CN112125948A - 一种从植物叶片中同步提取植物多酚和植物蛋白并制备植物蛋白水解肽的方法 - Google Patents

一种从植物叶片中同步提取植物多酚和植物蛋白并制备植物蛋白水解肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从植物叶片中同步提取植物多酚和植物蛋白并制备植物蛋白水解肽的方法，包括以下步骤：(1)选取植物叶片粉，加入TCA/丙酮溶液，震荡后静置过夜；(2)将溶液离心，收集沉淀和上清液；(3)上清液先经过浓缩回收丙酮，利用大孔树脂吸附，先用水洗，再采用洗脱液洗脱，所得目标物经浓缩，即为植物多酚；(4)向沉淀中加入预冷丙酮提取，洗涤，收集沉淀，晾干，得植物叶片蛋白粗提物；(5)将粗提物溶于水中，加入酶进行酶解；(6)调节酶解产物的pH值，离心，收集上清液，即得植物蛋白肽。该方法能同时获取植物多酚、植物蛋白以及植物蛋白水解肽，且该方法原料来源广，操作工艺简单，能耗少，可大规模生产。

Description

一种从植物叶片中同步提取植物多酚和植物蛋白并制备植物 蛋白水解肽的方法
技术领域
本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种从植物叶片中同步提取植物多酚和植物蛋白并制备植物蛋白水解肽的方法。
背景技术
植物多酚是多羟基酚类化合物的总称，广泛存在于植物中，有助于植物防御病原、害虫等危害。研究表明植物多酚还具有抗肿瘤、抗氧化、抗动脉粥样硬化、防止冠心病与中风等心脑血管疾病以及抗菌等多种生理功能。传统多酚类化合物的提取分离多选用有机溶剂提取法，该方法不需要特殊的仪器，应用较为普遍，但往往存在着产品安全性低、提取效率低、纯度不高等缺点。近年来，一些以先进仪器为基础的新型提取方法逐渐被人们关注，然而单一的提取方法仍旧存在一些问题，如微波提取法通过微波辐射导致植物细胞内的极性物质吸收微波能，产生大量热，促进细胞多酚类物质的溶解与释放，但是多酚的热稳定性较差，会造成酚类物质的损失；生物酶解法和膜分离技术等方法提取效率高，但是耗时长，价格高。因此实现传统多酚提取工艺的转型升级，实现酚类物质廉价高效地提取尤为重要。
植物叶蛋白是自然界中最丰富且可再生的蛋白资源，营养丰富，必须氨基酸分布均衡，生物效价高，可以用作动物饲料或者食品添加剂。目前叶蛋白的提取方法比较多，但提取过程均会存在一些问题，如常见的加热提取法，能耗较高，热处理过程中易引发蛋白质的变性；常见的化学提取法(如酸/碱提取法)容易诱发环境污染；传统发酵法则往往耗时较长，产品得率有限等问题。此外，由于蛋白是大分子，直接用作动物饲料往往吸收利用率较低，对其进行酶解后转化为小分子肽，能有效提高植物蛋白的生物利用率，提高产品的价值。研究表明，植物蛋白肽，是从植物或农作物中提取的一种水溶性蛋白，是国内外公认的氧自由基的专一清除剂，在护肤品和保健品等领域有广泛应用。因此，对传统叶蛋白的提取工艺进行升级改造，制备植物蛋白肽势必会为植物蛋白资源在食品、饲料及医疗等行业的应用赢得更广阔的市场。
目前，同时分离提取植物多酚和植物蛋白的工艺报道较少，直接分离叶蛋白制备多肽的报道更是有限。中国专利申请号201010195957.8和中国专利申请号201910059469.5，虽然分别提供了一种提取叶蛋白和叶多酚的工艺方法，但是这两种工艺过程相对比较复杂，耗时耗能，不适合大规模生产；中国专利申请号 201810426060.8公布了一种植物总蛋白的提取方法及其专用提取液，该方法也是采用了TCA/丙酮沉淀法提取蛋白，但是该方法旨在提取分离植物蛋白，而非制备蛋白肽，且未涉及植物中多种有效成分的同步分离。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从植物叶片中同步提取植物多酚和植物蛋白并制备植物蛋白水解肽的方法，该方法能同时获取植物多酚、植物蛋白以及植物蛋白水解肽，且该方法原料来源广，操作工艺简单，能耗少，可大规模生产。
本发明的上述目的可以通过以下技术方案来实现：一种从植物叶片中同步提取植物多酚和植物蛋白并制备植物蛋白水解肽的方法，包括以下步骤：
(1)选取植物叶片粉，加入预冷的1,1,1-三氯乙烷(TCA)/丙酮溶液，充分震荡后静置过夜；
(2)将静置过夜后溶液离心，分别收集沉淀和上清液；
(3)将步骤(2)的上清液先经过真空减压浓缩回收丙酮，所得浓缩液利用大孔树脂吸附，先用水洗去TCA，再采用洗脱液洗脱分离植物多酚，所得目标物经真空减压浓缩，即为植物多酚；
(4)向步骤(2)收集的沉淀中先加入预冷丙酮提取，然后洗涤去除TCA，收集沉淀，晾干，获得植物叶片蛋白粗提物；
(5)将植物叶片蛋白粗提物溶于水中，然后加入酶进行酶解；
(6)调节酶解产物的pH值，离心，收集上清液，即得植物蛋白肽。
在上述从植物叶片中同步提取植物多酚和植物蛋白并制备植物蛋白水解肽的方法中：
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
优选的，步骤(1)中所述预冷的1,1,1-三氯乙烷(TCA)/丙酮溶液为提前置于-18～-20℃预冷4h；所述1,1,1-三氯乙烷(TCA)/丙酮溶液的用量为每g植物叶片粉中加入5～10mL体积百分含量为10％的1,1,1-三氯乙烷(TCA)/丙酮溶液；充分震荡后于-18～-20℃静置过夜。
更佳的，步骤(1)中所述预冷的1,1,1-三氯乙烷(TCA)/丙酮溶液为提前置于-20℃预冷；所述1,1,1-三氯乙烷(TCA)/丙酮溶液的用量为每克植物叶片粉中加入10mL体积百分含量为10％的1,1,1-三氯乙烷(TCA)/丙酮溶液；充分震荡后-20℃静置过夜。
植物蛋白是自然界中最丰富且可再生的蛋白资源，已广受人们关注，通常人们借助一定的方法对蛋白分离后将其余组分丢弃，常常忽略蛋白提取后废弃液中资源的挖掘与利用。而本申请在试验过程中出乎意料的发现，采用TCA/丙酮溶液提取蛋白后，上清液可以实现植物多酚的分离提取，即利用TCA/丙酮溶液对植物叶片中蛋白进行分离后继续可以通过树脂洗脱分离植物中的酚类物质。
但这个方面需要对TCA/丙酮溶液的浓度、用量以及提取时间等进行研究，试验结果表明，所述TCA/丙酮溶液的用量为每克植物叶片粉中加入10mL 10％的TCA/丙酮溶液(v/v)；充分震荡后于-20℃静置过夜。此时，植物多酚和植物蛋白提取效率最佳。
优选的，步骤(2)中离心条件为4℃，4000～10000r/m，5～10min。
优选的，步骤(3)中真空减压浓缩的条件控制在35～42℃，-0.1MPa。
优选的，步骤(3)中所述大孔树脂为X-5大孔树脂，所述洗脱液为质量比为80：19：1的乙醇/水/浓盐酸混合溶液，其中浓盐酸的质量百分含量为36～38％，洗脱速率为0.3mL/min。
优选的，步骤(4)中所述预冷丙酮为在-18～-20℃预冷4h；步骤(4)洗涤去除TCA的过程为在4℃、4000rpm的条件下洗涤5min，洗涤过程不少于3次。
优选的，步骤(5)中水的添加量为蛋白粗提取质量的20倍，所述酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶或菠萝蛋白酶，所述酶的添加量为在每mg植物叶片蛋白粗提物水溶液中加入500～1000U，酶解条件为在40-65℃，pH 5.0～7.0 下水解2～6h。
优选的，步骤(6)中以0.1～0.5M HCl调节酶解产物的pH至3.0以下。
优选的，步骤(1)中所述的植物叶片为富含植物蛋白和多酚的植物。
进一步的，所述富含植物蛋白和多酚的植物为桑叶、茶叶或苋菜叶等富含植物蛋白和多酚的植物。
本发明具有以下优点：本发明旨在提供一种从植物叶片中同步提取植物多酚和植物蛋白并制备植物蛋白水解肽的方法，该方法的最大优点在于将植物多酚与植物蛋白的提取结合在一起，简化了二者的提取工艺，操作简单，能耗较低，各种条件易于达到，可以有效节约生产成本；再加上原料来源广泛，适用于大规模生产。
具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明作进一步详细说明。
实施例1从桑叶中提取桑叶多酚和蛋白并制备桑叶蛋白肽
(1)向桑叶粉中加入10倍体积(w/v)预冷的10％的TCA/丙酮溶液(v/v)，充分震荡后置于-20℃静置过夜；
(2)将上述液体于4℃，4000r/m离心10分钟，分别收集沉淀和上清液；
(3)上清液于-0.1MPa，42℃进行真空减压浓缩，回收丙酮；
(4)将步骤(3)所得浓缩液利用X-5大孔树脂进行酚的吸附，先用蒸馏水洗掉TCA等杂质，再用洗脱液质量比为80:19:1的乙醇/水/浓盐酸(w/w/w)以 0.3mL/min的速度进行洗脱分离多酚；
(5)洗脱液再一次进行真空减压浓缩，去除乙醇，收集得到的桑叶多酚提取物；
(6)向步骤(2)离心后的沉淀中加入预冷的丙酮，4℃，4000rpm，5min，洗涤过程3次，去除TCA，收集沉淀，置于室温通风晾干，即为桑叶蛋白粗提物；
(7)将步骤(6)得到的蛋白粗提物溶于20倍体积的水中，按照蛋白浓度加入木瓜蛋白酶(每mg植物叶片蛋白粗提物水溶液中加入800U)，于55℃pH 6.0 下水解2h。
(8)以0.1M HCl调节上述溶液pH至3.0以下，离心，收集上清液为蛋白水解肽。
实施例2从茶叶中提取茶叶多酚和蛋白并制备茶叶蛋白肽
(1)向绿茶粉中加入5倍体积预冷的10％的TCA/丙酮溶液(v/v)，充分震荡后置于-20℃静置过夜；
(2)将上述液体于4℃，8000r/m离心6分钟，分别收集沉淀和上清液；
(3)上清液于-0.1MPa，42℃进行真空减压浓缩，回收丙酮；
(4)将步骤(3)所得浓缩液利用X-5大孔树脂进行酚的吸附，用蒸馏水洗掉TCA等杂质，再用洗脱液质量比为80:19:1的乙醇/水/浓盐酸(w/w/w)以0.3 mL/min的速度进行洗脱分离多酚；
(5)洗脱液再一次进行真空减压浓缩，去除乙醇，收集得到的茶叶多酚提取物；
(6)向步骤(2)离心后的沉淀中加入预冷的丙酮，4℃，4000rpm，5min，洗涤过程3次，去除TCA，收集沉淀，置于室温通风晾干，即为茶叶蛋白粗提物；
(7)将步骤(6)得到的蛋白粗提物溶于20倍体积的水中，加入碱性蛋白酶(添加量为在每mg植物叶片蛋白粗提物水溶液中加入800U)，于55℃，pH 8.0 下水解4h进行酶解；
(8)以0.5M HCl调节上述溶液pH至3.0以下，离心，收集上清液为蛋白水解肽。
实施例3从苋菜叶中提取苋菜多酚与蛋白并制备苋菜蛋白肽
(1)向苋菜粉中加入10倍体积的(w/v)预冷的10％的TCA/丙酮溶液 (v/v)，充分震荡后置于-20℃静置过夜；
(2)将上述液体于4℃，10000r/m离心5分钟，分别收集沉淀和上清液；
(3)上清液于-0.1MPa，42℃进行真空减压浓缩，回收丙酮；
(4)将步骤(3)所得浓缩液利用X-5大孔树脂进行酚的吸附，用蒸馏水洗掉TCA等杂质，再用洗脱液质量比为80:19:1的乙醇/水/浓盐酸(w/w/w)以0.3 mL/min的速度进行洗脱分离多酚；
(5)洗脱液再一次进行真空减压浓缩，去除乙醇，收集得到的苋菜叶多酚提取物；
(6)向步骤(2)离心后的沉淀中加入预冷的丙酮，4℃，4000rpm，5min，洗涤过程3次，去除TCA，收集沉淀，置于室温通风晾干，即为苋菜叶蛋白粗提物；
(7)将步骤(6)得到的蛋白粗提物加入20倍体积的水，加入菠萝蛋白酶(添加量为在每mg蛋白粗提物水溶液中加入1000U)，于55℃，pH 8.0下水解4h进行酶解；
(8)以0.2M HCl调节上述溶液pH至3.0以下，离心，收集上清液为蛋白水解肽。
实施例1-3所得提取液中总酚及总多肽的含量如下表1所示。
表1实施例1-3所得提取液中总酚及总多肽的含量
Figure BDA0002642300470000061
以上所述仅是本发明的非限定实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思和不做出创造性劳动的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种从植物叶片中同步提取植物多酚和植物蛋白并制备植物蛋白水解肽的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)选取植物叶片粉，加入预冷的1,1,1-三氯乙烷(TCA)/丙酮溶液，充分震荡后静置过夜；
(2)将静置过夜后溶液离心，分别收集沉淀和上清液；
(3)将步骤(2)的上清液先经过真空减压浓缩回收丙酮，所得浓缩液利用大孔树脂吸附，先用水洗去TCA，再采用洗脱液洗脱分离植物多酚，所得目标物经真空减压浓缩，即为植物多酚；
(4)向步骤(2)收集的沉淀中先加入预冷丙酮提取，然后洗涤去除TCA，收集沉淀，晾干，获得植物叶片蛋白粗提物；
(5)将植物叶片蛋白粗提物溶于水中，然后加入酶进行酶解；
(6)调节酶解产物的pH值，离心，收集上清液，即得植物蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的从植物叶片中同步提取植物多酚和植物蛋白并制备植物蛋白水解肽的方法，其特征是：步骤(1)中所述预冷的1,1,1-三氯乙烷(TCA)/丙酮溶液为提前置于-18～-20℃预冷4h；所述1,1,1-三氯乙烷(TCA)/丙酮溶液的用量为每g植物叶片粉中加入5～10mL体积百分含量为10％的1,1,1-三氯乙烷(TCA)/丙酮溶液；充分震荡后于-18～-20℃静置过夜。
3.根据权利要求1所述的从植物叶片中同步提取植物多酚和植物蛋白并制备植物蛋白水解肽的方法，其特征是：步骤(2)中离心条件为4℃，4000～10000r/m，5～10min。
4.根据权利要求1所述的从植物叶片中同步提取植物多酚和植物蛋白并制备植物蛋白水解肽的方法，其特征是：步骤(3)中真空减压浓缩的条件控制在35～42℃，-0.1MPa。
5.根据权利要求1所述的从植物叶片中同步提取植物多酚和植物蛋白并制备植物蛋白水解肽的方法，其特征是：步骤(3)中所述大孔树脂为X-5大孔树脂。
6.根据权利要求1所述的从植物叶片中同步提取植物多酚和植物蛋白并制备植物蛋白水解肽的方法，其特征是：步骤(3)中所述洗脱液是质量比为80：19：1的乙醇/水/浓盐酸混合溶液，其中浓盐酸的质量百分含量为36～38％，洗脱速率为0.3mL/min。
7.根据权利要求1所述的从植物叶片中同步提取植物多酚和植物蛋白并制备植物蛋白水解肽的方法，其特征是：步骤(4)中所述预冷丙酮为在-18～-20℃预冷4h；步骤(4)洗涤去除TCA的过程为在4℃、4000rpm的条件下洗涤5min，洗涤过程不少于3次。
8.根据权利要求1所述的从植物叶片中同步提取植物多酚和植物蛋白并制备植物蛋白水解肽的方法，其特征是：步骤(5)中水的添加量为粗蛋白质量的20倍，所述酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶或菠萝蛋白酶，所述酶的添加量为500～1000U/mg蛋白粗提物，酶解条件为在40～65℃，pH 5.0～7.0下水解2～6h。
9.根据权利要求1所述的从植物叶片中同步提取植物多酚和植物蛋白并制备植物蛋白水解肽的方法，其特征是：步骤(6)中以0.1M～0.5M HCl调节酶解产物的pH至3.0以下。
10.根据权利要求1所述的从植物叶片中同步提取植物多酚和植物蛋白并制备植物蛋白水解肽的方法，其特征是：步骤(1)中所述的植物叶片为富含多酚及蛋白的植物，所述富含多酚及蛋白的植物为桑叶、茶叶或苋菜叶。
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