CN110669814A - 一种具有降血压活性的小麦蛋白肽及其制备方法 - Google Patents
一种具有降血压活性的小麦蛋白肽及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种具有降血压活性的小麦蛋白肽及其制备方法。包括：使用电解水预处理小麦谷朊粉，配制小麦谷朊粉混悬液，碱性蛋白酶和铜绿假单胞菌来源蛋白酶分步酶解，过滤、浓缩和喷雾干燥。利用本发明方法可制得低分子量小麦肽，蛋白回收率65％以上，分子量小于1000Da的部分占95％以上；本发明方法降血压肽转化率高，经体外活性测定，体外ACE半抑制浓度为0.21mg/mL；还具有良好的胃肠消化稳定性；从此方法制备的小麦肽中分离鉴定到两条新型高ACE抑制活性肽段(SAGGYIW、APATPSFW)，体外ACE半抑制浓度分别为2.65μM和41.1μM。
Description
技术领域
本发明属于食品加工领域，具体涉及一种具有降血压活性的小麦蛋白肽及其制备方法以及其在制备降血压食品或药物中的应用。
背景技术
生物活性肽一般由2-20个氨基酸组成，通过生物酶解技术从蛋白母体中释放出来(Moller et al.European Journal of Nutrition,2008,47:171-182)。目前很多研究已经证明，生物活性肽具有低抗原特性，较母体蛋白易吸收，且具有各种各样的生理调节活性，包括抗菌活性、抗血栓活性、降血压活性、抗氧化活性和免疫调节活性等。生物活性肽来源于食物蛋白，较传统药物具有低诱导耐药性，被认为是传统药物的替代品。已经有很多生物活性肽被食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗药品，美国、欧洲和日本市场上大约有100种多肽药物(Barbara et al.Biotechnology Advances,2018,36:415-429)。Bradykinin(缓激肽，RPPGFSPFR)，它是体内一种自然产生的激素，能够控制血压，已经被FDA批准用于治疗高血压。肽类药物产品的全球年销售额估计为150亿至200亿美元，肽类产品为公众提供必要的药物方面发挥着重要的作用。在日本和欧洲，有很多基于降血压活性肽的食品，日本的calpis公司开发的降血压系列酸奶，经乳酸菌发酵后内含VPP和IPP两种活性肽，具有降血压效果。芬兰最大的乳制品生产厂家瓦利奥公司也一直致力于降血压乳制品的研发。
小麦谷朊粉是小麦淀粉加工后从麦麸中提取的副产物，其蛋白质含量在75％以上，且氨基酸组成比较齐全，钙、磷、铁等矿物质含量较高，是营养丰富、物美价廉的植物性蛋白源。谷朊粉含有约80％的麦胶蛋白和麦谷蛋白，这两种蛋白相互作用从而形成致密的网络结构。这种结构有利于小麦面粉的增筋作用，能够有效提高面粉品质和可加工性。然而，小麦谷朊粉的这种性质导致其溶解度差；另一方面，小麦谷朊粉富含脯氨酸，脯氨酸是唯一一个氨基酸侧链连接在蛋白质α-氨基组主链上的氨基酸，从而导致蛋白酶水解位点被包裹在蛋白质内部，对蛋白酶水解作用具有抗性(Colgrave et al.Food Chemistry,2017,234:389-397.)。这些原因，限制了小麦谷朊粉用于食品添加剂以及生物活性肽原料的潜力。
目前已经有很多生物活性肽从各种植物蛋白、肉类蛋白和奶源蛋白中鉴定出来。在现如今全球粮食危机的情况下，直接从人类的食物蛋白中获取生物活性肽是不可持续的(Ejike et al.Tends in Food Science&Technology,2017,59:30-36)。因此，需要选择合适的蛋白资源生产生物活性肽，特别是一些富含蛋白质的工农业副产物。通过环境友好的加工方式，从工农业副产物中获取生物活性肽是目前研究的热点。小麦谷朊粉作为小麦淀粉工业的副产物，富含蛋白质，由于其来源广泛、廉价，是一种优质的活性肽来源。通过对小麦蛋白氨基酸序列分析发现，它的序列中富含多种生物活性的肽段，在生物活性肽方面有巨大的应用潜力。目前已经有很多种生物活性肽从小麦谷朊粉的水解物中鉴定出来，包括ACE抑制肽、DPP-IV抑制肽和氧自由基清除肽等(Motoi et al.Nahrung/Food,2003,47:354-358；Nongonierma et al.Food&Function,2017,8:2249-2257；Elmalimadi etal.Industrial Crops&Products,2017,109:548-557)。其中ACE抑制肽研究最多，有很多新型ACE抑制肽从小麦蛋白中鉴定出来，包括IAP(IC50＝2.7μM)，GAAGGAF(IC50＝14.19μM)，IPALLKR(IC50＝43μM)，AQQLAAQLPAMCR(IC50＝68μM)(Motoi et al.Nahrung/Food,2003,47:354-358；Asoodeh et al.Journal of Cereal Science,2014,60,92-98；Li etal.Molecules,2017，22,533-534)。生物活性肽的构效关系研究表明，肽段中含有疏水性氨基酸和脯氨酸对肽段的ACE抑制活性具有关键性作用(Iwaniak et al.ConprehensiveReviews in Food Science and Food Safety,2014,13:114-134)。小麦谷朊粉中含有丰富的脯氨酸和疏水性氨基酸，是制备ACE抑制肽的优质蛋白。然而，由于脯氨酸和疏水性氨基酸含量过高，导致了小麦谷朊粉对很多蛋白酶的水解作用具有一定抗性，限制了其作为生物活性肽前体的应用。因此，选取合适的蛋白酶水解小麦谷朊粉，才能达到较高的水解效率。目前很多研究中，碱性蛋白酶经常用于小麦谷朊粉的水解，制备生物活性肽。碱性蛋白酶(EC 3.4.21.62)是一种地衣芽孢杆菌来源的蛋白酶，在小麦谷朊粉蛋白序列中具有丰富的酶切位点。铜绿假单胞菌CAU342A(Pseudomonas aeruginosa)是本实验室从酱油曲中筛选得到的一株高产蛋白酶菌株(孙倩等，微生物学通报，2017,44:86-95.)，目前尚未见到铜绿假单胞菌来源蛋白酶用于水解小麦谷朊粉的报道。
针对传统酶解法的不足，对某些天然蛋白必须进行必要的预处理，使其多肽链折叠和盘曲构成的致密结构变得松散，使蛋白质内部酶切位点暴露，以利于蛋白酶的酶解作用，提高原料利用率。目前已经有很多学者通过物理方法对蛋白质进行预处理提高蛋白酶的水解效率，提高蛋白质利用率，如高压处理、高温处理、微波处理、超声处理和碱处理等(Zhang et al.Journal of the Science of Food and Agriculture,2018,98:1530-1538；Chao et al.Food Research International,2013,54:1528-1534；Ketnawa etal.Food Bioproess Technol,2017,10:582-591；Zhang et al.UltrasonicsSonochemistry,2017,36:88-94.)。目前，尚未见到电解水预处理蛋白质的报道。
关于小麦谷朊粉水解的报道较多，包括单酶和多酶复合酶解制备小麦蛋白肽。其中专利号为200810015396.1的中国发明专利申请公开了一种利用复合蛋白酶单酶水解谷朊粉，制备小麦肽的工业生产方法；申请号为201710296385.4的中国发明专利申请公开了一种利用胃蛋白酶和胰蛋白酶双酶分步水解小麦蛋白，制备小麦肽粉的生产方法；申请号为201510208320.0的中国发明专利申请公开了一种利用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶三种酶复合酶解湿面筋制备小麦肽粉的加工方法。以上公开的发明专利制备小麦蛋白肽使用的均为商品蛋白酶，并且其水解产物中低于1000Da部分占比较低。目前，尚未见到关于铜绿假单胞菌来源蛋白酶用于小麦谷朊粉的水解，制备降血压肽的报道。专利号为200910241723.X的中国发明专利申请公开了一种超声预处理结合碱性蛋白酶水解燕麦麸皮制备燕麦多肽的制备方法；申请号为201810128846.1的中国发明专利申请公开了一种蒸馏水高温预处理结合碱性蛋白酶和风味蛋白酶水解玉米胚芽粕粉制备玉米胚芽活性肽的制备方法；申请号为201711394169.X的中国发明专利申请公开了一种挤压预处理植物蛋白原料制备美拉德肽的方法。超声预处理过程会伴随产热，对设备技术要求较高，需要严格控制超声功率、温度等条件；挤压预处理需要专用设备，而且后期需要对预处理物料干燥处理，增加工序；虽然高温蒸煮预处理设备简单，但是研究表明，长时间高温预处理会产生对人体有害的赖丙氨酸。以上发明专利公开的均为原料预处理结合蛋白酶水解制备生物活性肽的方法，目前，尚未见到电解水预处理用于制备生物活性肽的报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种具有降血压活性的小麦蛋白肽。
本发明所提供的具有降血压活性的小麦蛋白肽，其中，分子量小于1000Da的部分大于95％；所述小麦蛋白肽的体外ACE半抑制浓度可为0.21mg/mL。
本发明还提供两条新型的ACE抑制肽段，即，SAGGYIW和APATPSFW；
其中，ACE抑制肽段SAGGYIW的体外ACE半抑制浓度为2.65μM；
ACE抑制肽段APATPSFW的体外ACE半抑制浓度为41.1μM。
本发明的另一目的是提供上述具有降血压活性的小麦蛋白肽的制备方法。
本发明所提供的制备所述具有降血压活性的小麦蛋白肽的方法，包括如下步骤：
1)采用电解水预处理小麦谷朊粉；
2)调节体系的pH值至8.0-9.5，搅拌，得到小麦谷朊粉混悬液；
3)依次采用碱性蛋白酶和铜绿假单胞菌来源蛋白酶分步酶解；
4)将步骤3)所得酶解液过滤、浓缩和喷雾干燥得到小麦蛋白肽粉。
上述方法步骤1)中，所述采用电解水预处理小麦谷朊粉的操作为：向酶解罐中加入电解水，启动搅拌桨，缓慢加入小麦谷朊粉，加完后继续搅拌2-4h；
其中，所述电解水为实验室自制，采用CE-7001电解槽(广州塞爱环境保护技术开发有限公司)，电解溶液为0.1％的氯化钠溶液。
所述电解水的pH值可为：3.5-12.5；
所述小麦谷朊粉与电解水的比值可为：50-200g：1L，具体可为1g：20mL；
所述电解水预处理的时间可为：4-8h。
上述方法步骤2)中，通过加入1M的盐酸溶液或1M的氢氧化钠溶液调节体系的pH值至8.0-9.5；
上述方法步骤3)中在进行分步酶解之前还包括对步骤2)所得小麦谷朊粉混悬液加热至40-60℃的操作；
上述方法步骤3)的操作为：向所述小麦谷朊粉混悬液中加入碱性蛋白酶，水解，加入铜绿假单胞菌来源蛋白酶，继续水解，两步水解后沸水浴灭活后冷却至室温，得到酶解液；
其中，所述碱性蛋白酶的加入量为500-1500U每克小麦谷朊粉，具体可为750U每克小麦谷朊粉，所述碱性蛋白酶为丹麦诺维信公司的产品，U的定义为：在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为一个蛋白酶活力单位(U)；
所述加入碱性蛋白酶后水解的时间可为4-8h，具体可为6h；
所述铜绿假单胞菌来源蛋白酶为本实验室经优化发酵条件后制备，发酵培养基成分为：2.5％麸皮，1.5％酵母浸粉，0.1％吐温-80,0.5％氯化钠，0.7％磷酸钾，0.3％磷酸氢二钾，0.04％硫酸锰；接种量1％，pH7.5，30℃条件下培养三天。
所述铜绿假单胞菌来源蛋白酶的加入量可为：500-1000U每克小麦谷朊粉，U的定义为在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为一个蛋白酶活力单位(U)；
所述继续水解的时间可为4-8h；
所述水解和继续水解的温度均为40℃-60℃；
上述方法步骤4)中采用板框过滤对酶解液进行过滤，板框过滤所用滤布为200目，硅藻土为国药集团购买，CAS号为91053-39-3。
所述浓缩具体可为旋转蒸发浓缩，浓缩至可溶性固形物含量为20％以上；
通过上述方法，所述小麦谷朊粉的蛋白回收率大于65％；
所得小麦蛋白肽粉中分子量小于1000Da的部分大于95％；
所得小麦蛋白肽粉的ACE体外半抑制浓度可为0.21mg/mL。
所得小麦蛋白肽粉具有良好的抗胃肠消化能力。
通过上述方法制备得到的小麦蛋白肽粉也属于本发明的保护范围。
上述方法还可进一步包括从所得小麦蛋白肽粉中分离得到高活性ACE抑制肽组分的操作。
所述操作为：将所述小麦蛋白肽用盐酸溶液溶解，离心处理，取上清液，进行凝胶层析，分离得到7个组分，依次记为F1组分、F2组分、F3组分、F4组分、F5组分、F6组分和F7组分。
其中，所述盐酸溶液的浓度可为10mM；
所述离心的条件可为在10000r/min条件下离心10min；
采用凝胶层析，色谱条件：AKTApurifier UPC-900快速蛋白液相色谱仪；色谱柱尺寸为1000×10mm，柱料为葡聚糖凝胶G-15；流动相：10mM的盐酸溶液；流速：0.8mL/min；检测：UV280 nm。
其中，F6组分为洗脱时间在127.5-170min的流出液；
F7组分为洗脱时间在170-212.5min的流出液。
由上述方法分离得到的F6组分、F7组分也属于本发明的保护范围。
F7组分的ACE半抑制浓度为0.035mg/mL。
上述方法还可进一步包括从F7组分中分离鉴定得到新型高活性肽段SAGGYIW和APATPSFW的操作。
所述操作为：对F7组分进行nanoLC-MS/MS分析，从中鉴定得到两条新型高活性肽段SAGGYIW和APATPSFW。
上述小麦蛋白肽粉或通过所述方法制备得到的小麦蛋白肽粉、从所述小麦蛋白肽中分离得到的F6组分、F7组分、以及肽段SAGGYIW和APATPSFW在制备降血压的产品和/或预防和/或治疗高血压的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
所述应用中，所述产品可为食品或药物。
本发明还提供了一种降血压的产品和/或预防和/或治疗高血压的产品，所述产品含有上述小麦蛋白肽粉或通过所述方法制备得到的小麦蛋白肽粉、从所述小麦蛋白肽中分离得到的F6组分、F7组分、以及肽段SAGGYIW和APATPSFW中的至少一种。
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
1、本发明利用电解水预处理小麦谷朊粉，在一定程度改变了小麦谷朊粉蛋白的空间结构，提高了小麦谷朊粉的水解效率；
2、本发明利用碱性蛋白酶与铜绿假单胞菌来源蛋白酶分步水解小麦谷朊粉制备降血压小麦蛋白肽粉，为小麦肽粉的制备提供了一种新的方法；
3、本发明提供的利用电解水预处理结合双酶分步水解小麦谷朊粉制备降血压小麦肽的方法，蛋白回收率大于65％，分子量小于1000Da的部分大于95％；
4、本发明提供的利用电解水预处理结合双酶分步水解小麦谷朊粉制备降血压小麦肽的方法，制备的小麦肽粉体外ACE半抑制浓度为0.21mg/mL，且具有良好的抗胃肠消化能力。
5、本发明提供的利用电解水预处理结合双酶分步水解小麦谷朊粉制备降血压小麦蛋白肽的方法，分离鉴定出两条新型高活性肽段(SAGGYIW和APATPSFW)，其体外ACE半抑制浓度分别为2.65μM和41.1μM。
附图说明
图1为本发明的利用电解水预处理结合双酶分步水解小麦谷朊粉制备降血压小麦蛋白肽粉的生产工艺流程图；
图2为不同预处理方式的小麦谷朊粉水解液ACE抑制率；
图3为小麦蛋白肽凝胶排阻色谱分析图；
图4为小麦蛋白肽凝胶分离色谱分析图；
图5为SAGGYIW和APATPSFW的质谱鉴定图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的铜绿假单胞菌来源蛋白酶为本实验室发酵制备，工艺如下：发酵培养基成分为：2.5％麸皮，1.5％酵母浸粉，0.1％吐温-80,0.5％氯化钠，0.7％磷酸钾，0.3％磷酸氢二钾，0.04％硫酸锰；接种量1％，pH7.5，30℃条件下培养三天；发酵液在4℃条件下离心后，其上清液即为粗酶液；测定其酶活力为2600U/mL。
其中，铜绿假单胞菌CAU342A(Pseudomonas aeruginosa)为本实验室从酱油曲样品中筛选得到的(孙倩等，铜绿假单胞菌产蛋白酶的发酵条件优化，微生物学通报，2017,44(1):86-95)。
碱性蛋白酶和复合蛋白酶均为丹麦诺维信公司的产品；
实施方式
降血压活性小麦蛋白肽的制备工艺流程图如图1所示，具体步骤如下：
向酶解罐中加入实验室自制的电解水(采用CE-7001电解槽(广州塞爱环境保护技术开发有限公司)，电解溶液为0.1％的氯化钠溶液，40V电压条件下电解5min)。启动搅拌桨，缓慢加入小麦谷朊粉，加入后搅拌2-4h；以蠕动泵向酶解罐中加入1M的盐酸溶液或1M的氢氧化钠溶液调节pH值至8.0-9.5，继续搅拌30min得到小麦谷朊粉混悬液，加热器加热至45-55℃保温；向小麦谷朊粉混悬液中加入碱性蛋白酶，加入量500-1500U/g，水解6h后，加入铜绿假单胞菌来源蛋白酶，加入量500-1000U/g，继续水解4-6h，两步水解后沸水浴灭活后冷却至室温，得到酶解液；将得到的酶解液进行板框过滤得到肽溶液，旋蒸浓缩得到浓缩肽溶液；将得到的浓缩肽溶液喷雾干燥即得小麦蛋白肽粉。
作为本实施例优选的实施方式，电解水预处理时间为2-4h，电解水pH值为3.5-12.5，小麦谷朊粉加入量为5-20％。
作为本实施例优选的实施方式，小麦谷朊粉混悬液的pH值为8.0-9.5。
作为本实施例优选的实施方式，小麦谷朊粉与碱性蛋白酶的比例为：每克小麦谷朊粉加入诺维信碱性蛋白酶500-1500U。
作为本实施例优选的实施方式，小麦谷朊粉与铜绿假单胞菌来源蛋白酶的比例为：每克小麦谷朊粉加铜绿假单胞菌来源蛋白酶500-1000U。
作为本实施例优选的实施方式，所述水解的温度为40℃-60℃。
作为本实施例优选的实施方式，所述水解时间为10-14h。
作为本实施例优选的实施方式，所述旋转蒸发浓缩液可溶性固形物含量大于20％。
实施例1小麦谷朊粉水解条件优化
配制5％浓度(100ml蒸馏水中加入5g小麦谷朊粉)的小麦谷朊粉混悬液100mL，采用1M的氢氧化钠溶液或1M的盐酸调节混悬液pH至最适条件，分别采用丹麦诺维信碱性蛋白酶、复合蛋白酶和实验室自制的铜绿假单胞菌来源蛋白酶，以单酶或者两种酶分步水解小麦谷朊粉混悬液，总加酶量均为5000U。在最适条件下水解10h后，沸水浴灭活10min，离心得到小麦谷朊粉水解液，测定各自ACE抑制率，并计算其IC50值。水解条件及其测定的ACE抑制率结果如表1所示。ACE抑制活性测定测定，参照Asoodeh等的方法略有改动，具体方法如下所述：
将10μL ACE(0.1U/mL)、20μL小麦谷朊粉水解液、120μL底物HHL(马尿酰-组氨酰-亮氨酸)在37℃下保温60min，加入150μL 1M的盐酸终止反应。随后，加入1mL乙酸乙酯萃取反应体系中的马尿酸。4000r/min离心10min后，吸取0.75mL萃取液至另一试管中，105℃烘干，并重新溶于0.5mL去离子水中，在228nm处测定吸光度。
ACE抑制率计算公式如下：
Aa——ACE及小麦肽都存在条件下的吸光度；
Ab——不存在ACE抑制肽条件下的吸光度；
Ac——ACE不参与反应条件下的吸光度。
表1水解条件及其各水解物ACE抑制活性
作为本实施例的实施方式，铜绿假单胞菌来源蛋白酶分别与诺维信碱性蛋白酶和复合蛋白酶分步水解小麦谷朊粉制备的小麦肽溶液ACE抑制率最高，其半抑制浓度分别达到0.21mg/mL和0.23mg/mL。
实施例2碱性电解水浸泡处理与碱液浸泡处理对小麦谷朊粉水解的影响
分别采用pH值均为11的自制碱性电解水(采用CE-7001电解槽(广州塞爱环境保护技术开发有限公司)，电解溶液为0.1％的氯化钠溶液，40V电压条件下电解5min,其阴极附近产生的溶液即为碱性电解水)和氢氧化钠溶液浸泡小麦谷朊粉8h，之后冻干备用。另外采用蒸馏水浸泡小麦谷朊粉8h后冻干备用。分别取三种预处理后的谷朊粉配制5％的混悬液100mL，调节pH至8.5，加入5000U的诺维信碱性蛋白酶，在50℃条件下水解5h，分别取30min、1h、2h、3h、5h的样品，沸水浴灭活10min，离心得到小麦谷朊粉水解液，冻干后配制1mg/mL浓度的肽溶液，测定各自ACE抑制率。各时间段水解液样品ACE抑制率如图2所示。
作为本实施例的实施方式，碱性电解水浸泡处理后的小麦谷朊粉水解30min、1h、2h、3h时间的样品，ACE抑制率均高于氢氧化钠溶液浸泡处理和蒸馏水浸泡处理的样品；水解5h的样品ACE抑制率与氢氧化钠溶液浸泡处理的样品相近，并高于蒸馏水浸泡处理的样品。
实施例3降血压活性小麦蛋白肽的制备及其分子量测定
向酶解罐中加入20L实验室自制的电解水(采用CE-7001电解槽(广州塞爱环境保护技术开发有限公司)，电解液为0.1％的氯化钠溶液，40V电压条件下电解5min,其阴极附近产生的溶液即为碱性电解水)。启动搅拌桨，缓慢加入1kg小麦谷朊粉，加入后搅拌4h；以蠕动泵向酶解罐中加入1M的盐酸溶液调节pH值至8.5，继续搅拌30min得到小麦谷朊粉混悬液，加热器加热至45-55℃保温；向小麦谷朊粉混悬液中加入10g碱性蛋白酶(5×105U)，水解6h后，加入160mL铜绿假单胞菌来源蛋白酶粗酶液(5×105U)继续水解6h，两步水解后沸水浴灭活后冷却至室温，得到酶解液；将得到的酶解液进行板框过滤得到肽溶液，旋蒸浓缩得到浓缩肽溶液；将得到的浓缩肽溶液喷雾干燥即得小麦蛋白肽粉。
将上述获得的降血压活性小麦蛋白肽的分子量分布进行测定，采用HPLC法，测定色谱条件：安捷伦高效液相色谱仪1260；色谱柱：TSKgel-G2000SWXL column(7.8×300mm)；流动相：乙腈/纯水/三氟乙酸：45/50/0.1(v/v/v)；检测：UV214 nm；流速：0.5mL/min；柱温：30℃。结果如图3所示。
作为本实施例的实施方式，所述小麦蛋白肽粉的收得率大于65％，小麦蛋白肽分子量小于1000Da的部分大于95％。
实施例4高活性肽段的分离鉴定
使用10mM的盐酸溶液平衡G15凝胶柱(1000×10mm)，将实施例3获得的小麦蛋白肽使用10mM的盐酸溶液溶解，在10000r/min条件下离心10min，取上清液进行凝胶层析。采用凝胶色谱法，色谱条件：AKTApurifier UPC-900快速蛋白液相色谱仪；流动相：10mM的盐酸溶液；流速：0.8mL/min；检测：UV280 nm。结果如图4所示，分离得到7个组分，其中F7组分ACE半抑制浓度为0.035mg/mL。对其进行nanoLC-MS/MS分析，从中鉴定得到两条新型高活性肽段，SAGGYIW和APATPSFW，质谱鉴定图如图5所示。
作为本实施例的实施方式，实施例3所述小麦蛋白肽分离得到七个组分，其中F7组分ACE抑制活性最高，F6组分次之，F7组分的体外ACE半抑制浓度为0.035mg/mL。
作为本实施例的实施方式，所述F7组分中分离鉴定出两条高活性ACE抑制肽段，SAGGYIW和APATPSFW，其体外ACE半抑制浓度分别为2.65μM和41.1μM。
上述体外ACE半抑制浓度的测定均参照实施例1中所用方法进行测定。
实施例5本发明降血压小麦肽胃肠消化稳定性实验
将实施例3制备的小麦蛋白肽进行模拟胃肠消化实验，参照Tavares等的方法略有改动，具体方法如下所述：
将小麦肽溶于去离子水中，使用稀盐酸溶液调节小麦肽溶液pH值为2.0，加入胃蛋白酶(E:S 2.5％，w/w)，置于恒温摇床中在37℃条件下水解90min，然后使用0.1M的氢氧化钠溶液调节小麦肽溶液pH值至7.5，加入胰蛋白酶(E:S 2.5％，w/w)，置于恒温摇床中在37℃条件下水解2h。反应结束后，在沸水中保温10min灭酶，冷却后在10000r/min条件下离心10min，取上清液冻干后，测定模拟消化后的小麦肽ACE抑制率，具体测定方法如实施例1所述。
作为本实施例优选的实施方式，实施例3所述小麦蛋白肽，经体外模拟胃肠消化后，其ACE半抑制浓度从0.21mg/mL升高至0.25mg/mL，具有良好的胃肠消化稳定性。
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种制备具有降血压活性的小麦蛋白肽的方法，包括如下步骤：
1)采用电解水预处理小麦谷朊粉；
2)调节体系的pH值至8.0-9.5，搅拌，得到小麦谷朊粉混悬液；
3)依次采用碱性蛋白酶和铜绿假单胞菌来源蛋白酶分步酶解；
4)将步骤3)所得酶解液过滤、浓缩和喷雾干燥得到小麦蛋白肽粉。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述电解水的pH值为：3.5-12.5；
所述小麦谷朊粉与电解水的比值为：50-200g：1L；
所述电解水预处理的时间为：4-8h。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤3)的操作为：向所述小麦谷朊粉混悬液中加入碱性蛋白酶，水解，加入铜绿假单胞菌来源蛋白酶，继续水解，两步水解后沸水浴灭活，冷却至室温，得到酶解液；
其中，所述碱性蛋白酶的加入量为500-1500U每克小麦谷朊粉；
所述加入碱性蛋白酶后水解的时间为4-8h；
所述铜绿假单胞菌来源蛋白酶的加入量为：500-1000U每克小麦谷朊粉；
所述继续水解的时间为4-8h；
所述水解和继续水解的温度均为40℃-60℃。
4.通过权利要求1-3中任一项所述的方法制备得到的小麦蛋白肽粉，所述小麦蛋白肽粉中分子量小于1000Da的部分大于95％；
所述小麦蛋白肽粉的ACE体外半抑制浓度为0.21mg/mL；
所述小麦蛋白肽粉具有良好的抗胃肠消化能力。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法还进一步包括从所得小麦蛋白肽粉中分离得到高活性ACE抑制肽组分的操作；
所述操作为：将所述小麦蛋白肽用盐酸溶液溶解，离心处理，取上清液，进行凝胶层析，分离得到7个组分，依次记为F1组分、F2组分、F3组分、F4组分、F5组分、F6组分和F7组分；
其中，所述盐酸溶液的浓度为10mM；
所述离心的条件为在10000r/min条件下离心10min；
采用凝胶层析，色谱条件：AKTApurifier UPC-900快速蛋白液相色谱仪；色谱柱尺寸为1000×10mm，柱料为葡聚糖凝胶G-15；流动相：10mM的盐酸溶液；流速：0.8mL/min；检测：UV280nm；
F6组分为洗脱时间在127.5-170min的流出液；
F7组分为洗脱时间在170-212.5min的流出液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法还进一步包括从F7组分中分离鉴定得到高活性肽段SAGGYIW和APATPSFW的操作；
所述操作为：对F7组分进行nanoLC-MS/MS分析，从中鉴定得到高活性肽段SAGGYIW和APATPSFW。
7.权利要求5所述方法分离得到的高活性ACE抑制肽组分F6组分和F7组分；其中，F7组分的ACE半抑制浓度为0.035mg/mL。
8.高活性ACE抑制肽段SAGGYIW，其体外ACE半抑制浓度为2.65μM，或，高活性ACE抑制肽段APATPSFW，其体外ACE半抑制浓度为41.1μM。
9.权利要求1-3任一项所述方法制备的小麦蛋白肽、权利要求4所述的小麦蛋白肽、权利要求7所述的F6组分及F7组分或权利要求8所述的肽段SAGGYIW或肽段APATPSFW在制备降血压的产品和/或预防和/或治疗高血压的产品中的应用。
10.一种降血压的产品和/或预防和/或治疗高血压的产品，含有权利要求1-3任一项所述方法制备的小麦蛋白肽、权利要求4所述的小麦蛋白肽、权利要求7所述的F6组分及F7组分以及权利要求8所述的肽段SAGGYIW和肽段APATPSFW中的至少一种。
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