如权利要求1所述的一种复合菌发酵法制备鱼骨多肽的方法，其特征是，所述步骤S2枯草芽孢杆菌菌体悬液中细菌浓度为10⁸CFU/mL。

5.如权利要求1所述的一种复合菌发酵法制备鱼骨多肽的方法，其特征是，所述步骤S2面包酵母菌孢子悬液中酵母菌浓度为10⁸CFU/mL。

6.一种含有鱼骨多肽的发酵液，其特征是，由枯草芽孢杆菌和面包酵母菌混合菌发酵制备而成。

7.如权利要求6所述的一种含有鱼骨多肽的发酵液，其特征是，所述发酵液按步骤S1-S4的方法制备。

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