CN102924537A

CN102924537A - 从罗布麻叶中同时制备金丝桃苷和异槲皮苷的方法

Info

Publication number: CN102924537A
Application number: CN2012104245579A
Authority: CN
Inventors: 夏传海; 孔娜娜; 方圣涛; 凌浩
Original assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Current assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2012-10-30
Publication date: 2013-02-13
Anticipated expiration: 2032-10-30
Also published as: CN102924537B

Abstract

本发明涉及一种从罗布麻叶中同时制备金丝桃苷和异槲皮苷的方法。本发明以罗布麻叶为原料，经加热回流或超声提取，减压浓缩得浸膏；浸膏加水溶解，用石油醚除去色素及脂溶性杂质；水相稀释，通过至少三级串联的大孔吸附树脂柱，动态吸附至饱和后，流加洗杂液洗杂，再用洗脱液洗脱至无金丝桃苷和异槲皮苷流出，并收集流出液；流出液减压浓缩，在甲醇中重结晶，经装填有C18反相硅胶的中压梯度洗脱系统同时得到纯度均达到90％-98％的金丝桃苷和异槲皮苷。该方法样品处理量大，操作简单，同时制备出高纯度的金丝桃苷和异槲皮苷，不仅成本低廉而且适用于较大规模的制备。

Description

从罗布麻叶中同时制备金丝桃苷和异槲皮苷的方法

技术领域

本发明涉及中药现代化分离纯化技术，具体的说是一种从罗布麻叶中同时制备金丝桃苷和异槲皮苷的方法

背景技术

罗布麻叶为夹竹桃科多年生草本植物罗布麻Apocynum venetum.的干燥叶，具有平肝安神、清热利水之功效，其药用、茶饮历史悠久。现代药理研究表明，罗布麻叶可用来治疗高血压、高血脂、冠心病、哮喘病、气管炎等疾病，具有较好的效果。

金丝桃苷和异槲皮苷是罗布麻中主要的活性成分。金丝桃苷又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，属于黄酮醇苷类化合物，苷元为槲皮素，糖基为吡喃半乳糖，由槲皮素的3位O原子以β糖苷键与糖基相连，具有局部镇痛、抗过敏、抗炎、抗抑郁、抗菌、止咳等作用，对心肌缺血再灌、脑缺血再灌、脑梗塞具有良好的保护作用。异槲皮苷又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，具有降血压、抗炎、抗抑郁等作用，是田基黄治疗肝炎的有效成分之一。

金丝桃苷异槲皮苷

中国专利02146370.0公开了“一种金丝桃苷的制备方法及药物新用途”，所用药材为黄蜀葵花，经加热回流或冷浸渗滤提取，提取液上聚酰胺树脂柱，真空干燥后用乙酸乙酯和乙醇混合溶剂提取，干燥后用醇复结晶得到金丝桃苷。中国专利200810195922.7公开了“一种金丝桃苷的提取方法及其制剂和用途”，以黄蜀葵花为原料，用乙醇回流提取，再用正丁醇或乙酸乙酯萃取，真空干燥后用乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂回流提取，干燥后用乙醇重结晶得到金丝桃苷。中国专利201010158044.9公开了“一种分离金丝桃苷的方法”，以山里红或山楂叶为原料，经回流提取，上大孔树脂柱，减压浓缩后上硅胶柱直接得到金丝桃苷。中国专利201110075635.4公开了“罗布麻叶中金丝桃苷的制备方法”，罗布麻叶经加热回流提取、醇沉、上大孔树脂柱、萃取、重结晶得到金丝桃苷。以上方法均存在提取率低，制备量小，并且仅得到了金丝桃苷，造成了资源的浪费。中国专利03150847.2公开了“金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷对照品的同时制备方法”该方法是以吴茱萸为原料，经回流提取，再用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取部分经两次柱层析纯化，再重结晶，分别得到金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷两种对照品。该方法虽然同时制备得到金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷，但是该方法同样存在处理量小、效率低的缺点。中国专利200610054268.9公开了“贯叶连翘中金丝桃苷和金丝桃素的制备方法”，以贯叶连翘为原料，采用CTAB反胶束萃取得到金丝桃苷和金丝桃素，该方法工艺复杂，产品得率低，不适合大规模生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从罗布麻叶中同时制备金丝桃苷和异槲皮苷的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种从罗布麻叶中同时制备金丝桃苷和异槲皮苷的方法，

1）提取：以罗布麻叶为原料经加热回流或超声提取，提取液减压浓缩，浓缩液用石油醚萃取除去色素及脂溶性杂质，萃取后的水相经稀释即为中间产物A；

2）富集：中间产物A以1-10BV/h的流速通过大孔吸附树脂柱，动态吸附至饱和；再用3-15BV的水以5-20BV/h的流速淋洗上述大孔吸附树脂柱至无色；最后用3-15BV体积分数为30-50％的乙醇在3-10BV/h的流速下进行洗脱，收集洗脱液直至洗脱液无色，将收集所得洗脱液减压浓缩即得中间产物B；

3）纯化：将上述中间产物B在甲醇中重结晶，得金丝桃苷和异槲皮苷的混合物C；将混合物C利用中压梯度系统进行分离，具体为以15-40μm的C18硅胶键合固定相为色谱填料，流动相为甲醇和水，并以50-200mL/min的流速进行洗脱；按出峰时间先后顺序分别收集金丝桃苷和异槲皮苷（其中金丝桃苷色谱峰出峰时间范围为26min-32min，收集30min-36min的色谱峰即为异槲皮苷），而后分别减压浓缩回收有机溶剂，冷冻干燥后即得高纯度金丝桃苷和异槲皮苷粉末。

所述步骤1）向干燥粉碎的罗布麻叶中加入8-20倍量（mL/g）的溶剂，经加热回流或超声提取2-3次，每次1-3小时，合并提取液；提取液过滤后，减压浓缩得到浸膏，浸膏加水溶解，用等体积的石油醚萃取3-4次，而后将萃取后的水相稀释至浓度为1-10g/L，充分混匀，即得中间产物A。

所述步骤1）溶剂为体积分数为70％-100％甲醇或乙醇。

所述步骤2）大孔吸附树脂柱为串联的大孔吸附树脂柱；所述各个串联的大孔吸附树脂柱的径高比为1:4-1:10。

所述步骤2）大孔树脂为AB-8、D101和/或X-5等；串联的大孔吸附树脂柱可以是一种树脂或几种树脂的组合；串联的大孔吸附树脂柱至少为3级串联。

所述步骤2）吸附残液可循环吸附1-2次后弃去。所述步骤2）洗脱收集中间产物B后的大孔吸附树脂柱经再生液再生后可重复利用，进而达到连续操作的目的。

所述步骤2）再生液为无水乙醇。所述步骤3）洗脱纯化时流动相甲醇的体积分数从10％到50％梯度变化。

本发明有益效果在于：

1.本发明以罗布麻叶为原料，通过回流或超声提取，石油醚除去色素和脂溶性杂质，减少了后续工作的难度，再通过多级串联的大孔树脂柱，不仅实现了连续操作，而且对原料液的处理量大，分离效果好；同时每级单柱实现饱和吸附后再进行切换，有效提高了树脂的利用率，同时也提高了样品的浓度；而后重结晶，最后利用中压梯度洗脱系统同时制备得到高纯度的金丝桃苷和异槲皮苷。

2.本发明采用的多柱串联装置的填料为大孔吸附树脂，其具有吸附容量大，选择性好，易于吸附，机械强度高，再生处理简单，吸附速度快，操作简单，得率恒定，产品质量稳定，适合金丝桃苷和异槲皮苷的分离富集；同时串联树脂柱的吸附残液可循环吸附1-2次后弃去，减少了样品的损失；并且洗脱剂和再生剂均可回收重复利用，降低了生产成本。

3.本发明洗脱过程采用中压梯度洗脱系统，填料为高分离能力的ODS（C18键合固定相）分离材料，利用中压梯度洗脱系统的高分离能力，可以保证产品的纯度；并且一次性的同时得到高纯度性质相近的金丝桃苷和异槲皮苷两种活性成分。

4.本发明提取过程操作方法简单，控制参数少，效率高，易于工业放大。

附图说明

图1为本发明实施例提供的中间产物A的高效液相色谱图；

图2为本发明实施例提供的中间产物B的高效液相色谱图；

图3为本发明实施例提供的中间产物C的高效液相色谱图；

图4为本发明实施例提供的金丝桃苷的高效液相色谱图；

图5为本发明实施例提供的异槲皮苷的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于此。

本发明以罗布麻叶为原料，通过回流或超声提取，石油醚除去色素和脂溶性杂质，再通过多级串联的大孔树脂柱，重结晶，最后利用中压梯度洗脱系统同时制备得到高纯度的金丝桃苷和异槲皮苷。

所述大孔吸附树脂柱为串联的大孔吸附树脂柱；所述各个串联的大孔吸附树脂柱的径高比为1:4-1:10。串联的大孔吸附树脂柱可以是相同树脂或是几种树脂的组合；树脂为AB-8、D101和/或X-5等；串联的大孔吸附树脂柱为至少串联3级。并且大孔吸附树脂柱吸附后的吸附残液可循环吸附1-2次后弃去。大孔吸附树脂柱经再生液再生后可重复利用，进而达到连续操作的目的。

本发明所述实施例中，金丝桃苷和异槲皮苷的纯度采用高效液相色谱法进行检测，所用色谱柱为Zorbax Extend-C18（4.6mm×250mm，5μm)，检测波长为256nm，流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，B为乙腈，流速为1mL/min，进样量为10μL，梯度洗脱程序如下：

表1高效液相色谱的梯度洗脱程序

时间(min)	A（%）	B（%）
			0	90	10
10	85	15
			30	80	20
40	30	70
			50	90	10

实施例1

（1）提取：取罗布麻叶500g干燥粉碎，加入体积分数为70％甲醇5L，经加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，提取液过滤后，减压浓缩回收有机溶剂得到浸膏，浸膏加水溶解，溶解后用等体积的石油醚萃取3次，萃取后水相稀释至浓度为10g/L，充分混匀，即得中间产物A，其高效液相色谱图如图1。

（2）大孔树脂分离：将中间产物A以3BV/h的流速通过装填有按常规方法处理后的3级串联的AB-8树脂柱，动态吸附至饱和，其中各个串联的大孔吸附树脂柱的径高比为1:8。再用蒸馏水以5BV/h的流速冲洗串联吸附柱，洗脱至无杂质流出。最后用体积分数为30％的乙醇以流速3BV/h的流速冲洗串联树脂柱，洗脱至无色，并收集30％的乙醇洗脱部分，减压浓缩得浸膏B，图2为中间产物B的高效液相色谱图。

（3）重结晶：浸膏B在甲醇中重结晶，即得到金丝桃苷和异槲皮苷总含量大于85％中间产物C，其高效液相色谱图如图3。

（4）中压梯度洗脱系统分离：中间产物C用体积分数30％的甲醇溶解，过0.45μm的有机滤膜，用中压梯度洗脱系统进一步分离，具体为以粒径为15-40μm的C18硅胶键合固定相为色谱填料，色谱柱规格为50mm×300mm，以甲醇和水为流动相，梯度洗脱程序如表2，分2次进样，每次收集29min-32min的色谱峰即为金丝桃苷，收集33min-36min的色谱峰即为异槲皮苷，分别合并2次洗脱组分，减压浓缩回收有机溶剂，冷冻干燥分别得到金丝桃苷0.58g，异槲皮苷0.63g。经高效液相色谱分析，金丝桃苷的纯度为97.9％,异槲皮苷的纯度为91.2％

表2中压梯度洗脱系统的梯度程序1

时间(min)	流速（ml/min）	水A（%）	甲醇B（%）
				0	100	80	20
30	100	60	40
				35	100	60	40
40	100	0	100
				45	100	0	100

实施例2

（1）提取：罗布麻叶1Kg干燥粉碎，加入85％甲醇15L，经加热回流3次，每次3小时，合并提取液，提取液过滤后，减压浓缩回收有机溶剂得到浸膏，浸膏加水溶解，用等体积的石油醚萃取4次，水相稀释至浓度为8g/L，充分混匀，即得中间产物A。

（2）大孔树脂分离：将中间产物A以3BV/h的流速通过装填有按常规方法处理后的4级串联的AB-8和X-5组合的树脂柱，动态吸附至饱和，其中各个串联的大孔吸附树脂柱的径高比为1:10。用蒸馏水以7BV/h的流速冲洗AB-8和X-5组合的树脂柱，洗脱至无杂质流出。用40％的乙醇以流速4BV/h的流速冲洗串联树脂柱，洗脱至无色，并收集洗脱液，减压浓缩得浸膏B。

（3）重结晶：浸膏B在甲醇中重结晶，即得到金丝桃苷和异槲皮苷总含量大于85％的中间产物C。

（4）中压梯度洗脱系统分离：中间产物C用30％的甲醇溶解，过0.45μm的有机滤膜，用中压梯度洗脱系统进一步分离，具体为以粒径为15-40μm的C18硅胶键合固定相为色谱填料，色谱柱规格为50mm×300mm，以甲醇和水为流动相，梯度洗脱程序如表2，分4次进样，每次收集29min-32min的色谱峰即为金丝桃苷，收集33min-36min的色谱峰即为异槲皮苷，合并4次洗脱组分，减压浓缩回收有机溶剂，再冷冻干燥分别得到金丝桃苷1.12g、异槲皮苷1.19g。经高效液相色谱分析，金丝桃苷纯度为96.3％，异槲皮苷的纯度为94.9％

实施例3

（1）提取：罗布麻叶5Kg干燥粉碎，加入85％甲醇50L，经超声提取3次，每次1小时，合并提取液，提取液过滤后，减压浓缩回收有机溶剂得到浸膏，浸膏加水溶解，用等体积的石油醚萃取4次，水相稀释至浓度为10g/L，充分混匀，即得中间产物A。

（2）大孔树脂分离：将中间产物A以5BV/h的流速通过装填有按常规方法处理后的5级串联的AB-8树脂柱，动态吸附至饱和，其中各个串联的大孔吸附树脂柱的径高比为1:6。用蒸馏水以10BV/h的流速冲洗AB-8大孔树脂串联吸附柱，洗脱至无杂质流出。用40％的乙醇以流速5BV/h的流速冲洗串联树脂柱，洗脱至无金丝桃苷和异槲皮苷流出，并收集洗脱液，减压浓缩得浸膏B。

（3）重结晶：浸膏B在甲醇中重结晶即得到金丝桃苷和异槲皮苷总含量大于85％的中间产物C。

（4）中压梯度洗脱系统分离：中间产物C用30％的甲醇溶解，过0.45

μm的有机滤膜，用中压梯度洗脱系统进一步分离，具体为以粒径为15-40

μm的C18硅胶键合固定相为色谱填料，色谱柱规格为70mm×400mm，以甲醇和水为流动相，梯度洗脱程序如表3，分8次进样，每次收集28min-31min的色谱峰即为金丝桃苷，收集32min-35mi n的色谱峰即为异槲皮苷，分别合并8次洗脱组分，减压浓缩回收有机溶剂，再冷冻干燥分别得到金丝桃苷6.52g、异槲皮苷6.69g。经高效液相色谱分析，金丝桃苷纯度为95.8％，异槲皮苷的纯度为93.2％

表3中压梯度洗脱系统的梯度程序2

时间(min)	流速（ml/min）	水A（%）	甲醇B（%）
				0	120	80	20
30	120	60	40
				35	120	60	40
40	120	0	100
				45	120	0	100

实施例4

（1）提取：罗布麻叶10Kg干燥粉碎，加入85％乙醇80L，超声提取3次，每次1小时，合并提取液，提取液过滤后，减压浓缩回收有机溶剂得到浸膏，浸膏加水溶解，用等体积的石油醚萃取4次，水相稀释至浓度为10g/L，充分混匀，即得中间产物。

（2）大孔树脂分离：将中间产物A以5BV/h的流速通过装填有按常规方法处理后5级串联的AB-8和D101组合的树脂柱，动态吸附至饱和，其中各个串联的大孔吸附树脂柱的径高比为1:10。用蒸馏水以10BV/h的流速冲洗大孔树脂串联吸附柱，洗脱至无杂质流出。再用40％的乙醇以流速6BV/h的流速冲洗串联树脂柱，洗脱至无色，并收集洗脱液，减压浓缩得浸膏B。

（3）重结晶：浸膏B在甲醇重结晶即得到金丝桃苷和异槲皮苷的总含量大于85％的混合物C。

μm的C18硅胶键合固定相为色谱填料，色谱柱规格为70mm×500mm，以甲醇和水为流动相，梯度洗脱程序如表4，每次收集26min-29min的色谱峰即为金丝桃苷，收集30min-33min的色谱峰即为异槲皮苷，分别合并10次洗脱组分，减压浓缩回收有机溶剂，再冷冻干燥分别得到金丝桃苷14.82g、异槲皮苷16.23g。经高效液相色谱分析，金丝桃苷纯度为97.9％，异槲皮苷的纯度为92.1％。

表4中压梯度洗脱系统的梯度程序3

时间(min)	流速(ml/min)	水A(%)	甲醇B(%)
				0	150	80	20
28	150	60	40
				33	150	60	40
38	150	0	100
				12	150	0	100

Claims

1.一种从罗布麻叶中同时制备金丝桃苷和异槲皮苷的方法，其特征在于：

3）纯化：将上述中间产物B在甲醇中重结晶，得金丝桃苷和异槲皮苷的混合物C；将混合物C利用中压梯度系统进行分离，具体为以15-40μm的C18硅胶键合固定相为色谱填料，流动相为甲醇和水，并以50-200mL/min的流速进行洗脱；按出峰时间先后顺序分别收集金丝桃苷和异槲皮苷，而后分别减压浓缩回收有机溶剂，冷冻干燥后即得高纯度金丝桃苷和异槲皮苷粉末。

2.按权利要求1所述的从罗布麻叶中同时制备金丝桃苷和异槲皮苷的方法，其特征在于：所述步骤1）向干燥粉碎的罗布麻叶中加入8-20倍量（mL/g）的溶剂，经加热回流或超声提取2-3次，每次1-3小时，合并提取液；提取液过滤后，减压浓缩得到浸膏，浸膏加水溶解，用等体积的石油醚萃取3-4次，而后将萃取后的水相稀释至浓度为1-10g/L，充分混匀，即得中间产物A。

3.按权利要求2所述的从罗布麻叶中同时制备金丝桃苷和异槲皮苷的方法，其特征在于：所述步骤1）溶剂为体积分数为70％-100％甲醇或乙醇。

4.按权利要求1所述的从罗布麻叶中同时制备金丝桃苷和异槲皮苷的方法，其特征在于：所述步骤2）大孔吸附树脂柱为串联的大孔吸附树脂柱；所述各个串联的大孔吸附树脂柱的径高比为1:4-1:10。

5.按权利要求4所述的从罗布麻叶中同时制备金丝桃苷和异槲皮苷的方法，其特征在于：所述步骤2）大孔树脂为AB-8、D101和/或X-5；串联的大孔吸附树脂柱可以是一种树脂或几种树脂的组合；串联的大孔吸附树脂柱至少为3级串联。

6.按权利要求1所述的从罗布麻叶中同时制备金丝桃苷和异槲皮苷的方法，其特征在于：所述步骤2）吸附残液可循环吸附1-2次后弃去。

7.按权利要求1所述的从罗布麻叶中同时制备金丝桃苷和异槲皮苷的方法，其特征在于：所述步骤2）洗脱收集中间产物B后的大孔吸附树脂柱经再生液再生后可重复利用，进而达到连续操作的目的。

8.按权利要求7所述的从罗布麻叶中同时制备金丝桃苷和异槲皮苷的方法，其特征在于：所述步骤2）再生液为无水乙醇。

9.按权利要求1所述的从罗布麻叶中同时制备金丝桃苷和异槲皮苷的方法，其特征在于：所述步骤3）洗脱纯化时流动相甲醇的体积分数从10％到50％梯度变化。