CN110759959A - 一种从发酵液中分离提取维生素b12的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物发酵技术领域，公开一种从发酵液中分离提取维生素B12的方法，包括以下步骤：1）将维生素B12发酵液在避光条件下水解，过滤；2）采用机械法将菌体富集液中菌体细胞壁破除，加入絮凝剂，调pH至7.0～7.5，过滤；3）将滤液混合后，经大孔树脂柱吸附、水洗和解吸，得到第一解析液，将吸附后的滤液调节pH至4.0～5.0，加热处理后，过滤，然后经大孔树脂柱吸附、水洗和解吸，得到第二解析液；4）解析液经苯乙烯类改性层析树脂柱吸附、展层和解吸，得到纯化液；5）纯化液经浓缩、干燥，得到维生素B12。通过对发酵液的预处理及分离步骤的合理设置，能充分提取维生素B12，提高维生素B12的收率。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种从发酵液中分离提取维生素B12的方法。
背景技术
维生素B12又名钴胺素，是一种重要的动物和人类营养因子，广泛应用于饲料、食品和医药卫生领域，其在很多方面都有显著作用，如促进红细胞的发育和成熟，预防恶性贫血；维护神经系统健康；以辅酶的形式存在，可以增加叶酸的利用率，促进碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢；也可促进蛋白质的合成，对婴幼儿的生长发育有重要作用；还能消除烦躁不安、集中注意力、增强记忆及平衡感，而且维生素B12参与神经组织中一种脂蛋白的形成，是神经系统功能健全不可缺少的维生素。
采用化学合成生产维生素B12的方法成本高，副产物多，难以提纯。维生素B12的工业制造主要是通过微生物发酵法制得，主要有：抗生素废液中提取；放线菌发酵；丙酸菌发酵；采用转基因的E.Coli发酵生产等。维生素B12的提取纯化主要采用溶剂提取法和离子交换树脂法，其中，溶剂提取法主要采用两相混合溶剂，常用的溶剂为苯甲醇和水的混合溶液，基本过程为：发酵液—吸附（活性炭）—洗脱（吡啶）—浓缩—层析（Al2O3）—洗脱（甲醇）—收集红色液—浓缩—结晶；离子交换树脂法提取过程为：发酵液—阳离子树脂（LonacC-240）—阴离子树脂（LonacA C-300）—蒸馏水冲洗—收集红色液体部分—浓缩—冷冻干燥。
现有的提取工艺未能将发酵液中的维生素B12充分提取，造成资源浪费，而且提纯效率低，收率不理想。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的是提供一种从发酵液中分离提取维生素B12的方法，通过对发酵液的预处理及分离步骤的合理设置，能够充分提取维生素B12，提高维生素B12的收率及分离效率。
本发明提供一种从发酵液中分离提取维生素B12的方法，包括以下步骤：
1）将维生素B12发酵液在避光条件下水解，过滤，得到第一滤液和菌体富集液；
2）采用机械法将菌体富集液中菌体细胞壁破除，在其中加入絮凝剂，调pH至7.0～7.5，过滤，得到第二滤液；
3）将第一滤液和第二滤液混合后，经大孔树脂柱吸附、水洗和解吸，得到第一解析液，将吸附后的滤液调节pH至4.0～5.0，加热处理后，经陶瓷膜过滤，得到的第三滤液，第三滤液经大孔树脂柱吸附、水洗和解吸，得到第二解析液；
4）第一解析液和第二解析液混合后，经苯乙烯类改性层析树脂柱吸附、展层和解吸，得到纯化液；
5）纯化液经浓缩、干燥，得到维生素B12。
本发明中，将发酵液分为两部分进行处理，使发酵液中的B12有效组分能够最大程度的进入到后续的分离提取步骤。
优选地，步骤1）中，采用超滤膜进行过滤，所述的超滤膜为管式陶瓷膜、平板陶瓷膜、有机卷式膜、管式有机膜、中空纤维膜或有机平板膜，操作压力为0.1-1MPa。
根据本发明，对菌体富集液中的菌体细胞壁破除可采用常规使用的任何方法，优选为机械法。
本发明中，在破除菌体细胞壁的菌体富集液中加入絮凝剂，使该富集液更易分离过滤。絮凝剂可选用常规使用的任一絮凝剂，优选为二价锌盐或三价铝盐，絮凝剂添加量为常规添加量，例如，维生素B12和絮凝剂用量的摩尔比为10～20∶1。
优选地，步骤2）中的过滤采用板框过滤。
优选情况下，步骤3）中的大孔树脂选自LX-20大孔吸附树脂或CAD-45大孔吸附树脂。具体的吸附、水洗和解吸步骤均可参照本领域的常规步骤进行。步骤3）中，两次大孔树脂柱的吸附可以选用相同的大孔树脂柱也可以选用不同的大孔树脂柱。
本发明中，将一次大孔树脂柱吸附后的滤液进一步进行处理，回收其中的维生素B12。优选地，步骤3）中，将吸附后的滤液调节pH至4.6-4.7，加热至56-58℃，保温30-40min。
优选地，陶瓷膜的孔径小于等于50nm，陶瓷膜的入膜压力为2.5-4bar，出膜压力为1.5-2bar，膜通量大于90LMH。
本发明中的苯乙烯类改性层析树脂柱可有效的去除其它类型的维生素B12和其它杂质。优选地，苯乙烯类改性层析树脂柱使用的展层剂中丙酮与水的重量比为5～15∶100，解吸剂中丙酮与水的重量比例为30～60∶100。
优选地，所述维生素B12发酵液中的菌体为脱氮假单胞杆菌。
根据本发明，步骤5）中，纯化液采用纳滤膜进行浓缩，浓缩液采用喷雾干燥进行干燥。浓缩和干燥的工艺参数选用常规使用的参数。
与现有技术相比，本发明具有如下有益点：
本发明通过将发酵液分为两部分进行处理，可将发酵液中的维生素B12充分收集，另外，将一次吸附后的滤液进行处理，然后二次吸附，能够充分提取维生素B12，提高维生素B12的收率和纯度，也可通过采用喷雾干燥提高提取效率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1-3用于说明本发明的从发酵液中分离提取维生素B12的方法。
实施例1
一种从发酵液中分离提取维生素B12的方法，包括以下步骤：
1）将脱氮假单胞杆菌发酵液在避光条件下水解，采用超滤膜进行过滤，超滤膜为中空纤维膜，操作压力为0.5MPa，得到第一滤液和菌体富集液；
2）采用机械法将菌体富集液中菌体细胞壁破除，在其中加入二价锌盐絮凝剂，调pH至7.2，采用板框过滤，得到第二滤液；
3）将第一滤液和第二滤液混合后，经LX-20大孔吸附树脂柱吸附、水洗和解吸，得到第一解析液，将吸附后的滤液调节pH至4.6，加热至58℃，保温30min，经陶瓷膜过滤，得到的第三滤液，第三滤液经CAD-45大孔吸附树脂柱吸附、水洗和解吸，得到第二解析液；其中，陶瓷膜的孔径为50nm，陶瓷膜的入膜压力为2.5bar，出膜压力为1.5bar，膜通量大于90LMH；
4）第一解析液和第二解析液混合后，经苯乙烯类改性层析树脂柱吸附、展层和解吸，得到纯化液；苯乙烯类改性层析树脂柱使用的展层剂中丙酮与水的重量比为10∶100，解吸剂中丙酮与水的重量比例为30∶100；
5）纯化液经纳滤膜浓缩、再采用喷雾干燥，得到维生素B12。
采用上述方法得到的维生素B12的纯度为98.5%，维生素B12的收率为82.8%。
实施例2
一种从发酵液中分离提取维生素B12的方法，包括以下步骤：
1）将脱氮假单胞杆菌发酵液在避光条件下水解，采用超滤膜进行过滤，超滤膜为中空纤维膜，操作压力为0.8MPa，得到第一滤液和菌体富集液；
2）采用机械法将菌体富集液中菌体细胞壁破除，在其中加入二价锌盐絮凝剂，调pH至7.5，采用板框过滤，得到第二滤液；
3）将第一滤液和第二滤液混合后，经LX-20大孔吸附树脂柱吸附、水洗和解吸，得到第一解析液，将吸附后的滤液调节pH至4.7，加热至58℃，保温30min，经陶瓷膜过滤，得到的第三滤液，第三滤液经CAD-45大孔吸附树脂柱吸附、水洗和解吸，得到第二解析液；其中，陶瓷膜的孔径为50nm，陶瓷膜的入膜压力为3bar，出膜压力为2bar，膜通量大于90LMH；
4）第一解析液和第二解析液混合后，经苯乙烯类改性层析树脂柱吸附、展层和解吸，得到纯化液；苯乙烯类改性层析树脂柱使用的展层剂中丙酮与水的重量比为5∶100，解吸剂中丙酮与水的重量比例为50∶100；
5）纯化液经纳滤膜浓缩、再采用喷雾干燥，得到维生素B12。
采用上述方法得到的维生素B12的纯度为98.8%，维生素B12的收率为85.6%。
实施例3
一种从发酵液中分离提取维生素B12的方法，包括以下步骤：
1）将脱氮假单胞杆菌发酵液在避光条件下水解，采用超滤膜进行过滤，超滤膜为平板陶瓷膜，操作压力为1.0MPa，得到第一滤液和菌体富集液；
2）采用机械法将菌体富集液中菌体细胞壁破除，在其中加入三价铝盐絮凝剂，调pH至7.0，采用板框过滤，得到第二滤液；
3）将第一滤液和第二滤液混合后，经LX-20大孔吸附树脂柱吸附、水洗和解吸，得到第一解析液，将吸附后的滤液调节pH至4.6，加热至56℃，保温30min，经陶瓷膜过滤，得到的第三滤液，第三滤液经CAD-45大孔吸附树脂柱吸附、水洗和解吸，得到第二解析液；其中，陶瓷膜的孔径为50nm，陶瓷膜的入膜压力为4bar，出膜压力为2bar，膜通量大于90LMH；
4）第一解析液和第二解析液混合后，经苯乙烯类改性层析树脂柱吸附、展层和解吸，得到纯化液；苯乙烯类改性层析树脂柱使用的展层剂中丙酮与水的重量比为15∶100，解吸剂中丙酮与水的重量比例为60∶100；
5）纯化液经纳滤膜浓缩、再采用喷雾干燥，得到维生素B12。
采用上述方法得到的维生素B12的纯度为99.1%，维生素B12的收率为84.5%。
以上已经描述了本发明的实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的实施例。在不偏离所说明实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
Claims (10)
1.一种从发酵液中分离提取维生素B12的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将维生素B12发酵液在避光条件下水解，过滤，得到第一滤液和菌体富集液；
2）采用机械法将菌体富集液中菌体细胞壁破除，在其中加入絮凝剂，调pH至7.0～7.5，过滤，得到第二滤液；
3）将第一滤液和第二滤液混合后，经大孔树脂柱吸附、水洗和解吸，得到第一解析液，将吸附后的滤液调节pH至4.0～5.0，加热处理后，经陶瓷膜过滤，得到的第三滤液，第三滤液经大孔树脂柱吸附、水洗和解吸，得到第二解析液；
4）第一解析液和第二解析液混合后，经苯乙烯类改性层析树脂柱吸附、展层和解吸，得到纯化液；
5）纯化液经浓缩、干燥，得到维生素B12。
2.根据权利要求1所述的从发酵液中分离提取维生素B12的方法，其特征在于：步骤1）中，采用超滤膜进行过滤，所述的超滤膜为管式陶瓷膜、平板陶瓷膜、有机卷式膜、管式有机膜、中空纤维膜或有机平板膜，操作压力为0.1-1MPa。
3.根据权利要求1所述的从发酵液中分离提取维生素B12的方法，其特征在于：所述絮凝剂为二价锌盐或三价铝盐。
4.根据权利要求1所述的从发酵液中分离提取维生素B12的方法，其特征在于：步骤2）中的过滤采用板框过滤。
5.根据权利要求1所述的从发酵液中分离提取维生素B12的方法，其特征在于：步骤3）中的大孔树脂选自LX-20大孔吸附树脂或CAD-45大孔吸附树脂。
6.根据权利要求1所述的从发酵液中分离提取维生素B12的方法，其特征在于：步骤3）中，将吸附后的滤液调节pH至4.6-4.7，加热至56-58℃，保温30-40min。
7.根据权利要求1所述的从发酵液中分离提取维生素B12的方法，其特征在于：陶瓷膜的孔径小于等于50nm，陶瓷膜的入膜压力为2.5-4bar，出膜压力为1.5-2bar，膜通量大于90LMH。
8.根据权利要求1所述的从发酵液中分离提取维生素B12的方法，其特征在于：苯乙烯类改性层析树脂柱使用的展层剂中丙酮与水的重量比为5～15∶100，解吸剂中丙酮与水的重量比例为30～60∶100。
9.根据权利要求1所述的从发酵液中分离提取维生素B12的方法，其特征在于，所述维生素B12发酵液中的菌体为脱氮假单胞杆菌。
10.根据权利要求1所述的从发酵液中分离提取维生素B12的方法，其特征在于，步骤5）中，纯化液采用纳滤膜进行浓缩，干燥采用喷雾干燥。
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