CN101245342B - 一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶方法 - Google Patents

一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物工程中酶化学，更具体地说，它是应用一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶工艺，其主要技术在于是人源SOD工程菌发酵扩增，离心收集菌体，复合破碎，梯度升温，离心收集上清液、过滤、超滤、冻干，本发明省去生物工程传统制取工艺中的抽提、离子交换、分子筛柱层析等分离、纯化工序。生产流程大大缩短，每生产一次可节约时间30小时，生产成本降低30％，人源SOD产品比活≥10000u/mg(prot)。基因重组人源SOD可广泛应用在药品、保健品、化妆品、酒品、牙膏等SOD产品中。

Description

一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶方法
技术领域
本发明涉及一种生物工程中酶化学，更具体地说，它是应用一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶方法。
背景技术
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)简称SOD，是一种含金属离子的新型酶制剂，广泛分布于各种生物体内，几乎从动物到植物，都有它的存在。被国际公认为是清除氧化自由基(也称游离基)的特效的酶，人体在正常的新陈代谢或各种激情况下，会产生大量有氧元素的自由基，称为超氧自由基。超氧自由基在人体的过度聚集能加速细胞的衰老和降低机体的免疫功能，甚至诱发肿瘤。SOD则能促使超氧自由基分解，因为作为有害物质的超氧阴离子在SOD的作用下和氢离子反应，生成另一种物质——过氧化氢；过氧化氢又在过氧化氢酶的作用下和氢离子反应，最终生成了一种对人体无害的物质——水，从而消除其对人体的损害，它在一定程度上有防止肿瘤发生、抗衰老、提高机体免疫力的作用，因而被用于某些急性炎症、自身免疫性疾病、营养缺乏、肿瘤等的辅助治疗。
1969年Mcord和Fridvich从牛血发现并提取出超氧化物歧化酶以来，SOD的生产取得了重在进展。目前，生产SOD大体上有二种方法，第一方法是传统方法，从动物血中提取SOD，由于血制品SOD存在外源感染的危险性和非人源制品SOD用于人体有抗原性，在医疗中很难发挥作用，而且成本高，原料来源有限，欧洲从1999年就禁止长期用于人体上；第二种方法是植物中提取SOD，虽然可以消除病毒、外源性污染等弊端，但由于植物中SOD含量低，很难实现工业批量生产。上述提取SOD生产流程，都是采用传统方法中的抽提、离子交换、分子筛等分离、纯化工序，提取过程复杂，收率低。目前，尚未发现把当代生物科学技术应用到SOD产业中，采用一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶方法，基因重组生产SOD是当含世界最前沿技术，基因重组生产SOD具有无外源性污染、无免疫排斥、无蛋白种属差异、无病毒残存，且纯度高、活性高，最适于人体，是SOD产业从技术到质量上的一次革命。
发明内容
本发明的目的是克服现有提取SOD技术中的不足，提供一种具有无外源性污染、无免疫排斥、无蛋白种属差异、无病毒残存，且纯度高、活性高的一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶方法，更好地发挥SOD对疾病的预防、治疗作用。
本发明提出的一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶方法，其主要技术在于：
一、温控分泌型人源SOD菌种，应用基因重组技术将PRPL启动子和STII信号肽及人SOD基因克隆至PBR322中，构建了分泌型表达质粒PBV/STII/SOD。此质粒带有温控型启动子PRPL，带有STII信号肽，使所表达的外源蛋白以可溶形式分泌到细胞周基质中，给外源蛋白的进一步纯化带来方便。将构建的分泌型表达质粒，转化到大肠杆菌W3110，获得重组人源铜锌超氧化物歧化酶菌种。
超氧化物歧化酶温控分泌型菌种构建，见附图。
二、工程发酵培养
1、菌种筛选方法
划线培养→试管培养→挑单菌落→小试表达→扩增培养→生产用菌
2、种子液的制备
a.取冻存菌种1支，用接种环取小量菌种在LB平皿上划线，(LB培养液的制备：蛋白胨56g，酵母粉28g，NaCl56g，溶液5.6L)30℃培养20-24小时。
b.挑取单菌落接种于LB培养基试管中，30℃，150-180转/分，培养10-15小时，待OD值达18-20，接种于发酵罐中。
3、发酵罐培养
a、采用改良的M9培养基，(M9培养基的的制备：80L发酵罐中蛋白胨800g，酵母粉500g，NaHPO4320g，KH2PO4110g，NaCl100g，NH4Cl70g，MgSo413.4g，CaCl20.5g，CuSo410g，ZnSo40.5g，葡萄糖600g。)。
b.发酵罐空消：条件121℃，30分钟。
4、接种，将单独灭菌的罐培养基分份注入罐内，在灭菌条件下，保护种子液接入发酵罐中。
5、培养
a.诱导培养前，每小时检测一次OD值，并做镜检观察菌形。
b.通过转数和通气量来控制溶氧值。
c.当罐内菌液OD600值为3.0时进行升温热诱导，诱导温度42℃。
d.诱导后继续培养二个半小时，出罐。
三、离心收集菌体
在GQ-105离心机上进行。
四、复合破碎
菌体破碎是纯化方法中重要的一环。本发明方法采用复合破碎法：冻融与均质法(或超声波破碎法)相结合，冻融从室温降至-15℃--20℃，温度下降梯度为10℃/小时之后等温冷冻，破碎之前融化。采用均质法两级破碎：一级800bar，二级200bar，酶液1∶3稀释，破碎率达95％以上。
五、复合收取上清液
复合破碎虽然破碎率达95％以上，但离心收集上清液困难。本发明方法将破碎液升温，升温梯度为20℃/小时，升温至50℃，等温数十分钟，再将酶液离心上清，效果极为良好，原酶液杂质及各种杂质蛋白为8.4mg/ml，上清液降到2.3-3.5mg/ml，活力回收率达130％，为精纯方法奠定了简化的重要基础。
六、过滤
本发明方法过滤采用网眼为0.5μm，0.2μm，双滤心过滤。
七、超滤
本发明方法采用双超滤网10KD、100KD超滤，超滤后活性达6-10万U/ml，损失率＜10％。
八、冻干
根据需要的活性要求，进行稀配，除盐、除菌冻干。
检测：根据国家标准GB/T5009.171-2003《超氧化物歧化酶活性的测定》
本发明与现有技术相比其积极有益效果是：(1)方法简化、产量高，单位成本低，可实现工业化生产；(2)无外源性污染、无免疫排斥、无蛋白种属差异、无病毒残存，且纯度高、活性高；(3)用途广泛，它在一定程度上有防止肿瘤发生、抗衰老、提高机体免疫力的作用，因而被用于某些急性炎症、自身免疫性疾病、营养缺乏、肿瘤等的辅助治疗，也可应用到化妆品食品、保健品等领域；(4)在防辐射等方面也已进入临床试验阶段。
附图说明
图1，是本发明-步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶方法，超氧化物歧化酶温控分泌型菌种构建。
具体实施方式
下面结合实例，对本发明作的方法作进一步详细描述。
实施例：
本方法在100L发酵罐实施应用。
1、种子液的制备
1)取冻存工程菌(PBV/STII/SOD)一支，用接种环取小量菌种在LB平皿上画线，在30℃条件下培养24小时。
2)挑取单菌落接种取LB培养基试管中(LB培养液：蛋白胨56g，酵母粉28g，NaCl56g，定溶5.6L)灭菌后，加入微量的氨苄，放入恒温摇床培养30℃，170转/分培养10-24小时，OD600为0.4-0.6时接入发酵罐。
2、发酵罐培养
1)发酵液采用改良的M9培养基(M9培养基的制备：80L发酵罐中蛋白胨800g，酵母粉500g，NaHPO4320g，KH2PO4110g，NaCl 100g，NH4Cl70g，MgSo413.4g，CaCl20.5g，CuSo410g，ZnSo40.5g，葡萄糖600g。)
2)发酵罐灭菌之后，将配制好的发酵液倒入罐中，升温至121℃，保温30min，冷水降温至所需温度。
3)灭菌接入扩增菌种，加入适量氨苄，30℃培养。当OD值为0.5-0.8时进行补料(葡萄糖)，当OD值为2.0-3.0时补Cu2+，Zn2+，进行升温至42℃，保温2小时后下罐。
3、离心收集菌体，在16000转/分立式离心机上离心收集菌体。
4、收集目的蛋白粗酶液。
经复合破碎(冻融与均质法破碎)，菌体破碎率达95％以上，再经梯度升温，离心提取粗酶液，活力回收率达130％。
5、目的蛋白纯化：
目的蛋白粗酶液经双网过滤、双网超滤，目的蛋白必要时可增加梯度升温处理，活性达6-10万u/ml，比活≥10000U/mg(prot)。
6、冻干
根据需要，稀配除盐、灭菌、冻干。
本发明的方法，100L发酵罐SOD活性达(6000万-1亿)U，冻干粉活性3500U/mg，每罐蛋白量达10g，活性收率达50-70％，比活＞10000u/mg(prot)，目的蛋白人源铜、锌超氧化歧化酶其分子量为32KD。生产成本降低30％，每生产一次可节约时间30-40小时。

Claims (4)

1.一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶方法其特征在于：
(一)温控分泌型人源SOD菌种
将PRPL启动子和STII信号肽及人源SOD基因克隆至PBR322中，构建了分泌型表达质粒PBV/STII/SOD，此质粒带有温控型启动子PRPL，带有STII信号肽，使所表达的外源蛋白以可溶形式分泌到细胞周基质中，将构建的分泌型表达质粒，转化到大肠杆菌W3110，获得重组人源铜锌超氧化物歧化酶菌种；
(二)工程发酵培养
(1)菌种筛选方法
划线培养→试管培养→挑单菌落→小试表达→扩增培养→生产用菌
(2)种子液的制备
a.取冻存菌种PBV/STII/SOD1支，用接种环取小量菌种在LB平皿上划线，在30℃培养24小时；
b.挑取单菌落接种于LB培养基试管中，30℃，摇床170转/分，培养30小时，
(3)、发酵罐培养
a.采用改良的M9培养基，所述改良M9培养基的制备为80L发酵罐中蛋白胨800g，酵母粉500g，NaHPO4320g，KH2PO4110g，NaCl100g，NH4Cl70g，MgSo413.4g，CaCl20.5g，CuSo410g，ZnSo40.5g，葡萄糖600g，
b.发酵罐空消：在条件121℃，30分钟，
(4)、接种，将单独灭菌的罐培养基分份注入罐内，在灭菌条件下，保护种子液接入发酵罐中，
(5)、培养
a.诱导培养前，每小时检测一次OD值，并做镜检观察菌形，
b.通过转数和通气量来控制溶氧值，
c.当罐内菌液OD600值为3.0时进行升温热诱导，诱导温度控制在42℃，
d.诱导后继续培养二个半小时，出罐，
(三)、离心收集菌体，在GQ-105离心机上进行，
(四)、采用复合破碎法：冻融与均质法或超声波破碎法相结合，冻融从室温降至-15℃，温度下降梯度为10℃/小时之后等温冷冻，破碎之前融化，采用均质法两级破碎：一级800bar，二级200bar，酶液1∶3稀释，破碎率达95％以上；
(五)、复合收取上清液
复合破碎菌体破碎率达95％以上，升温梯度为20℃/小时，升温至50℃，等温数十分钟后，再将酶液离心上清，原酶液杂质及各种杂质蛋白为8.4mg/ml，上清液降到2.3-3.5mg/ml，活力回收率达130％，
(六)、过滤，过滤采用网眼为0.5μm，0.2μm，双滤心过滤，
(七)、超滤采用双超滤网10KD、100KD超滤，超滤后活性达6-10万U/ml，损失率＜10％，
(八)、冻干根据需要的活性要求，进行稀配，除盐、灭菌、冻干。
2.根据权利要求1所述的一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶方法，其特征在于：100L发酵罐SOD活性达6000万-1亿U，冻干粉活性3500U/mg，每罐蛋白量达10g，活性收率达50-70％，比活＞10000u/mg。
3.根据权利要求1所述的一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶方法，其特征在于：目的蛋白人源铜、锌超氧化歧化酶其分子量为32KD。
4.一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶方法，其特征在于：LB培养液的制备：蛋白胨56g，酵母粉28g，NaCl56g，定溶5.6L制成的。
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