CN103772086B

CN103772086B - 一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺

Info

Publication number: CN103772086B
Application number: CN201410011435.6A
Authority: CN
Inventors: 夏金梅; 许晨; 许建中; 廖云莉; 王伟毅; 林翌; 陈建明; 邵宗泽; 单大鹏
Original assignee: CHINA OCEAN MINERAL RESOURCES R&D ASSOCIATION; Third Institute of Oceanography SOA
Current assignee: CHINA OCEAN MINERAL RESOURCES R&D ASSOCIATION; Third Institute of Oceanography SOA
Priority date: 2014-01-10
Filing date: 2014-01-10
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2034-01-10
Also published as: CN103772086A

Abstract

本发明所述一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺，包括以下步骤：1）用物理方法直接对发酵液进行细胞破壁处理；2）破壁处理后的发酵液用管式离心机进行固液分离；或是破壁处理后的发酵液按比例添加入硫酸铝溶液，一定温度下搅拌后，对发酵液进行絮凝；3）采用碟片式膜过滤器过滤经离心固液分离的发酵液或是经硫酸铝絮凝的发酵液；4）滤过的发酵液用大孔树脂层析柱吸附富集小分子代谢产物；5）待滤过液过完柱后，用纯净水过柱；6）用含水有机溶剂洗脱吸附于大孔树脂载体上的小分子代谢产物。实现海洋微生物发酵液的快速过滤与浓缩，小分子代谢产物富集基本不损失，洗脱获得的小分子代谢产物浓缩后可直接用于色谱分离制备。

Description

一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺

技术领域

本发明涉及一种微生物代谢产物制备的前处理工艺，特别是一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺。

背景技术

海洋与陆地有着截然不同的生态环境，高盐、高压、缺氧、低温、寡营养等等，特殊生境来源的微生物，可能产生与陆源微生物完全不同的代谢产物，是发现化学结构新颖、生物活性多样的海洋生物新资源。大批量发酵海洋微生物，提取分离小分子代谢产物，建立小分子化合物馏分库，为海洋微生物代谢组分研究、药物活性筛选、指标性化合物的发现建立技术与物质基础，将是海洋微生物资源利用的重要方向。海洋微生物发酵液与陆源微生物发酵液有共同之处，发酵液的杂质十分复杂，菌丝体、破碎的细胞碎片、残留培养基、代谢产生的蛋白、多糖、胶体、色素等等大分子物质，对低浓度的小分子代谢产物的富集、分离、制备会产生严重不良影响，造成目标产物获取效率低下、损失严重。

发酵液的预处理，其主要目的就是通过对发酵液进行适当处理，除去干扰代谢产物提取分离的大分子杂质，从大量的发酵液中高效提取出代谢产物，减轻后道制备工序的压力，提高生产效率。目前已有多件发明专利针对特定的微生物代谢产物的提取制备，提出对发酵液的预处理方法。发明专利96119252.6公开了一种改进发酵液处理的方法，微生物发酵液先调pH至1~4.5，加入聚合物絮凝剂聚乙酰亚胺或聚丙烯酸钠，加热发酵液至110~200℃，而后经膜过滤处理。该方法可除去发酵液中的细胞，膜过滤的通透率可提高1.5~20倍。发明专利02112208.3公开了一种细菌发酵液预处理方法，发酵液破壁后调pH至8~13，加入0.5~20%阴离子表面活性剂，搅拌5~60min后离心、压滤、真空抽滤，可以快速的除去发酵液中的菌丝体。发明专利88107257.5公开了一种多糖发酵液的预处理方法，多糖发酵液先用10000至100000之间的滤膜进行超滤，而后加一倍体积的水或盐水于截留液中，加热至60~110℃，再次用醋酸纤维膜超滤，过滤性优良。发明专利201310237976.6公开了一种发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA—1的预处理方法。首先使发酵液蛋白失活，让乳酸球菌素PA—1释放，采用三级过滤，第一用板框过滤除菌和颗粒状杂质，第二用微滤膜微滤除去大分子杂质，第三用10000~30000道尔顿超滤膜超滤，除去大分子蛋白、核酸和胶体，再用截留分子量1000~3000道尔顿的超滤膜超滤除去小分子、杂质并浓缩。这种方法全程流体操作，劳动强度低，易于工业放大，不消耗有机溶剂，安全环保。发明专利201110052689.9公开了一种纯化荚膜多糖的预处理方法，荚膜细菌发酵液离心分离，超滤浓缩上清液，加入醋酸钠调pH，加入乙醇沉淀出杂质并分离出上清液，在上清液中加入蛋白酶酶解，超滤蛋白酶解液，在滤过液中加入十六烷基三甲基溴化铵和氯化钠，离心分离，收集的沉淀用注射水复溶，复溶液再经过超滤、膜过滤得到纯化多糖。发明专利200610011694.4公开了一种对荚膜细菌发酵液过滤预处理方法，采用先pH1~3酸、后pH11~14的碱处理发酵液，使得菌体表面的荚膜水解，再加温发酵液至70~100℃继续水解，该方法可以除去荚膜的菌体细胞，减轻菌体颗粒可塑性，降低发酵液粘度。发明专利201310318698.7公开了一种雷莫拉宁发酵液的纯化方法，调发酵液pH至4~5，沉淀、离心分离，滤饼用70%乙醇溶液浸提，合并滤液和萃取液，用超滤膜过滤，截留分子量为10000，除去发酵液中的大分子物质，最后用凝胶色谱法分离雷莫拉宁。该方法可保证产品的总收率，而且纯度得到大幅度提升。发明专利201310138205.1公开了一种青霉素发酵液的处理工艺，发酵液在密闭式陶瓷错流过滤系统中过滤，收集滤液，在截留液中加入原始发酵液重量2倍的水进行透析，透析液用纳滤膜浓缩，重复加入原始发酵液重量2倍的水再透析，透析液再纳滤膜浓缩，合并两次滤液用于后道工序的处理。发明专利201310188300.2公开了一种可用于细菌发酵液预处理的菌株产絮凝剂及其制备和应用的方法，利用微生物菌株Pannonibacter phragmitetus B7 发酵培养，培养的发酵液6000~10000rpm下离心分离30分钟，去除菌体，发酵液中加入2~4倍体积的无水乙醇静置过夜，离心分离、干燥得到絮状剂。该絮凝剂可以用于大肠杆菌或枯草芽孢杆菌发酵液的预处理中。发明专利201010583693.3公开了一种柠檬酸发酵液过滤澄清的方法，发酵液中加入聚丙烯酸钠或聚丙烯酰胺絮凝剂，磷矿粉或硫酸钙助滤剂，进行发酵液的絮凝，板框压滤。在滤液中加入聚合氯化铝或聚合硫酸铝为絮凝剂，硅藻土或珍珠岩为助滤剂，板框压滤，可获得浊度小于5的澄清发酵液。发酵液自身质量得到明显提升，其内在的胶体、蛋白及其它杂质含量也明显减少，大大减轻了后续工序的提取分离压力。

从以上专利可见，发酵液预处理，可以明显降低发酵液中菌体细胞、大分子杂质的含量、降低液体粘度使其易于过滤，并提高后道工序的处理效率。公开的发明专利的预处理方法有高分子絮凝剂絮凝法、乙醇沉淀法、加热絮凝方法；酶解蛋白法；离心过滤法、板框压滤法、超滤或微滤过滤法，或两种上述方法的联用，是针对发酵液中某一组分的提取而应用的预处理方法。海洋微生物发酵液与陆源微生物发酵液略有不同，含盐量较高，体积小的细菌占绝大多数，高分子絮凝法、乙醇沉淀法、酶解蛋白法预处理效果不佳；以获得活性小分子代谢产物为目的的提取，加热絮凝法易破坏活性物质；单纯的离心过滤法对影响柱吸附的可溶性大分子的去除率较低，达不到预处理的目的。

发明内容

本发明的目的，是要提供一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺，针对大批量海洋微生物发酵液的预处理，特别是经细胞破碎后的高粘度发酵液，提供一种适合大多数不同海洋微生物发酵液的快速预处理方法，截留除去菌体细胞、培养基、蛋白、多糖，保留次级代谢产物，采用高价无机盐破坏发酵液胶体稳定性，耦合碟片式超滤膜超滤除大分子团聚颗粒，大孔树脂柱层析富集小分子化合物，实现海洋微生物发酵液的快速过滤与浓缩，小分子代谢产物富集基本不损失，大体积滤液快速排出，无需蒸发浓缩，节能节耗，洗脱获得的小分子代谢产物浓缩后可直接用于色谱分离制备。

本发明是这样实现的，所述一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺，包括以下步骤：

1）用物理方法直接对发酵液进行细胞破壁处理，依不同的菌种种类调节破壁压力；

2）破壁处理后的发酵液用管式离心机进行固液分离；或是破壁处理后的发酵液按比例添加入硫酸铝溶液，一定温度下先快速搅拌而后慢速搅拌，对发酵液进行絮凝；

3）采用碟片式膜过滤器过滤经离心固液分离的发酵液或是经硫酸铝絮凝的发酵液；

4）滤过的发酵液用大孔树脂层析柱吸附富集小分子代谢产物；

5）待滤过液过完柱后，用纯净水过柱，洗去残留于层析柱中的盐、色素、残余蛋白和糖等杂质；

6）用含水有机溶剂洗脱吸附于大孔树脂载体上的小分子代谢产物；

7）洗脱液经浓缩后即为可用于小分子代谢产物色谱制备的浸膏。

本发明步骤1）所述的细胞破壁处理是采用均质机细胞破碎法，不同的菌种中，海洋细菌细胞破壁压力大于600 bar，最好大于700bar，海洋放线菌细胞破壁压力大于1000 bar，最好大于1200bar。

本发明步骤2）中所述的硫酸铝水溶液浓度为5～20%，最好是5~10%，控制添加比例使硫酸铝的终含量在50～500ppm，最好是100~300ppm；所述的搅拌方式为手动搅拌或机械搅拌，所述的快速搅拌为大于100转/分，所述的慢速搅拌为小于50转/分；所述的絮凝，其温度为25~45℃。

本发明步骤3）中所述采用碟片式膜过滤器，其截留分子量为5000~12000，最好是8000~10000；所述的离心固液分离是连续流离心分离，其转速12000~20000转/分，最好是15000~20000转/分。

本发明步骤4）中所述的大孔树脂层析柱为低压层析柱，大孔树脂载体为苯乙烯系大孔树脂、丙烯酸系大孔树脂、以及它们的官能团改性大孔树脂；所述的层析柱采用单柱或串联双柱模式，最好是不同性质载体的串联双柱模式。如：苯乙烯-二乙烯基苯共聚大孔树脂层析柱、苯乙烯-二乙烯基苯共聚大孔树脂和聚二乙烯基苯大孔吸附树脂串联层析柱、苯乙烯系大孔吸附树脂和丙烯酸系大孔吸附树脂双层析柱串联、氯化苯乙烯-二乙烯基苯共聚大孔树脂层析柱、苯乙烯-二乙烯基苯共聚大孔树脂层析柱和互贯网苯乙烯-二乙烯基苯共聚大孔树脂层析柱（双柱串联）、苯乙烯-二乙烯基苯共聚大孔树脂层析柱和改性苯乙烯-二乙烯基苯共聚大孔树脂层析柱（双柱串联）。

本发明步骤5）中所述的纯净水为蒸馏水、去离子水、反渗透水、超纯水；所述纯净水过柱的体积为2~10倍柱床体积，最好是2~5倍柱床体积。

本发明步骤6）中所述的含水有机溶剂为甲醇水溶液、乙醇水溶液、丙酮水溶液或其中的两种到三种的组合；含水有机溶剂浓度为5~100%；所述的洗脱方式是分级等度洗脱和梯度洗脱；所述分级等度洗脱是20%、40%、60%、80%、100%含水有机溶剂依次洗脱，最好是20%、50%、100%三个浓度等级等度洗脱，洗脱体积为层析柱床的1~10倍，最好是2~5倍；所述的梯度洗脱是5%-100%的含水有机溶剂连续梯度洗脱，洗脱体积为层析柱床的1倍至8倍，最好是2~4倍。

本发明步骤7）中所述的洗脱液经浓缩为低温减压浓缩，蒸发温度为25~100℃，最佳蒸发温度为35～45℃，真空度为：5～95kPa，最佳真空度为5～25 kPa，冷凝温度为1～20 ℃，最佳冷凝温度为5～10 ℃；所述的洗脱液的浓缩装置为真空旋转蒸发浓缩仪或刮膜式真空浓缩仪或真空浓缩仪。

本发明的有益效果是，提出一种无机小分子絮凝剂、超滤膜过滤、大孔树脂柱层析富集耦合的海洋微生物发酵液的预处理工艺，一种以硫酸铝作为电荷捕获、架桥剂，打破由破碎的海洋微生物菌体碎片、蛋白、多糖等组成的稳定胶体体系，使悬浮的菌体细胞碎片、蛋白、多糖、胶体、色素等物质聚集团聚，有效降低胶体物质分散程度的方法；一种耦合了离心或碟片式超滤膜对发酵液中团聚杂质有效隔离除去的发酵液的快速过滤的方法；一种耦合了大孔树脂柱层析富集，从大体积膜过滤液中高效富集小分子化合物的方法。本发明适合于大多数不同海洋微生物发酵液的大批量预处理，滤速快，可完全截留除去菌体细胞碎片，蛋白去除率达90%以上，总糖去除率达 80%以上，滤液透光率达89%，小分子代谢产物富集高效，大体积滤液可快速分离除去，实施简便高效。

具体实施方式

下面结合六个实施例对本发明再作详细说明。

实施例1：取一株海洋细菌（伸长盐单胞菌）发酵液15L，在750 bar下使用均质机对细胞进行破碎。向破壁处理后的发酵液中加入10%的硫酸铝溶液30 ml，40℃下先快速搅拌再慢速搅拌，对发酵液进行絮凝。采用碟片式膜过滤器过滤发酵液，截留分子量为9000。滤过的发酵液过苯乙烯-二乙烯基苯共聚大孔树脂层析柱吸附富集小分子代谢产物。待滤过液过完后，先用2.5倍柱床体积的去离子水洗柱，再依次用20%、40%、60%的甲醇水溶液对层析柱进行洗脱，洗脱体积分别为层析柱床的2倍、3倍和2倍。收集上述洗脱液，使用真空旋转蒸发浓缩仪进行减压浓缩，蒸发温度为35℃，真空度为10kPa，冷凝温度为5℃，得到可用于小分子代谢产物色谱制备的浸膏52.0g。

实施例2：取一株海洋细菌（达氏拟诺卡氏菌）发酵液50L，在700 bar下使用均质机对细胞进行破碎。向破壁处理后的发酵液中加入20%的硫酸铝溶液25ml，40℃下先快速搅拌再慢速搅拌，对发酵液进行絮凝。采用碟片式膜过滤器过滤发酵液，截留分子量为9000。滤过的发酵液过苯乙烯-二乙烯基苯共聚大孔树脂和聚二乙烯基苯大孔吸附树脂串联层析柱吸附富集小分子代谢产物。待滤过液过完后，先用2倍柱床体积的去离子水洗柱，再依次用20%、40%、80%的乙醇水溶液对层析柱进行洗脱，洗脱体积分别为层析柱床的3倍、2倍和2倍。收集上述洗脱液，使用真空旋转蒸发浓缩仪进行减压浓缩，蒸发温度为38℃，真空度为10kPa，冷凝温度为5℃，得到可用于小分子代谢产物色谱制备的浸膏193.0 g。

实施例3：取一株海洋细菌（鲁氏不动杆菌）发酵液100L，在800 bar下使用均质机对细胞进行破碎。向破壁处理后的发酵液中加入15%的硫酸铝溶液100 ml，35℃下先快速搅拌再慢速搅拌，对发酵液进行絮凝。采用碟片式膜过滤器过滤发酵液，截留分子量为10000。滤过的发酵液过苯乙烯系大孔吸附树脂和丙烯酸系大孔吸附树脂双层析柱串联吸附富集小分子代谢产物。待滤过液过完后，先用2倍柱床体积的去离子水洗柱，再用甲醇和水的混合液对层析柱进行梯度洗脱，洗脱梯度为10~95%的甲醇水溶液以流速洗脱2个柱床体积，再用纯甲醇洗脱1个柱床体积。收集上述洗脱液，使用真空旋转蒸发浓缩仪进行减压浓缩，蒸发温度为40℃，真空度为15kPa，冷凝温度为5℃，得到可用于小分子代谢产物色谱制备的浸膏386.1 g。

实施例4：取一株海洋放线菌（浅紫链霉菌）发酵液15L，在1300 bar下使用均质机对细胞进行破碎。向破壁处理后的发酵液中加入20%的硫酸铝溶液15 ml，40℃下先快速搅拌再慢速搅拌，对发酵液进行絮凝。采用碟片式膜过滤器过滤发酵液，截留分子量为9000。滤过的发酵液过氯化苯乙烯-二乙烯基苯共聚大孔树脂层析柱吸附富集小分子代谢产物。待滤过液过完后，先用2.5倍柱床体积的去离子水洗柱，再依次用20%、40%、80%的甲醇水溶液对层析柱进行洗脱，洗脱体积分别为层析柱床的2倍、3倍和2倍。收集上述洗脱液，使用真空旋转蒸发浓缩仪进行减压浓缩，蒸发温度为40℃，真空度为10kPa，冷凝温度为5℃，得到可用于小分子代谢产物色谱制备的浸膏43.2g。

实施例5：取一株海洋放线菌（微单孢菌）发酵液50L，在1200 bar下使用均质机对细胞进行破碎。向破壁处理后的发酵液中加入15%的硫酸铝溶液40ml，45℃下先快速搅拌再慢速搅拌，对发酵液进行絮凝。采用碟片式膜过滤器过滤发酵液，截留分子量为10000。滤过的发酵液过苯乙烯-二乙烯基苯共聚大孔树脂层析柱和互贯网苯乙烯-二乙烯基苯共聚大孔树脂层析柱（双柱串联）吸附富集小分子代谢产物。待滤过液过完后，先用3倍柱床体积的去离子水洗柱，再依次用20%、50%、100%的甲醇水溶液对层析柱进行洗脱，洗脱体积分别为层析柱床的3倍、2倍和2倍。收集上述洗脱液，使用真空旋转蒸发浓缩仪进行减压浓缩，蒸发温度为42℃，真空度为10kPa，冷凝温度为5℃，得到可用于小分子代谢产物色谱制备的浸膏155.1 g。

实施例6：取一株海洋放线菌（红球菌）发酵液100L，在1150 bar下使用均质机对细胞进行破碎。发酵液用管式离心机进行连续流离心分离，转速为19000转/分。固液分离后的滤液采用碟片式膜过滤器过滤发酵液，截留分子量为11000。滤过的发酵液过苯乙烯-二乙烯基苯共聚大孔树脂层析柱和改性苯乙烯-二乙烯基苯共聚大孔树脂层析柱（双柱串联）吸附富集小分子代谢产物。待滤过液过完后，先用2.2倍柱床体积的去离子水洗柱，再用甲醇和水的混合液对层析柱进行梯度洗脱，洗脱梯度为10~95%的甲醇水溶液以流速洗脱3个柱床体积，再用纯甲醇洗脱2个柱床体积。收集上述洗脱液，使用真空旋转蒸发浓缩仪进行减压浓缩，蒸发温度为45℃，真空度为5kPa，冷凝温度为10℃，得到可用于小分子代谢产物色谱制备的浸膏325.0 g。

Claims

1.一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺，包括以下步骤：

2）破壁处理后的发酵液按比例添加入硫酸铝溶液，一定温度下先快速搅拌而后慢速搅拌；所述的快速搅拌为大于100转/分，所述的慢速搅拌为小于50转/分；对发酵液进行絮凝；

3）采用碟片式膜过滤器过滤经硫酸铝絮凝的发酵液；

5）待滤过液过完柱后，用纯净水过柱，洗去残留于层析柱中的盐、色素、残余蛋白和糖；

2.根据权利要求1所述一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺，其特征是：步骤1）所述的细胞破壁处理是采用均质机细胞破碎法，不同的菌种中，海洋细菌细胞破壁压力大于600 bar，海洋放线菌细胞破壁压力大于1000 bar。

3.根据权利要求2所述一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺，其特征是：海洋细菌细胞破壁压力大于700 bar；海洋放线菌细胞破壁压力大于1200 bar。

4.根据权利要求1所述一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺，其特征是：步骤2）中所述的硫酸铝水溶液浓度为5～20%，控制添加比例使硫酸铝的终含量在50～500ppm；所述的搅拌方式为手动搅拌或机械搅拌；所述的絮凝，其温度为25~45℃。

5.根据权利要求4所述一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺，其特征是：所述的硫酸铝水溶液浓度为5～10%；控制添加比例使硫酸铝的终含量在100~300ppm。

6.根据权利要求1所述一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺，其特征是：步骤3）中所述采用碟片式膜过滤器，其截留分子量为5000~12000。

7.根据权利要求6所述一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺，其特征是：所述采用碟片式膜过滤器，其截留分子量为8000~10000。

8.根据权利要求1所述一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺，其特征是：步骤4）中所述的大孔树脂层析柱为低压层析柱，大孔树脂载体为苯乙烯系大孔树脂、丙烯酸系大孔树脂、以及它们的官能团改性大孔树脂；所述的层析柱采用单柱模式或不同性质载体的串联双柱模式。

9.根据权利要求1所述一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺，其特征是：步骤5）中所述的纯净水为蒸馏水、去离子水、反渗透水、超纯水；所述纯净水过柱的体积为2~10倍柱床体积。

10. 根据权利要求9所述一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺，其特征是：所述纯净水过柱的体积为2~5倍柱床体积。

11. 根据权利要求1所述一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺，其特征是：步骤6）中所述的含水有机溶剂为甲醇水溶液、乙醇水溶液、丙酮水溶液或其中的两种到三种的组合；含水有机溶剂浓度为5~100%；所述的洗脱方式是分级等度洗脱；所述分级等度洗脱是20%、40%、60%、80%、100%含水有机溶剂依次洗脱，洗脱体积为层析柱床的1~10倍。

12.根据权利要求1所述一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺，其特征是：步骤6）中所述的含水有机溶剂为甲醇水溶液、乙醇水溶液、丙酮水溶液或其中的两种到三种的组合；含水有机溶剂浓度为5~100%；所述的洗脱方式是梯度洗脱；所述的梯度洗脱是5%~100%的含水有机溶剂连续梯度洗脱，洗脱体积为层析柱床的1倍至8倍。

13.根据权利要求11所述一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺，其特征是：所述分级等度洗脱是20%、60%、100%三个浓度等级等度洗脱，洗脱体积为层析柱床的2~5倍。

14.根据权利要求12所述一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺，其特征是：所述5%~100%的含水有机溶剂连续梯度洗脱，洗脱体积为层析柱床的2~4倍。

15.根据权利要求1所述一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺，其特征是：步骤7）中所述的洗脱液经浓缩为低温减压浓缩，蒸发温度为25~100℃，真空度为：5～95kPa，冷凝温度为1～20 ℃，所述的洗脱液的浓缩装置为真空浓缩仪。

16.根据权利要求15所述一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺，其特征是：所述蒸发温度为35～45℃；所述真空度为5～25 kPa；所述冷凝温度为5～10 ℃；所述的真空浓缩仪为真空旋转蒸发浓缩仪或刮膜式真空浓缩仪。