CN114805471A - 一种火麻籽粕高f值寡肽及其制备方法和在提高纳豆激酶产量中的应用 - Google Patents
一种火麻籽粕高f值寡肽及其制备方法和在提高纳豆激酶产量中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种火麻籽粕高F值寡肽及其制备方法和在提高纳豆激酶产量中的应用。本发明以火麻籽粕作为原料，通过碱提酸沉的方法得到火麻籽分离蛋白，经过碱性蛋白酶和木瓜蛋白的两步酶解，通过活性炭的吸附得到高F值火麻籽粕寡肽。将制备出来的高F值火麻籽粕寡肽加入到枯草芽孢杆菌的发酵液中，可显著提高其纳豆激酶的产量。该发明实现了火麻油加工副产物的高效利用，为火麻籽粕的利用提供了新方向，且制备方法简单可控，适用于工厂量产。
Description
技术领域
本发明涉及火麻油加工废弃物的综合利用技术领域，具体涉及一种火麻籽粕高F值寡肽及其制备方法、在提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量中的应用。
背景技术
火麻籽粕是火麻子经压榨或浸提脱油后的碎片状或粗粉状的副产品,其粗蛋白含量高，富含必需氨基酸，是一种优良的植物蛋白来源，而工业上却主要被当做动物饲料，缺乏附加值高的产品，没有对火麻蛋白的深度加工开发与利用，造成了蛋白资源的严重浪费，极大地浪费了蛋白资源。火麻蛋白作为火麻中的具有生理活性成分之一，理应成为科学研究与应用的一部分，从而推进火麻产业的发展，提高火麻产品的附加值。
F值寡肽是指支链氨基酸(BCAA，包括亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val))与芳香族氨基酸(AAA，包括酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp))物质的量比值F大于20，且由2～9个氨基酸组成的蛋白质前体物或水解物。高F值寡肽具有良好的抗疲劳和解醉酒功能特性；可辅助治疗肝病、促进肝病患者体内F值回到正常范围；可调节体内苯丙氨酸代谢。火麻蛋白为富含铁、锌等金属的一类蛋白质；且具有高含量的支链氨基酸；球蛋白与清蛋白的生物利用率比大豆蛋白要高。是制备高F值寡肽的优良原料。
纳豆激酶是一种能高效溶解人体血栓的碱性丝氨酸蛋白酶，这种酶主要由芽孢杆菌(Bacillus)和在发酵时产生。研究证实，纳豆激酶具有溶栓作用，相较于治疗血栓的药物而言，纳豆激酶没有明显的毒副作用，更加安全有效。此外纳豆激酶还有抗高血压、降血脂、抗血小板、改善血液循环等作用。但目前纳豆激酶的产量较低，限制了其的大范围应用。专利《一种纳豆激酶液态发酵培养基及生产纳豆激酶的发酵方法》中记载,获得的纳豆激酶酶活最高达5690IU/mL。本发明制备出来的高F值火麻籽寡肽可以代替传统的枯草芽孢杆菌发酵培养基中的氮源，有效提高了纳豆激酶的产量，实现了火麻籽粕的高效利用。
发明内容
本发明的目的是提供一种火麻籽粕高F值寡肽及其制备方法和在提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量中的应用，通过寻找高质量氮源，实现了枯草芽孢杆菌高产纳豆激酶。另一方面，实现了火麻油加工副产品的高效利用。
为了实现上述目的，本发明采取了以下步骤，
一种火麻籽粕高F值寡肽的制备方法，包括以下步骤：
S1，将火麻籽粕进行干燥粉碎，过筛后得到火麻籽粉，加入蒸馏水，配置成火麻籽浊悬液A；
S2，利用碱提酸沉法提取火麻子蛋白，将火麻籽浊悬液A的pH调为碱性，离心收集上清，再将pH调为酸性，静置后，沉淀水洗过后加入蒸馏水，配置成火麻籽分离蛋白浊悬液B；
S3，将火麻籽分离蛋白浊悬液B的pH调节至碱性，预热后加入一定量的碱性蛋白酶，反应一段时间后沸水浴灭活，得到酶解液C1；
S4，将酶解液C1的pH调节至中性，预热后加入一定量的木瓜蛋白酶，反应一段时间后沸水浴灭活，得到酶解液C2；
S5，将酶解液C2进行超滤，收集不同的组分，冷冻干燥后得到火麻籽多肽粉D；
S6，将火麻籽多肽粉D溶解于蒸馏水中，调节pH，加入一定量的活性炭，吸附一段时间后，进行抽滤并冷冻干燥得到火麻籽高F值寡肽粉E。
所述S1中，火麻籽粕过80-100目筛，用蒸馏水配置成5％-10％的火麻子浊悬液A。
所述S2中，先将火麻子浊悬液A调节pH至8.0-10.0，离心收集上清后，将pH调节至4.0-6.0，沉淀水洗过后，用蒸馏水配置成5％-10％的火麻籽分离蛋白浊悬液B。
所述S3中，将火麻籽分离蛋白浊悬液B的pH调节至9.0-12.0，在40-60℃下预热10-20min，加入相对于火麻子分离蛋白含量的3％-5％的碱性蛋白酶，在40-60℃，100-200r/min的摇床中反应3-5h。
所述S4中，将酶解液C1的pH调节至6.0-8.0，在30-40℃下预热10-20min，加入相对于火麻子分离蛋白含量的3％-5％的木瓜蛋白酶，在30-40℃，100-200r/min的摇床中反应3-5h。
所述S5中，将酶解液C2根据需要选择通过5KD、3KD、1KD的超滤膜，冷冻干燥后得到的火麻籽多肽粉D分为四个组分：D1>5KD；D2为3～5KD；D3为1～3KD；D4<1KD，超滤的分离参数为：上样量2-4L，温度4-8℃，压力0.3-0.7MPa。
所述S6中，将火麻籽寡肽粉D用蒸馏水中配置成5％-10％的溶液，调节PH至3.0-5.0，加入相对于火麻子多肽含量的3％-5％的的活性炭，在室温、150-200r/min的摇床中吸附过夜。
所述一种火麻籽粕高F值寡肽的制备方法，进一步优选地，
S1，将火麻籽粕进行干燥粉碎，过80目筛得到火麻籽粉，加入蒸馏水，配置成5％的火麻籽浊悬液A；
S2，调节火麻籽浊悬液A的pH至8.0，离心收集上清后，将pH调节至6.0，沉淀水洗过后，用蒸馏水配置成5％的火麻籽分离蛋白浊悬液B；
S3，将火麻籽分离蛋白浊悬液B的pH调节至9.0，在50℃下预热15min，加入相对于火麻子分离蛋白含量的4％的碱性蛋白酶，在50℃，100-200r/min的摇床中反应3-5h，反应结束后沸水浴灭活，得到酶解液C1；
S4，将酶解液C1的PH调节至6.0，在37℃下预热15min，加入相对于火麻子分离蛋白含量的3％-5％的木瓜蛋白酶，在30-40℃，100-200r/min的摇床中反应3-5h，反应结束后沸水浴灭活，得到酶解液C2；
S5，将酶解液C2分别通过5KD、3KD、1KD的超滤膜，设置参数：上样量2-4L，温度4-8℃，压力0.3-0.7MPa收集不同的组分，冷冻干燥后得到的火麻籽多肽粉D分为四个组分：D1(>5KD)；D2(3～5KD)；D3(1～3KD)；D4(<1KD)；
S6，将火麻籽多肽粉D1-D4用蒸馏水中配置成5％-10％的溶液，调节PH至3.0-5.0，加入相对于火麻子多肽含量的3％-5％的的活性炭，在室温、150-200r/min的摇床中吸附过夜，吸附结束后进行抽滤并冷冻干燥得到火麻籽高F值寡肽粉E1-E4。
上述制备方法制备得到的火麻籽粕高F值寡肽，所述火麻籽粕高F值寡肽的F值在20～30之间，E1-E4的寡肽粉的F值递增，火麻子高F值寡肽E4，F值达28.3。
在本发明中，利用碱提酸沉的方法提取火麻籽分离蛋白，碱提时，蛋白质携带大量同种电荷，阻碍了聚集，提高了蛋白的溶解度；酸沉时，利用了火麻籽的等电点，使火麻籽蛋白沉淀，从而去除了大量不容杂质，有助于提高后续的酶解效率。
本发明中，所述碱性蛋白酶作为内切蛋白酶，作用位点丰富，可以更多的水解大豆蛋白中的肽键，形成分子质量较小的蛋白酶水解产物。木瓜蛋白酶作为外切蛋白酶可以优先水解C端的赖氨酸和精氨酸，和N端具有两个羧基或苯环的氨基酸。分步酶解法可以有效的游离出更多的芳香族氨基酸，经活性炭吸附后提高F值。所制备出来的高F值寡肽粉E1-E4的F值均大于20。
所述火麻籽粕高F值寡肽在发酵生产纳豆激酶中的应用。
将火麻籽粕高F值寡肽作为氮源添加到发酵培养基中，所述添加量为10-25g/L。
本发明火麻籽粕高F值寡肽适用于多种能发酵产纳豆激酶的菌株，包括但不限于枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等，能够提高菌株纳豆激酶的产量。
本发明一个实施例中，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)gs-11061为例说明了火麻籽粕高F值寡肽在提高纳豆激酶产量中的应用。
平板培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，加蒸馏水至1000ml，pH自然，121℃灭菌20min；
种子培养基：葡萄糖12g/L，蛋白胨15g/L，磷酸氢二钾1.2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.40g/L，氯化钙0.25g/L，硫酸锰0.001g/L，加蒸馏水至1000ml，pH为7.4，121℃灭菌20min；
发酵培养基：葡萄糖10-20g/L，火麻籽高F值寡肽粉10-20g/L，磷酸氢二钾1-2g/L，磷酸二氢钾1-2g/L，硫酸镁0.3-0.7g/L，氯化钙0.2-0.5g/L，氯化铁0.001-0.003g/L，加蒸馏水至1000ml，pH为7.4。121℃灭菌20min。
将菌种经30-40℃平板活化，24h后取两环生长良好的菌体于种子液培养后，30-40℃、150-200rpm培养12h。按照2.5-5％(v/v)接种量转接到发酵培养基中，30-40℃，150-200rpm，发酵24h。
将火麻籽高F值寡肽粉E1-E4代替蛋白胨，分别加入到发酵培养基中，用于生产纳豆激酶。
在本发明中，火麻子高F值寡肽E4，F值达28.3，添加到发酵培养基后，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)gs-11061产纳豆激酶的活性达14845.2IU/mL。
本发明利用低成本的火麻油副产物制备出高价值的纳豆激酶，实现了火麻籽粕蛋白的高效利用。
有益效果：
本发明利用碱提酸沉的方法提取火麻籽分离蛋白，分步酶解法可以有效的游离出更多的芳香族氨基酸，经活性炭吸附后提高F值，提取得到的火麻籽粕高F值寡肽作为氮源可以显著提高枯草芽孢杆菌发酵生产纳豆激酶的产量。
具体实施方式
本实验所用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶均为商品化的酶，购于上海源叶生物科技有限公司。
实施例1
一种火麻籽粕高F值寡肽的制备方法，包括以下步骤，
S1，将火麻籽粕进行干燥粉碎，过80目筛得到火麻籽粉，加入蒸馏水，配置成5％的火麻籽浊悬液A；
S2，将火麻籽浊悬液A的pH至8.0，离心收集上清后，将pH调节至6.0，沉淀水洗过后，用蒸馏水配置成5％的火麻籽分离蛋白浊悬液B；
S3，将火麻籽分离蛋白浊悬液B的pH调节至9.0，在50℃下预热15min，加入相对于火麻子分离蛋白含量的3％的碱性蛋白酶，在50℃，150r/min的摇床中反应3h，反应结束后沸水浴灭活，得到酶解液C1；
S4，将酶解液C1的pH调节至6.0，在37℃下预热15min，加入相对于火麻子分离蛋白含量的3％的木瓜蛋白酶，在37℃，150r/min的摇床中反应3h，反应结束后沸水浴灭活，得到酶解液C2；
S5，将酶解液C2分别通过5KD、3KD、1KD的超滤膜，设置参数：上样量3L，温度4℃，压力0.4MPa收集不同的组分，冷冻干燥得到的火麻籽多肽粉D分为四个组分：D1(>5KD)；D2(3～5KD)；D3(1～3KD)；D4(<1KD)，冷冻干燥后得到火麻籽多肽粉D1-D4；
S6，将火麻籽寡肽粉D1-D4用蒸馏水中配置成5％的溶液，调节pH至5.0，加入相对于火麻子多肽含量的3％的活性炭，在室温、150r/min的摇床中吸附过夜，吸附结束后进行抽滤并冷冻干燥得到火麻籽高F值寡肽粉E1-E4。
对本实施例步骤S6中所得的火麻籽高F值寡肽粉对枯草芽孢杆菌产纳豆激酶的促进效果进行评定：枯草芽孢杆菌发酵产纳豆激酶。
平板培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，加蒸馏水至1000ml，pH自然，121℃灭菌20min；
种子培养基：葡萄糖12g/L，蛋白胨15g/L，磷酸氢二钾1.2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.40g/L，氯化钙0.25g/L，硫酸锰0.001g/L，加蒸馏水至1000ml，pH为7.4，121℃灭菌20min；
发酵培养基：葡萄糖15g/L，蛋白胨(或E1-E4)15g/L，磷酸氢二钾1.2g/L，磷酸二氢钾1.6g/L，硫酸镁0.45g/L，氯化钙0.25g/L，氯化铁0.002g/L，加蒸馏水至1000ml，pH为7.4。121℃灭菌20min。
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)gs-11061经35℃平板活化，24h后取两环生长良好的菌体于80ml的种子液培养后，35℃、180rpm培养12h。按照5％(v/v)接种量转接到装液量为80mL发酵培养基中，35℃，180rpm，发酵24h。
将火麻籽高F值寡肽粉E1-E4代替蛋白胨，分别加入到枯草芽孢杆菌发酵培养基中，编码发酵培养基1-4，发酵培养基0为对照培养基。
测定各培养基中的F值和纳豆激酶的活性，结果如表1所示。结果表明发酵培养基4(<1KD的火麻籽高F值寡肽)中F值和纳豆激酶活性最高。
表1各培养基中纳豆激酶的活性
实施例2
不同菌种利用火麻籽高F值寡肽发酵产纳豆激酶，包括以下步骤，
S1，将火麻籽粕进行干燥粉碎，过90目筛得到火麻籽粉，加入蒸馏水，配置成7％的火麻籽浊悬液A；
S2，将火麻籽浊悬液A的pH至9.0，离心收集上清后，将pH调节至5.0，沉淀水洗过后，用蒸馏水配置成7％的火麻籽分离蛋白浊悬液B；
S3，将火麻籽分离蛋白浊悬液B的PH调节至10.0，在50℃下预热15min，加入相对于火麻子分离蛋白含量的4％的碱性蛋白酶，在50℃，150r/min的摇床中反应4h，反应结束后沸水浴灭活，得到酶解液C1；
S4，将酶解液C1的pH调节至7.0，在37℃下预热15min，加入相对于火麻子分离蛋白含量的4％的木瓜蛋白酶，在37℃，150r/min的摇床中反应4h，反应结束后沸水浴灭活，得到酶解液C2；
S5，将酶解液C2分别通过5KD、3KD、1KD的超滤膜，设置参数：上样量3L，温度5℃，压力0.5MPa，已知<1KD火麻籽多肽粉效益最好，超滤收集<1KD的火麻籽多肽溶液，冷冻干燥后得到火麻籽多肽粉D4；
S6，将火麻籽多肽粉D4用蒸馏水中配置成7％的溶液，调节pH至4.0，加入相对于火麻子多肽含量的4％的的活性炭，在室温、150r/min的摇床中吸附过夜，吸附结束后进行抽滤并冷冻干燥得到火麻籽高F值寡肽粉E4。
将火麻籽高F值寡肽粉E4加入到发酵培养基中，检测不同菌种发酵纳豆激酶的活性。
平板培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，加蒸馏水至1000ml，pH自然，121℃灭菌20min；
种子培养基：葡萄糖12g/L，蛋白胨15g/L，磷酸氢二钾1.2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.40g/L，氯化钙0.25g/L，硫酸锰0.001g/L，加蒸馏水至1000ml，pH为7.4，121℃灭菌20min；
发酵培养基：葡萄糖15g/L，E4 15g/L，磷酸氢二钾1.2g/L，磷酸二氢钾1.6g/L，硫酸镁0.45g/L，氯化钙0.25g/L，氯化铁0.002g/L，加蒸馏水至1000ml，pH为7.4。121℃灭菌20min。
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)gs-11061、纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)BNCC194961、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BNCC132622，分别经35℃平板活化，24h后取两环生长良好的菌体于80ml的种子液培养后，35℃、180rpm培养12h。按照5％(v/v)接种量转接到装液量为80mL发酵培养基中，35℃，180rpm,发酵24h。
测定不同菌种和发酵培养基产纳豆激酶的活性，结果如表2所示。三种菌株在发酵培养基中添加火麻籽高F值寡肽后，其纳豆激酶活性都有所提高，其中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)gs-11061利用火麻籽高F值寡肽发酵产纳豆激酶的活性最高。
表2不同菌种利用火麻籽高F值寡肽发酵产纳豆激酶活性
实施例3枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)gs-11061利用不同火麻籽寡肽添加量发酵产纳豆激酶，包括以下步骤，
S1，将火麻籽粕进行干燥粉碎，过100目筛得到火麻籽粉，加入蒸馏水，配置成10％的火麻籽浊悬液A；
S2，将火麻籽浊悬液A的pH至10.0，离心收集上清后，将pH调节至4.0，沉淀水洗过后，用蒸馏水配置成10％的火麻籽分离蛋白浊悬液B；
S3，将火麻籽分离蛋白浊悬液B的pH调节至11.0，在50℃下预热15min，加入相对于火麻子分离蛋白含量的5％的碱性蛋白酶，在50℃，150r/min的摇床中反应5h，反应结束后沸水浴灭活，得到酶解液C1；
S4，将酶解液C1的PH调节至8.0，在37℃下预热15min，加入相对于火麻子分离蛋白含量的5％的木瓜蛋白酶，在37℃，150r/min的摇床中反应5h，反应结束后沸水浴灭活，得到酶解液C2；
S5，将酶解液C2进行超滤，设置参数：上样量3L，温度6℃，压力0.5MPa，超滤得到<1KD的火麻子多肽溶液，冷冻干燥后得到火麻籽多肽粉D4；
S6，将火麻籽多肽粉D用蒸馏水中配置成10％的溶液，调节pH至3.0，加入相对于火麻子多肽含量的5％的的活性炭，在室温、150r/min的摇床中吸附过夜，吸附结束后进行抽滤并冷冻干燥得到火麻籽高F值寡肽粉E4。
将火麻籽高F值寡肽粉E4按不同的量加入到发酵培养基中，检测枯草芽孢杆菌将(Bacillus subtilis)gs-11061发酵纳豆激酶的活性。
平板培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，加蒸馏水至1000ml，pH自然，121℃灭菌20min；
种子培养基：葡萄糖12g/L，蛋白胨15g/L，磷酸氢二钾1.2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.40g/L，氯化钙0.25g/L，硫酸锰0.001g/L，加蒸馏水至1000ml，pH为7.4，121℃灭菌20min；
发酵培养基5：葡萄糖15g/L，E4 10g/L，磷酸氢二钾1.2g/L，磷酸二氢钾1.6g/L，硫酸镁0.45g/L，氯化钙0.25g/L，氯化铁0.002g/L，加蒸馏水至1000ml，pH为7.4。121℃灭菌20min。
发酵培养基6：葡萄糖15g/L，E4 15g/L，磷酸氢二钾1.2g/L，磷酸二氢钾1.6g/L，硫酸镁0.45g/L，氯化钙0.25g/L，氯化铁0.002g/L，加蒸馏水至1000ml，pH为7.4。121℃灭菌20min。
发酵培养基7：葡萄糖15g/L，E4 20g/L，磷酸氢二钾1.2g/L，磷酸二氢钾1.6g/L，硫酸镁0.45g/L，氯化钙0.25g/L，氯化铁0.002g/L，加蒸馏水至1000ml，pH为7.4。121℃灭菌20min。
发酵培养基8：葡萄糖15g/L，E4 25g/L，磷酸氢二钾1.2g/L，磷酸二氢钾1.6g/L，硫酸镁0.45g/L，氯化钙0.25g/L，氯化铁0.002g/L，加蒸馏水至1000ml，pH为7.4。121℃灭菌20min。
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)gs-11061经35℃平板活化，24h后取两环生长良好的菌体于80ml的种子液培养后，35℃、180rpm培养12h。按照5％(v/v)接种量转接到装液量为80mL发酵培养基5-8中，35℃，180rpm，发酵24h。
测定各培养基中的纳豆激酶活性，结果如表3所示。在发酵培养基中，所添加的火麻籽高F值寡肽越多，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)gs-11061发酵产纳豆激酶活性越高。
表3各培养基中纳豆激酶的活性
F值计算公式如下：
F值＝(Ile+Leu+Val)/(Phe+Tyr)
Ile、Leu、Val、Phe、Tyr分别代表异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的摩尔浓度。
酶活检测相关步骤：
试剂及溶液配制：磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)磷酸氢二钠0.895g加水溶解并稀释至250mL作为溶液A；称取磷酸二氢钠0.789g加水溶解至125mL作为溶液B，将A和B两者相互混合，使其pH＝7.8；0.9％氯化钠溶液的配制：称取氯化钠3.6g加水溶解至400mL；工作液的配制:将A+B混合液与0.9％氯化钠溶液按照1:17进行混合；1.5％琼脂糖溶液：称取琼脂糖1.5g溶解于100mL工作液高温灭菌放于60℃烘箱中；纤维蛋白原溶液的配制：取纤维蛋白原103mg加工作液68.67mL进行溶解制成1.5mg/mL可凝蛋白溶液；凝血酶溶液的配制：将160bp凝血酶溶于20mL0.9％氯化钠溶液制成浓度为8bp/mL凝血酶溶液，分装20支，保藏于-20℃冰箱，每次使用时取出一支稀释8mL，浓度为1bp/mL凝血酶溶液，取出5.28mL，待用。
琼脂糖-纤维蛋白原平板的制备：将配置好纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液放入水浴锅预热,迅速取琼脂糖溶液，加入预热好的纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液，迅速混合，放置室温1h待凝固后进行打孔。
样品的检测：用移液枪准确量取标品及样品各15μL，分别点在同一平皿中，加盖，放入37℃恒温培养14～16h。
Claims (10)
1.一种火麻籽粕高F值寡肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将火麻籽粕进行干燥粉碎，过筛后得到火麻籽粉，加入蒸馏水，配置成火麻籽浊悬液A；
S2，利用碱提酸沉法提取火麻子蛋白，将火麻籽浊悬液A的pH调为碱性，离心收集上清，再将pH调为酸性，沉淀水洗过后加入蒸馏水，配置成火麻籽分离蛋白浊悬液B；
S3，将火麻籽分离蛋白浊悬液B的pH调节至碱性，预热后加入碱性蛋白酶，反应后沸水浴灭活，得到酶解液C1；
S4，将酶解液C1的pH调节至中性，预热后加入木瓜蛋白酶，反应后沸水浴灭活，得到酶解液C2；
S5，将酶解液C2进行超滤，收集不同的组分，冷冻干燥后得到火麻籽多肽粉D；
S6，将火麻籽多肽粉D溶解于蒸馏水中，调节pH，加入活性炭，吸附后，进行抽滤并冷冻干燥得到火麻籽高F值寡肽粉E。
2.根据权利要求1所述的火麻籽粕高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述S1中，火麻籽粕过80-100目筛，用蒸馏水配置成5%-10%的火麻子浊悬液A。
3.根据权利要求1所述的火麻籽粕高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述S2中，先将火麻子浊悬液A调节pH至8.0-10.0，离心收集上清后，将pH调节至4.0-6.0，沉淀水洗过后，用蒸馏水配置成5%-10%的火麻籽分离蛋白浊悬液B。
4.根据权利要求1所述的一种火麻籽粕高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述S3中，将火麻籽分离蛋白浊悬液B的pH调节至9.0-12.0，在40-60℃下预热10-20min，加入相对于火麻子分离蛋白含量的3%-5%的碱性蛋白酶，在40-60℃，100-200r/min的摇床中反应3-5h。
5.根据权利要求1所述的一种火麻籽粕高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述S4中，将酶解液C1的pH调节至6.0-8.0，在30-40℃下预热10-20min，加入相对于火麻子分离蛋白含量的3%-5%的木瓜蛋白酶，在30-40℃，100-200r/min的摇床中反应3-5h。
6.根据权利要求1所述的一种火麻籽粕高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述S5中，将酶解液C2根据需要选择通过5KD、3KD、1KD的超滤膜，冷冻干燥后得到的火麻籽多肽粉D分为四个组分：D1>5KD；D2为3~5KD；D3为1~3KD；D4<1KD，超滤的分离参数为：上样量2-4L，温度4-8℃，压力0.3-0.7MPa。
7.根据权利要求1所述的一种火麻籽粕高F值寡肽的制备方法，其特征在于，所述S6中，将火麻籽寡肽粉D用蒸馏水中配置成5%-10%的溶液，调节PH至3.0-5.0，加入相对于火麻子多肽含量的3%-5%的的活性炭，在室温、150-200r/min的摇床中吸附过夜。
8.权利要求1-7中任意一项制备方法制备得到的火麻籽粕高F值寡肽。
9.权利要求8所述火麻籽粕高F值寡肽在枯草芽孢杆菌发酵生产纳豆激酶中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将火麻籽粕高F值寡肽作为氮源添加到枯草芽孢杆菌发酵培养基中，所述添加量为10-25g/L。
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| CN115404227A (zh) * | 2022-09-22 | 2022-11-29 | 南京工业大学 | 一种利用火麻籽粕固态发酵生产纳豆激酶的方法 |
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| CN112746091A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-04 | 南京工业大学 | 一种能提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的大豆蛋白肽的制备与应用 |
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