KR860001821B1 - L-아미노산의 단리 방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

L-아미노산의 단리 방법

본 발명은 미생물을 이용하여 L-아미노산을 제조하는 동안 수득된 반응 혼합물로 부터 L-아미노산을 효과적으로 단리하는 방법에 관한 것이다.

미생물을 이용하여 제조된 L-아미노산 함유 반응 혼합물로 부터 이온 교환 수지에 의해 L-아미노산을 단리하는 많은 방법이 보고되어 있다. 예를 들면 카르복실산형 양이온 교환수지에 의한 염기성 아미노산의 분리(미합중국 특허 2,549,378), 약염기성 음이온 교환 수지에의한 산성 아미노산의 분리(D.T Eaglis 및 H.A. Fiess: Ind. Eng. Chem., Vol. 36, 604, 1944; R.K. Cannan, J. Biol. Chem., Vol, 152, 401, 1944) 및 H-형 강산성 양이온 교환수지 또는 O H-형 강염기성 음이온 교환 수지를 사용한 아미노산의 분리(S.M. Partridge 및 R.C. Blimley, Biochem. J., Vol. 51, 628, 1952) 방법이 공지되어 있다.

이온 교환 수지에 의한 반응 생성물의 공업적 단리에 대하여, 일본국 특허 공보 5050/1946에는 당류 및 아미노산을 함유한 용액에 폴리아미드형 중합 응고제를 가하여 불순물을 응고 및 침전시키고 이를 이온 교환 수지에 정제하는 방법이 기재되어 있으며, 일본국 특허공보 21105/1973에는 교차 결합도가 6%이하의 DVB 함량인 술폰산형 이온 교환 수지에 의해 L-트립토판을 함유한 혼합 아미노산 용액을 회수하는 방법이 기재되어 있다.

그러나, 이들 종래의 방법은 이온 교환 수지에 의해 정제하기에 앞서, 예를들면 원심분리, 및 중합 응고제에 의한 응고 및 침전, 울트라여과막에 의한 여과 등에 의해 반응 혼합물로 부터 사용된 미생물을 제거해야 하기 때문에, 미생물의 제거에 너무 많은 인력이 필요하다.

본 발명의 목적은 미생물을 사용하여 제조된 L-아미노산 함유 반응 혼합물로 부터 L-아미노산을 효과적으로 회수하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 L-아미노산 함유 반응 혼합물을 직접 H-형 강산성 양이온 교환 수지로 처리함으로써 수행된다. 본 발명의 방법은 반응에 사용된 미생물의 제거 및 생성된 L-아미노산의 단리를 동시에 효과적으로 수행할 수 있다.

본 발명의 기본 원리는 미생물을 합유한 L-아미노산 함유 반응 혼합물을 H-형 강산성 양이온 교환 수지층에 통과시켜 수지층에 L-아미노산을 흡착시키고 그를 분리 및 정제할때, 반응 혼합물에 용해 또는 현탁된 미생물을 이온 교화 수지와 접촉 응고시키고 수지를 물로 세척함으로써 쉽게 제거할 수 있다는 것이다. 물에 용해 또는 현탁된 미생물이 H-형 강산성 양이온 교환 수지와 접촉할때 술폰산기에 의해 이온 교환군에 변형이 일어나기 때문에 미생물의 응고가 쉽게 일어난다.

본 발명의 방법은 미생물을 이용하여 L-아미노산을 제조하는 동안 수득된 미생물 및 L-아미노산을 함유한 반응 혼합물(이후 때때로 "아미노산 반응 혼합물"로 약칭함)에 적용될 수 있다.

아미노산 반응 혼합물의 예를들면 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 존재하에 D L-세린 및 인돌로 부터 제조된 L-트립토판 함유 반응 혼합물 ; 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) 존재하에 L-세린 및 인돌로 부터 제조된 L-트립토판 함유 반응 혼합물 ; 전구체로써 안트라닐산을 사용하여 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 존재하에 제조된 L-트립토판 함유 반응 혼합물 ; 아에로박터 아에로게네스(Aerobacter aerogenes) 존재하에 인돌, 피루브산 및 암모나아로부터 제조된 L-트립토판 함유 반응 혼합물 ; 아에로박테리움(Aerobacterium)속의 박테리아를 사용하여 인돌, 세린 및 글루코오즈로부터 제조된 L-트립토판 함유 반응 혼합물 ; 아에로모나스(Aeromonas), 아에로박터(Aerobacter) 또는 슈도모나스(Pseudomonas)속의 메탄올-이용 미생물을 사용하여 탄소원으로써 메탄올을 함유한 글리신 함유 배양 배지에서 제조된 L-세린 함유 반응 혼합물 ; 및 노카르디아(Nocardia)속의 미생물 존재하에 글리신 함유 배양 배지에서 제조된 L-세린 함유 반응 혼합물이 있다. 이들은 단지 예를 든것이며, 본 발명의 방법은 미생물을 이용하여 제조된 모든 L-아미노산 반응 혼합물의 정제에 널리 이용될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용된 H-형 강산성 양이온 교환 수지의 예로는 레바티트(Lewatit) SP-120(바이엘사제 상품명), 레바티트 SC-102(바이엘사제 상품명), 다이아이온 pk-208(미쓰비시가가꾸가부시끼가이샤제 상품명), 다이아이온 SK-102(미쓰비시가가꾸가부시끼가이샤제 상품명), 및 앰버라이트 XE-100(롬 & 하스사제 상품명)이 있다.

아미노산 반응 혼합물을 그 자체로 또는 아미노산이 결정으로서 물에 침전된다면 결정이 실온에서 용해될 때까지 물로 희석한 후, 한쪽 끝에 H-형으로 재생된 술폰산형 양이온 교환 수지의 층을 통과시켜 아미노산을 이온 교환 수지에 흡착시킨다. 반응 혼합물 중의 미생물을 이온 교환 수지에 흡착시킨다. 반응 혼합물중의 미생물을 이온 교환 수지층과 접촉시켜 변성시키고 응고된 상태로 이온 교환 수지에 부착시킨다. 수지층의 다른 한쪽 끝으로 부터 이온 교환 수지층을 통해 일정 유속의 물을 통과시켜(이런 과정을 역세척이라함) 이온 교환 수지층으로 부터 응고된 미생물을 제거한다.

이온 교환 수지층에서의 아미노산의 흡착, 미생물의 응고 및 응고된 미생물의 제거는 보통 이온 교환수지가 가득찬 컬럼에서 수행된다. 그러나, 이온 교환 수지에 아미노산을 흡착시킨 후 이온 교환 수지를 반응 용기에 채우고 수세하여 슬러지를 제거하는 방법도 아무런 문제가 없다.

이온 교환 수지로 채워진 컬럼을 사용할 때, 아미노산 반응 혼합물을 지정된 유속으로 상단에서 수지 컬럼에 통과시켜 아미노산을 이온 교환 수지에 흡착시킨다. 이때, 아미노산 반응 혼합물에 포함된 대부분의 미생물은 수지컬럼에서 변성 및 응고되고 수지에 물리적으로 부착된다. 미생물의 일부는 충전된 액체와 함께 수지컬럼의 바닥으로부터 유출된다.

상기 공정 후, 이온 교환 수지 컬럼의 바닥으로부터 지정된 유속으로 물을 통과시켜 역세척(back washing)을 수행할 때, 수지에 부착된 응고 미생물은 부유하여 컬럼의 상단으로부터 유출되어 효과적으로 제거될 수 있다.

이온 교환 수지층에 공급된 L-아미노산 반응 혼합물 중의 미생물은 L-아미노산이 이온 교환 수지에 흡착될 때 미생물의 일부가 방출된 액체와 함께 제거되며, 역세척시 응고 덩어리 형태의 미생물 대부분이 수지층으로부터 제거되기 때문에 거의 완전히 제거될 수 있다.

L-아미노산이 흡착된 이온 교환 수지를 보통 암모니아수로 처리하여 L-아미노산을 용출시킨다. 용출액을 농축 및 결정화함으로써 필요한 L-아미노산을 쉽게 단리시킬 수 있다.

생성된 L-아미노산은 이온 교환 수지에 의한 정제 효과로 인해 고순도이다.

미생물을 함유한 L-아미노산 반응 혼합물을 H-형 강산성 양이온 교환 수지로 처리함으로써, 본 발명의 방법은 L-아미노산을 단리시킴과 동시에 통상의 방법에 의해 제거하기 어려운 미생물을 제거할 수 있다. 그러므로 본 발명의 방법은 미생물을 이용한 반응에 의해 수득된 생성물의 정제 방법으로써 공업적으로 대단히 중요하다.

하기의 실시예에는 본 발명의 방법을 더욱 상세히 설명한다.

[실시예 1]

에스케리키아 콜리를 함유한 세포를 pH 7, 30℃에서 교반하면서 산소 중에서 모노포타슘포스페이트, 디포타슘포스페이트, 황산암모늄, 염화칼슘, 황산철, 이스트추출물, 폴리펩톤 및 기타 필요한 물질 존재하에 글루코오즈 및 인돌을 가하면서 배양한다. 세포의 최종 농도는 30-35g/l이다.

상기와 같은 방법으로, 슈도모나스 푸티다를 함유한 세포를 상기와 같은 배양배지에서 인돌을 가하지않고 배양한다.

상기 두 경우에 있어서, 성장된 세포를 통상의 초원심분리기를 사용하여 배양 브로스로부터 수집하고, 수분 함량이 75-85%인 크림케이크를 수득한다.

77.3g의 D L-세린 10.5g의 황산암모늄 및 486g의 물을 함유한 수용액을 반응기에 도입하고 29%암모니아수를 가하여 pH를 8.5로 맞춘다. 상기에서 수득된 에스케리키아 콜리 세포의 크림케이크 51.2g 및 상기에서 수득된 슈도모나스 푸티다의 크림케이크 23.2g을 가하고, 혼합물을 잘 교반한다. 78.4g의 인돌을 함유한 톨루엔용액 392g을 가하고 35℃에서 40시간 동안 반응시킨다.

반응에서 생성된 L-트립토판의 양을 액체크로마토 그래피에 의해 분석하면 129.8g(인돌을 기준으로 한 수율 95.0%)이다.

반응 혼합물을 증류하여 톨루엔을 제거한다. 반응 혼합물을 물로 희석하여 L-트립토판 결정을 완전히 용해시킴으로써 농도가 1.0중량%가 되게 한다.

한편, 염산에 의해 H-형으로 재생된 레바티드 sp-120(강산성 양이온 교환 수지) 48.6l를 컬럼에 채운다. 상기 L-트립토판 용액(125g)을 컬럼에 그의 상단으로부터 지정된 유속으로 통과시켜 이온 교환 수지에 L-트립토판을 흡착시킨다.

컬럼을 24.9g의 물로 역세척하여 미생물 세포의 응고덩어리를 세척한다. 이온 교환 수지의 교환 용량 2배에 해당하는 암모니아수를 사용하여 수지 컬럼으로 부터 L-트립토판을 용출시킨다. 용출액을 100℃로 가열하여 암모니아를 제거 및 회수한다. 잔류물을 실온으로 냉각시킨다. 침전된 L-트립토판 결정을 여과에 의해 분리하고 건조시킨다. 순도가 99.8%인 L-트립토판을 1.0g 수득한다.

이온 교환 수지 처리에 의한 세포균형은 3%의 세포가 L-트립토판의 흡착시 컬럼을 통과한 잔여 액체에 존재하고, 97%의 세포가 역세척시 유출액에 존재하도록 한다(세포균형은 건조 농축된 세포의 중량과 원소분석에 의한 탄소균형으로부터 결정한다.

[실시예 2]

실시예 1과 같은 방법으로 배양된 에스케리키아 콜리의 크림케이크를 사용하여 물에 녹인 L-세린 및 인돌로부터 L-트립토판을 제조한다. 인돌에 의한 효소활성의 감소를 피하기 위해, 인돌의 농도를 계속 분석하며 물중의 인돌 농도를 200ppm 이하로 유지시키면서 인돌을 점차 가함으로써 반응을 수행한다. 제조된 L-트립토판의 수율은 인돌을 기준으로 100% 및 L-세린을 기준으로 85%이다. 축적된 L-트립토판의 최종 농도는 120g/l이다. L-트립토판 반응 혼합물을 원심 탈수하여 L-트립토판 및 미생물 세포를 함유한 반응 크림케이크를 수득한다.

반응 크림케이크를 실시예 1과 같은 방법에 의해 이온 교환 수지로서 레바티트 sc-102 (H-형)로 처리하여 세포를 제거하고 L-트립토판을 단리시킨다.

단리된 L-트립토판의 양은 1.1g이고, 그의 순도는 99.9%이다. L-트립토판 반응 혼합물중의 세포는 이온 교환 수지에 흡착시킬 때 2.5% 및 이온 교환 수지 컬럼을 역세척할 때 97.5% 제거된다.

Claims (1)

1. L-아미노산을 용해된 상태로 유지시키면서 반응 혼합물을 H-형 강산성 양이온 교환 수지로 처리함을 특징으로 하는, 미생물을 사용한 L-아미노산의 제조시 수득된 L-아미노산 및 미생물을 함유한 반응 혼합물로부터의 L-아미노산의 단리 방법.