CN103627683A - 一种重组人源超氧化物歧化酶的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组人源超氧化物歧化酶的生产方法。属于生物工程技术领域。该方法利用铜盐热变性除去大部分杂蛋白，离心后经过微滤除菌及杂质，利用超滤进行浓缩、除盐及小分子杂蛋白，阴离子交换层析纯化后，冷冻干燥，超氧化物歧化酶的纯度可达到92％，活性为3170U/mg。本发明在分离过程中未使用有机溶剂，避免了有机溶剂引起的蛋白质变性，操作简单，成本低廉，适于工业生产。

Description

一种重组人源超氧化物歧化酶的生产方法
(一)技术领域
本发明涉及一种重组人源超氧化物歧化酶的生产方法，属于生物工程技术领域。 
(二)背景技术
超氧化物歧化酶(SOD)能及时有效地清除机体内的超氧自由基，使生物体能够避免氧化损伤，是生物体抵御活性氧毒害作用的第一道防线，具有抗辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症等功能。目前SOD酶已作为一种保健医药产品广泛应用于医药、食品、饮料、化妆品等行业，具有非常广阔的市场。 
市场上流通的SOD大多是从动物血液中提取的，容易受到污染，产生细菌内毒素，引起热源性问题，研制开发重组人超氧化物歧化酶不仅可解决人源SOD来源有限和因血制品污染而带来的安全性问题，而且可避免异源SOD在临床应用时可能出现的免疫性过敏反应。传统的SOD纯化方法较繁琐且费时费力，SOD产率较低、生产成本昂贵，不利于大规模的工厂化生产。因此开发其他更安全、更经济的提取或分离方法取代传统SOD生产方法具有十分重要的意义。本发明将含有人源SOD基因的工程菌进行发酵表达，高压匀质破碎后进行热变性，离心超滤后进行层析，克服了以现有技术存在的缺陷，可满足工业化生产的需要。 
(三)发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单，适用于工业化生产的重组人源超氧化物歧化酶的生产方法。 
(四)技术方案 
本发明涉及一种重组人源超氧化物歧化酶的生产方法。属于生物工程技术领域。该方法利用铜盐热变性除去大部分杂蛋白，离心后经过微滤除菌及杂质，利用超滤进行浓缩、除盐及小分子杂蛋白，阴离子层析纯化后，冷冻干燥。操作简单，成本低廉，适用于工业生产。 
具体操作步骤为： 
(1)将含有人源超氧化物歧化酶基因的大肠杆菌进行发酵，发酵液用管式离心机离心，转速：16000r/min，流速：0.6-0.8mL/min，收集菌体，按照菌体湿重与纯水体积1∶10比例悬浮，用高压匀质机破碎，破碎压力为880bar，破碎一次； 
(2)在破碎后混合液中加入2％-6％体积的10mmol/L的CuCl2溶液，通入螺旋管加热器中进行热变性，热变性温度65-80℃，时间：10-30min。离心，收集上清； 
(3)膜处理，将步骤2所得上清液依次通过5μm的预处理膜、0.22μm滤膜、6kDa超滤膜； 
(4)DEAE-SephadexA50柱层析，用2.5-50mmoL/L的pH 7.6的磷酸钾盐缓冲液进行 梯度洗脱，收集具有SOD活力的洗脱液，超滤浓缩后，冷冻干燥，用邻苯三酚自氧化法测定SOD活性。 
附图说明：
图1是本发明实施例1中CuCl2浓度对SOD活性影响的示意图； 
图2是本发明实施例2中热变性温度及时间对SOD活性的影响的示意图。 
(四)具体实施方式
下面通过具体实例应用，对本发明的技术方案进行进一步的说明。 
实施例1： 
将60L发酵液用管式离心机离心，转速：16000rpm，流速0.6-0.8mL/min，收集发酵后的菌体，按照菌体湿重与纯水体积1∶10比例悬浮，用高压匀质机破碎，破碎压力为880bar，破碎一次。在破碎后混合液中分别加入2％、3％、4％、5％、6％体积的10mmol/L的CuCl2后通入螺旋管加热器中，65℃，20min。离心后，弃去沉淀。上清液进行膜处理，首先通过5μm预处理膜除去杂质，细胞碎片；然后过0.22μm滤膜，除去杂菌；最后用6kDa的超滤膜进行处理，除盐及小分子杂蛋白，浓缩至15L。浓缩液进行DEAE-SephadexA50柱层析，用2.5-50mmoL/L的pH 7.6的磷酸钾盐缓冲液进行梯度洗脱，收集具有SOD活力的洗脱液，超滤浓缩后，将所得溶液冷冻干燥得到SOD精品。从图1中可以看出SOD活性可达到2700U/mg以上。 
实施例2： 
将60L发酵液用管式离心机离心，转速：16000rpm，流速：0.6-0.8mL/min，收集发酵后的菌体，按照菌体湿重与纯水体积1∶10比例悬浮，高压匀质机破碎，破碎压力为880bar，破碎一次。在破碎后混合液中加入5％体积的10mmol/L的CuCl2后通入螺旋管加热器中，设置温度为65℃、70℃、75℃、80℃，控制蠕动泵速度，使其从进到出时间分别控制为10min、15min、20min、25min、30min，离心后，弃去沉淀。上清液进行膜处理，首先通 过5μm预处理膜除去杂质，细胞碎片；然后过0.22μm滤膜，除去杂菌；最后用6kDa的超滤膜进行处理，除盐及小分子杂蛋白，浓缩至15L。浓缩液进行DEAE-Sephadex A50柱层析，用2.5-50mmoL/L的pH 7.6的磷酸钾盐缓冲液进行梯度洗脱，收集具有SOD活力的洗脱液，超滤浓缩后，将所得溶液冷冻干燥得到SOD精品。从图中看出热变性温度为70℃，时间为15min时，SOD活性最高为3170U/mg。 
实施例3： 
将60L发酵液用管式离心机离心，转速：16000rpm，流速0.6-0.8mL/min：收集发酵后的菌体，按照菌体湿重与纯水体积1∶10比例悬浮，高压匀质机破碎，破碎压力为800bar，破碎一次。在破碎后混合液中加入5％体积的10mmol/L的CuCl2后通入螺旋管加热器中，设置温度为70℃，控制蠕动泵速度，使其从进到出时间在15min，离心后，弃去沉淀。上清液进行膜处理，首先通过5μm预处理膜除去杂质，细胞碎片；然后过0.22μm滤膜，除去杂菌；最后用6kDa的超滤膜进行处理，除盐及小分子杂蛋白，浓缩至15L。浓缩液进行分别用DEAE-32和DEAE-Sephadex A50柱层析，用2.5-50mmol/L的pH 7.6的磷酸钾盐缓冲液进行梯度洗脱，收集具有SOD活力的洗脱液，超滤浓缩后，将所得溶液冷冻干燥得到SOD精品。活性可达到3170U/mg，纯度92％以上。 
层析纯化效果比较 
Figure BSA00000770594200032
实施例4： 
本发明应用于基因重组人源SOD的生产，将具体操作步骤简述如下： 
将60L发酵液用管式离心机离心，转速：16000rpm，流速0.6-0.8mL/min：收集发酵后的菌体，按照菌体湿重与纯水体积1∶10比例悬浮，高压匀质机破碎，破碎压力为800bar，破碎一次。在破碎后混合液中加入5％体积的10mmol/L的CuCl2后通入螺旋管加热器中，设置温度为70℃，控制蠕动泵速度，使其从进到出时间在15min，离心后，弃去沉淀。上清液进行膜处理，首先通过5μm预处理膜除去杂质，细胞碎片；然后过0.22μm滤膜，除去杂菌；最后用6kDa的超滤膜进行处理，除盐及小分子杂蛋白，浓缩至15L。浓缩液进行DEAE-Sephadex A50柱层析，用2.5-50mmoL/L的pH 7.6的磷酸钾盐缓冲液进行梯度洗脱，收集具有SOD活力的洗脱液，超滤浓缩后，将所得溶液冷冻干燥得到SOD精品。SOD活性最高为3170U/mg，纯度为92％。 

Claims (4)

1.一种重组人源超氧化物歧化酶的生产方法。将发酵后的菌体高压匀质破碎，热变性后离心取上清、微滤及超滤浓缩、层析超滤浓缩，冷冻干燥得到超氧化物歧化酶产品。
2.根据权利要求1所述的一种重组人源超氧化物歧化酶的生产方法，其特征在于：热处理时加入5％体积的10mmol/L的CuCl2溶液，热变性温度和时间分别为：70℃，15min。
3.根据权利要求1所述的一种重组人源超氧化物歧化酶的生产方法，其特征在于：采用预5μm的柱子精密过滤，0.22μm的柱子微孔过滤、6kDa超滤膜超滤浓缩、除盐及杂蛋白。
4.根据权利要求1所述的一种重组人源超氧化物歧化酶的生产方法，其特征在于：利用DEAE-SephadexA50柱层析，用2.5-50mmol/L的pH＝7.6的磷酸钾盐缓冲液进行梯度洗脱，收集具有SOD活力的洗脱液，超滤浓缩后，冷冻干燥。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450635A (zh) * 2014-12-12 2015-03-25 邢台怡通生物科技有限公司 一种从酿酒酵母中提取纯化sod的方法
CN108486074A (zh) * 2018-04-03 2018-09-04 西北工业大学 一种利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法
CN110885800A (zh) * 2019-12-11 2020-03-17 宁波酶赛生物工程有限公司 一种工业用酶液的热处理澄清方法
CN111315874A (zh) * 2017-09-14 2020-06-19 北京泰德制药股份有限公司 一种重组人铜锌超氧化物歧化酶活性恢复的方法
CN113528301A (zh) * 2021-05-25 2021-10-22 合肥信达膜科技有限公司 一种酶妆品制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101245342A (zh) * 2007-02-15 2008-08-20 四平华科生物技术有限责任公司 一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶工艺
CN102628036A (zh) * 2012-03-19 2012-08-08 湖北奥彤生物制品科技有限公司 一种生产超氧化物歧化酶sod的除杂纯化新工艺

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101245342A (zh) * 2007-02-15 2008-08-20 四平华科生物技术有限责任公司 一步法制备基因重组人源铜、锌超氧化歧化酶工艺
CN102628036A (zh) * 2012-03-19 2012-08-08 湖北奥彤生物制品科技有限公司 一种生产超氧化物歧化酶sod的除杂纯化新工艺

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
范立强等: "重组人Mn-SOD 的发酵、纯化及抗氧化研究", 《2006第六届中国药学会学术年会论文集》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450635A (zh) * 2014-12-12 2015-03-25 邢台怡通生物科技有限公司 一种从酿酒酵母中提取纯化sod的方法
CN111315874A (zh) * 2017-09-14 2020-06-19 北京泰德制药股份有限公司 一种重组人铜锌超氧化物歧化酶活性恢复的方法
CN108486074A (zh) * 2018-04-03 2018-09-04 西北工业大学 一种利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法
CN110885800A (zh) * 2019-12-11 2020-03-17 宁波酶赛生物工程有限公司 一种工业用酶液的热处理澄清方法
CN113528301A (zh) * 2021-05-25 2021-10-22 合肥信达膜科技有限公司 一种酶妆品制备方法

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