CN1634325A - 一种罗布麻提取物及其提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种罗布麻提取物及其提取方法。罗布麻提取物，(1)以金丝桃苷作为代表成分对该提取物进行测定，提取物中总黄酮含量35％－90％；(2)完全水解该提取物后，槲皮素化合物的含量30％－80％；(3)提取物中，金丝桃苷化合物的含量15％－55％。提取方法与采用聚酰胺树脂分离柱，并用澄清剂对上柱液进行澄清、纯化，可明显延长分离柱的寿命。本发明所表征的罗布麻提取物是首次从罗布麻中提取出来的一种新物质，不仅精制程度高，而且保留了大部分罗布麻的药理活性，而且服用量远小于罗布麻粗体物，其药理、药性与罗布麻粗提物相比有显著区别。提取方法采用聚酰胺树脂作为分离手段，可除去大量杂质，因而使有效成分富集、出膏率低(3％以下)。

Description

一种罗布麻提取物及其提取方法

技术领域

本发明涉及涉及一种罗布麻提取物及其提取方法，特别涉及罗布麻中提取的一种黄酮类物质及这类黄酮类物质的提取方法。

背景技术

罗布麻叶是一味传统的平肝息风药，具有平肝安神，清热利水的作用，用于肝阳眩晕，心悸失眠，浮肿少尿；高血压，神经衰弱，肾炎浮肿。现代药理研究发现其还具有降血脂、抗动脉粥样硬化、抗抑郁和肝保护等广泛的药理作用。其有效成份为黄酮类物质。但是目前以罗布麻为原料的临床用药均为粗提物制品或保健产品如：“罗布麻叶片”(卫生部药品标准中药成方制剂第7册WS3-B-1356-93)，“复方罗布麻冲剂”(卫生部药品标准中药成方制剂第6册WS3-B-1189-92)，“罗布麻茶”(为罗布麻叶和绿茶混合物)，罗布麻香烟等，普遍存在服用量过大(其日服用量在8-12g)、药效不显著的缺点；对其有效成分进一步精制纯化是这味传统中药实现现代化的必然趋势，以符合现代制剂“剂量小、毒性小、副作用小“、“高效、速效、长效”的要求；而国内外已经公开的文献及专利如：“罗布麻组合物”(CN1161844A)、“一种治疗高血压病的中药及其制备方法”(CN1283484A)、“降血压降血脂的中药保健茶”(CN1309985A)、“抗抑郁”(US2002/0090403A1)均未见有高纯度罗布麻提取物的报道。

一味中药通常是由多类成份组成的，比如糖类、氨基酸类、蛋白类、香豆素类、黄酮类、鞣质类、生物碱类、萜类和甾体类等等。常规的提取方法(如用水煎或乙醇提取)，可将其大部分提取出来，但是其真正有活性的物质不一定是所有的成分类别，而常常仅仅是其中的一小类成分起效。因此得到一种尽可能将无效成分去除，而将有效成分尽可能保留的高纯提取物，是中药现代研究的重点与难点。

如前所述罗布麻中的有效成份为黄酮类物质。黄酮类物质，化学结构上属于黄酮类、黄烷醇类、黄烷类、二氢黄酮醇类、花色素类、双苯吡酮类、异黄酮类、查尔酮类、二氢查尔酮类，橙酮类、高异黄酮类的化合物的单倍体或多聚体化合物及它们与单糖或寡糖形成的苷或其他形式的衍生物的一种或几种的组合。目前对黄酮类物质往往仅以“总黄酮含量”这一较上位的概念对其性质进行表征。对深层次的，诸如黄酮类物质中究竟是哪些有效成份起作用、这些有效份的含量等不曾认识，不作确切表征。总黄酮含量的测定，通常是采用其中含有的一种主要成份作为代表，采用一种通用的检测方法将提取物中某一大类成分全部按代表成分的分子量计算；因此测得的总黄酮含量是一种相对值，它受选取代表化合物的分子量、检测方法等的影响。因此，仅以“总黄酮含量”对黄酮类物质进行表征，难以反映出不同黄酮类物质(如，从不同植物中提取的黄酮类物质或以不同方法从同一种植物中提取的黄酮类物质)的真实特点，不同的黄酮类物质(即使总黄酮含量相同或相近)其包含的具体黄酮类化合物有很大不同，其所反应的药理、药性有巨大的差异。提取方法不同，即使是同一种植物，所得的黄酮类物质也不同。因此，以一种完全不同于现有技术的提取方法从某一植物中提取得到的黄酮类物质，从深层次的诸如黄酮类物质的具体构成、含量或者其物理化学参数的角度看，就是一种新物质，不能因为其属于“黄酮类物质”大类而否认其为新物质。

罗布麻经现代研究发现其中至少有11个大类成分，近50个已知单一化合物：包括黄酮及其取代物、三萜及甾醇、木脂素、香豆素、苷类、有机酸及酯、环醇、二萜、烷类、糖类和氨基酸类。药理研究表明黄酮类成分是其中的主要活性成分类别之一，其中至少有25种化合物：包括金丝桃苷、异槲皮苷、异槲皮苷6′-O-乙酰基、槲皮素、槲皮素3-O-槐糖苷、槲皮素3-O-(2G-葡萄糖基芸香糖苷)、芸香苷、新异芸香苷、山柰酚6′-O-乙酰基、三叶豆苷、紫云英苷、异鼠李素3-O-葡糖苷等；但还不能排除其它成分有活性。因此在保证药效的前提下，尽可能提高提取物的纯度是技术难点。每一种新的提取方法得到的提取物(黄酮类物质)由于包含不同的黄酮类化合物、不同的含量，其药理、药性存在很大差异，都是一种新的物质。

目前罗布麻总黄酮提取物制备方法主要还是水煎法、水煎后醇沉法、醇提法、醇提水沉法等，其出膏率较高(一般在20％以上，最低也在15％以上，则日服剂量也在1.6-2.4g)，特别是分离柱所用材料选用不当，难以将罗布麻提取物中的糖类、鞣质类、氨基酸类、及部分无效黄酮类成分除去，进一步增加了出膏率；这些提取物常具有吸湿性大、服用量大和药效不明显的缺点，因此现有提取方法得到的提取物大都为粗提取物；这里出膏率是指单位干燥药材质量(如100g药材)制备获得的最终干燥提取物的质量(如3g)。出膏率越小，表明提取物精制程度越高；但是只有出膏率还不行，因为如果制备的提取物不含活性成分，则出膏率越小，有可能药理活性会越小。

中国专利“罗布麻有效部位的提取分离方法专利”(CN1385188A)，为大孔吸附树脂分步洗脱方法。采用此方法可以获得较高纯度的罗布麻提取物，但该方法由于需要分步洗脱，成本较高，步骤复杂，出膏率仍较高(其出膏率可达到10％以下，但要达到高纯度的罗布麻提取物，出膏率控制在3％以下，又不降低有效成分含量就很难了)，不易得到稳定的高纯度提取物；中药先进制剂之所以难以开发，难以做到服用方便、携带方便，其关键就是出膏率高、服量过大，难以制备成先进制剂。

发明内容

本发明针对目前无法得到确切表征的高纯度提取物，因而罗布麻都以生药或粗提取物入药的问题，提供一种确切表征的、在医药上有突出作用的罗布麻(高纯度)提取物。

本发明还针对现有罗布麻提取物的提取方法出膏率高、所得提取物都为粗提物的问题，提供一种高纯度罗布麻提取物的提取方法。

本发明是采用如下技术方案实现的：一种罗布麻提取物，(1)以金丝桃苷作为代表成分对该提取物进行测定，提取物中总黄酮含量35％-90％；(2)完全水解该提取物后，槲皮素化合物的含量30％-80％；(3)提取物中，金丝桃苷化合物的含量15％-55％。

本发明所述的罗布麻提取物是以全新的提取方法首次从罗布麻中提取出来的一种新物质，以总黄酮含量、金丝桃苷化合物、槲皮素化合物的含量对其进行确切的表征。目前，以上述表征方式进行表征的黄酮类物质未见相关文献的报道。

采用罗布麻中含量较高而且分子量居中的黄酮类化合物——金丝桃苷——作为代表成分(分子量为466)，采用公知的三氯化铝(AlCl3)和乙酸钠作为黄酮通用显色剂，在紫外可见分光光度仪上的400-420nm处进行测定，这样避免了因为含量测定方法不统一造成的对提取物定义的分歧。由于中药材提取物受中药材产地、采收季节变化和提取方法的不同而有一定的变化，在对罗布麻提取物进行多次测定后，本发明罗布麻总黄酮提取物中总黄酮含量为35％——95％。上述含量测定方法可将不同母核(苷元)的黄酮测定出来。槲皮素具有罗布麻典型的药理特征；将提取物水解，将提取物中结合态的槲皮素解离出来进行定义。提取物中的结合态槲皮素是指与糖或苷的化合物，包括金丝桃苷、异槲皮苷、异槲皮苷6′-O-乙酰基、槲皮素3-O-槐糖苷、槲皮素3-O-(2G-葡萄糖基芸香糖苷)、芸香苷、新异芸香苷等化合物。结合态的槲皮素在体内通常都要水解游离出槲皮素后再发挥生理活性；但作为定义提取物的指标，却有其优点，通过该指标可以明确定义提取物中一组药理活性明确的化合物群。金丝桃苷是罗布麻提取物中主要的黄酮成分，也是其指标成分，有必要对罗布麻高纯提取物的该化合物含量进行定义。

本发明的总黄酮提取物可以进一步采用常规植物化学方法纯化，例如各种色谱柱层析(减压柱层析，葡聚糖凝胶，反相柱层析，制备性高效液相等)，这些方法对于本领域内技术人员来说是不言自明的。因此本发明提取物定义了三个指标，不论其它单体化合物含量如何，只要是从植物罗布麻中提取，并且三项指标在上述范围内，则该提取物在本发明的保护范围内。

本发明所表征的罗布麻提取物是首次从罗布麻中提取出来的一种新物质，不仅精制程度高，而且保留了大部分罗布麻的药理活性，具有降血脂、降血压、预防动脉粥样硬化、抗血栓、肝保护、抗抑郁等作用。而且服用量远小于罗布麻粗体物，其药理、药性与罗布麻粗提物相比有显著区别，具有现代中药“剂量小、毒性小、副作用小”、“高效、速效、长效”的特点，满足了医药领域长期以来对高效、高纯度罗布麻提取物的需求。因此本发明提供的罗布麻提取物在医药领域具有极高的利用价值，能够用于治疗和预防某些心血管疾病如高血脂症，中风、冠心病等和肝损伤，抑郁症以及其它相关病症，对于上述病症的合并症则防治效果更佳。为进一步开发先进制剂提供了良好的基础，如滴丸剂，注射剂，缓、控释制剂等。

本发明所述的罗布麻提取物是一种高纯度的提取物，并且具有显著的药理活性；采用合适指标定义了提取物的特征。中药先进制剂之所以难以开发，难以做到服用方便、携带方便，其关键就是服量过大，难以制备成先进制剂。本发明的高纯度的罗布麻提取物在此方面有着广泛的用途，具有很好的药物开发前景，为提取物的进一步开发奠定了基础。本发明一方面有望给患这些疾病的患者提供一种新的治疗选择，另一方面对于更加有效的利用罗布麻植物资源，拓宽罗布麻植物的应用也具有重要意义。

本发明罗布麻提取物的药效学检测

(1)罗布麻高纯提取物调节异常血脂及抗动脉粥样硬化作用试验及与粗体物的比较

实验方法：Wistar大鼠(280-320g)在实验环境下适应性饲养1周后，眼眶采血作为正常值，低温(-20℃)保存备用。同时于复制模型前采用尾套法测定大鼠血压，然后正常对照组给普通饲料，高脂模型组给予高脂饲料，实验组给高脂饲料的同时给罗布麻粗体物(10倍重量的水提三次后，干燥使用，给药1150mg/kg)和高纯提取物(实施例1，170mg/kg)灌胃。12周后，检测血脂指标(包括总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL))，血压，脂质过氧化物(LPO)。实验数据在SPSS10.0统计软件上完成，各组实验前后的数据比较用t检验，多组比较采用方差分析(ANOVA)，显著性检验取p＜0.05。

表1大鼠高血脂模型各组调脂及抗动脉粥样硬化实验结果(n＝7)

                TC             TG           LDL           HDL          收缩压       舒张压        LPO

组别

                (mmol/l)       (mmol/l)     (mmol/l)      (mmol/l)     (mmHg)       (mmHg)        (nmol/l)

正常对照组      2.11±0.09     0.40±0.05   1.19±0.02    0.79±0.12   109.6±6.2   84.4±8.0     0.34±0.68

高脂模型组      2.39±0.14     0.56±0.07   0.35±0.15    0.71±0.05   155.4±3.3   135.0±1.3    2.78±1.57

粗体物组        2.19±0.08     0.43±0.08   0.98±0.18    0.83±0.11   149.3±3.9   114.8±4.4    0.74±0.15

高纯提取物组    2.27±0.03*    0.36±0.02   1.07±0.09*   1.03±0.02*  86±1.6*     86.7±3.9*    0.34±0.09*

与空白对照组比较：^*p＜0.05

实验结果：高纯提取物给药可以显著降低TC，LDL，并升高HDL；对高血脂伴随的高血压有降压作用，并可降低由高血脂引起的LPO的增加，表明有预防动脉粥样硬化的作用，显示了非常好的综合调脂作用。从与粗体物比较来看，粗体物给药量是高纯提取物的6.7倍，但是其各项指标却均不及高纯提取物，从此也可以看出高纯提取物可以显著减少服用量。

(2)罗布麻高纯提取物抗血栓作用试验及与粗体物的比较

实验方法：Wistar大鼠(280-320g)上述模型复制好后，(粗提物810mg/Kg，实施例2170mg/Kg)，腹腔麻醉，麻醉成功后，将大鼠仰卧绑至实验毛颈部正中切口，纵行切开颈部皮肤、皮下、至肌然后仔细分离右侧颈总动脉约1.5mm，用小块塑料布遮盖伤口周围组织防止组织温度影响血管壁表面温度。将实验性体内血栓形成仪的刺激电极和温度传感器钩于动脉血管上，用1.5mv的直流电持续刺激血管壁，使血管内膜造成损伤，激活血小板和凝血系统的活性，使其逐渐形成血栓。当血栓形成堵塞血管时，血管远端温度突降使仪器报警。从刺激开始到仪器报警时间是血栓形成时间，亦称堵塞值(OT值)。实验中刺激7min后关闭电源，同时由温度传感器检测血管表面的温度变化，记录OT值。

实验结果：与空白对照组相比，罗布麻高纯提取物的血栓出现的时间显著延长，而模型组血栓出现的时间最短表明高纯提取物有很好的抗血栓作用；此外从与粗体物的比较来看，也可看出高纯提取物可以显著减少服用量，且具有优于粗提物的抗血栓作用。

表2抗血栓作用试验结果(n＝7)

                          血栓形成时间OT值

组别

                          (Seconds)

空白对照组                17.5±0.5

高脂模型组                9.8±1.3

粗提物组                  20.6±1.2*

高纯提取物组              30.3±1.2*

与空白对照组比较：^*p＜0.05

罗布麻提取物的提取方法，包括罗布麻上柱液的制备、上柱液上分离柱分离、对分离柱的洗脱、洗脱液浓缩、干燥；分离柱采用聚酰胺树脂，上柱液通过聚酰胺树脂吸附后，先用水或重量浓度为5％-25％的溶剂洗涤，洗脱液弃取；再用重量浓度为40～90％的溶剂洗脱，至洗脱液与三氯化铝无黄酮反应，洗脱液备用，其中洗脱所用的溶剂为低级的醇、酮、酯(如乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯)的一种或几种以任意比例组合的水溶液。本发明优选了聚酰胺树脂作为分离柱材料，可将罗布麻上柱液中的糖类、鞣质类、氨基酸类、及部分无效黄酮类成分等成分除去(即聚酰胺树脂不吸附这些物质)，而保留有效成分及部分有效黄酮类物质(保留的这部分是当前所未充分认识的)。因此，本发明所述的提取方法使提取物的出膏率得到降低(3％以下)(浓缩率得到提高)。洗脱液的选取及浓度，直接影响最终提取物所含组份和含量，即决定提取方法是否能得到前述表征的提取物；本发明所用的洗脱液及浓度以及聚酰胺树脂柱的确定是在大量的实验基础上得出的，与现有的提取方法相比具有突出的实质性特点，并带来显著进步(体现在降低了出膏率，得到了本发明所要求保护的高纯度的提取物)。

罗布麻上柱液在静置后通常含有大量的胶体物质、悬浮的小颗粒不溶物等，这些物质会严重堵塞树脂柱，影响树脂柱的寿命；其次罗布麻上柱液中含有大量强吸附性物质，聚酰胺对此类物质的吸附力较大，应提前除去，否则也会影响树脂柱的寿命。为此，本发明在上柱液上柱前，在上柱液中加入澄清剂来进行澄清、纯化处理，澄清剂是甲壳素类、蛋白类、ZTC澄清剂的其中一种溶液或甲壳素类、蛋白类、ZTC澄清剂中的任两种以1-2∶1-2比例制成的溶液，甲壳素类、蛋白类、ZTC澄清剂单独或两种组合的用量占罗布麻用量的0.2％-2％(g/g)。澄清剂用量少达不到澄清、纯化的目的，澄清剂用量过多会造成所需有效成份的损失。

由于上柱液的复杂性，一种澄清剂常常不能达到较好的澄清效果，多需要联合使用；但采用其中任何一种也可将上柱液澄清，只是效果稍有不同，影响不大。因此本发明在于可采用澄清剂对罗布麻上柱液进行上柱前处理。本发明中的蛋白类澄清剂是指明胶。本发明中的甲壳素类澄清剂是指甲壳素，或以甲壳素为原料的各种衍生物(如脱乙酰甲壳素，也称壳聚糖)制成的澄清剂。ZTC澄清剂是市场上公开出售的现有产品，其包括A组份和B组份。

本发明采用的聚酰胺树脂可以是各种粒度范围的树脂，也可以是各种颗粒形状的树脂如：粉末状、颗粒状和球状树脂。

用水或重量浓度为5％-25％的溶剂洗涤，主要是除去过量的样品溶液、不吸附的糖类、氨基酸类、吸附力较弱的苷类和一些小分子酚性物质等，将洗脱液弃取；然后可直接使用重量浓度为40～90％的溶剂洗脱，直至洗脱液与三氯化铝无黄酮反应；洗脱液浓缩，并将浓缩液进行干燥，可得总黄酮提取物；用水或重量浓度为5％-25％的溶剂洗涤过度会将所需的有效成份洗掉，洗涤不足不能将不吸附的糖类、氨基酸类、吸附力较弱的苷类和一些小分子酚性物质等充分洗掉，将会影响出膏率。本发明为进一步优化提取方法，用1-5倍树脂柱体积的水或重量浓度为5％-25％的溶剂洗涤。

本发明中的水可以是不加任何物质的纯水，也可以是加入适当的改性剂如，少量的酸、碱或盐这些都是本领域内的公知共用的方法；本发明中重量浓度为5％-25％的溶剂是指，以水为溶剂的低级的醇、酮、酯等的一种或几种的组合，如乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯；也可以加入适当的改性剂如，少量的酸、碱或盐；本发明中重量浓度为40％-90％的溶剂是指，以水为溶剂的低级的醇、酮、酯等的一种或几种的组合，如乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯；也可以加入适当的改性剂如，少量的酸、碱或盐。本发明优选水为除杂溶剂，50％-85％的乙醇为洗脱剂。

本发明中经纯化后的洗脱液采用浓缩、干燥技术后，即可得到高纯度的提取物。其中浓缩可采用减压浓缩、薄膜浓缩等方法；干燥可采用常压烘干、减压干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等技术。这些方法均是本领域内的公知公用的方法。

本发明的上柱液制备，采用本领域内公知公用的方法，可用含水或不含水甲醇、乙醇、丙酮，乙酸乙酯、正丁醇、正己烷或类似物之一种或几种任意比例的混合物作溶剂，或由这些溶剂与酸、碱配成的酸性或碱性溶剂进行提取，可以经过加热回流、渗漉、超声提取、微波提取或高压提取等方法提取。本发明优选25-85％乙醇回流提取。

本发明的原料为罗布麻的叶，提取前可经干燥或烘干处理。其中罗布麻是指夹竹桃科(Apocynaceae)植物，其来源有：罗布麻属罗布麻，学名Apocynum venetum L.又称红麻(Apocynum Lancifolium Rus)；白麻属白麻(别名紫斑罗布麻Poacynum pictum[Sohnenk]Baill)和大叶白麻(别名大花罗布麻Poacynum hendersonni[Hook.f]Woodson)。(中国植物志(第六十三卷).科学出版社：北京.1977：157-163)

以本发明所述的提取方法可得到本发明所述的罗布麻提取物。采用聚酰胺树脂作为分离手段，可除去大量杂质，因而使有效成分富集、出膏率低(3％以下)，同时完成了除杂和浓缩两道工序，与传统方法相比，这种方法的生产周期缩短，产品稳定性增强，而且可除去药材中的有毒成份和污染的有害金属或重金属元素。本发明所述的提取方法优选澄清剂进行上柱液前处理，可明显延长分离柱的寿命。

附图说明

图1为实施例1金丝桃苷HPLC图谱；

图2为实施例1水解槲皮素HPLC图谱；

图3为实施例2金丝桃苷HPLC图谱；

图4为实施例2水解槲皮素HPLC图谱；

图5为实施例3金丝桃苷HPLC图谱；

图6为实施例3水解槲皮素HPLC图谱；

具体实施方式

实施例1.

1.罗布麻高纯提取物的制备

取罗布麻叶(200℃烘烤1小时)300g，在85℃-100℃的温度下，以3000mL的40％乙醇水回流提取3次(3000mL×3)，每次0.5hr，合并提取液，室温下静置过夜、过滤，去沉淀，滤液减压浓缩(60℃，0.08-0.1MPa)，至总体积900mL，浓缩液加1％壳聚糖的乙酸溶液180mL(相当于1.8克壳聚糖，可制成其它浓度的壳聚糖溶液，只要使壳聚糖充分溶解即可)，搅拌2min，室温静置2-4hr，抽滤，弃去残渣，上清夜过处理好的聚酰胺树脂柱(柱体积约300mL，流速300mL/hr)，以FeCl3反应检测流出液，以确证树脂是否吸附饱和；随后以600mL水，用盐酸调pH为3后，进行洗脱除杂，然后用70％乙醇水溶液洗脱至无AlCl3反应，洗脱流速约300mL/hr收集70％乙醇水溶液并减压浓缩(60℃，0.08-0.1MPa)至近干；水浴蒸干后，80℃烤箱干燥12-72hr，得黄棕色至黄色粉末，为罗布麻高纯提取物，总量为5.42g(含水量≤5％)。出膏率为1.8％。

2、含量测定：

(1)金丝桃苷的测定：

色谱条件：固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)；流动相：乙腈∶四氢呋喃∶1.1％乙酸(15.5∶5.5∶79)；流速：1ml/min；检测波长：360nm；进样量：10-20μl，所得HPLC图谱如图1示，其中保留时间(min)为9的为金丝桃苷。罗布麻高纯提取物(实例1)的金丝桃苷含量为17.8％。

(2)总槲皮素的测定：

样品水解条件：取10mg样品至50ml量瓶中，加80％的甲醇溶解定容，取10ml续滤液加1ml盐酸回流水解1小时后，定容至25ml得供试液。

色谱条件：固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)；流动相：甲醇∶0.4％磷酸(50∶50)；流速：1ml/min；检测波长：360nm；进样量：10-20μl，所得HPLC图谱如图2示，其中保留时间(min)为10的为槲皮素。罗布麻高纯提取物(实例1)水解后的槲皮素含量为36.7％。

(3)总黄酮的含量测定

对照品溶液制备：

精密称取金丝桃苷对照品(120℃下减压干燥至恒重)适量，用甲醇配置成1ml含0.06mg的溶液。

供试品溶液制备：

精密称取干燥本品(实施例1)20mg，置于100mL量瓶中，加入甲醇溶液溶解，定容至刻度，摇匀，备用。

测定方法：取对照品溶液及供试品溶液，置10mL容量瓶中，用甲醇加至5mL，经AlCl3和乙酸钠显色后，按分光光度法(中国药典2000版附录IVA)，在400nm处测定吸光度，实例1总黄酮物质含量为42.8％。

实施例2.

1.罗布麻高纯提取物的制备

取干燥大叶白麻叶300g，在85℃-100℃的温度下，以60％乙醇水回流提取3次(3750，2700mL，2400)，每次1hr，合并提取液，室温下静置过夜、过滤，去沉淀，滤液减压浓缩(60℃，0.08-0.1MPa)，至总体积900mL，浓缩液加1％壳聚糖的乙酸溶液180mL后，再加1％的明胶溶液180mL搅拌2min，室温静置2-4hr，抽滤，弃去残渣，上清夜过处理好的聚酰胺树脂柱(柱体积约300mL，流速300mL/hr)，以FeCl3反应检测流出液，以确证树脂是否吸附饱和；随后以600mL10％的乙醇进行洗脱，洗脱液弃去，再用60％乙醇和丙酮水溶液洗脱，洗脱至无AlCl3反应，洗脱流速约300mL/hr，收集60％乙醇和甲醇水溶液并减压浓缩(60℃，0.08-0.1MPa)至近干；水浴蒸干后，80℃烤箱干燥12-72hr，得黄棕色至黄色粉末，为罗布麻高纯提取物，总量为3.66g(含水量≤5％)。出膏率为1.22％。

含量测定：

(1)金丝桃苷的测定：

色谱条件：固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)；流动相：乙腈∶四氢呋喃∶1.1％乙酸(15.5∶5.5∶79)；流速：1ml/min；检测波长：360nm；进样量：10-20μl，所得HPLC图谱如图3示，其中保留时间(min)为9的为金丝桃苷。罗布麻高纯提取物(实例2)的金丝桃苷含量为50.3％。

(2)总槲皮素的测定：

样品水解条件：取10mg样品至50ml量瓶中，加80％的甲醇溶解定容，取10ml续滤液加1ml盐酸回流水解1小时后，定容至25ml得供试液。

色谱条件：固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)；流动相：甲醇∶0.4％磷酸(50∶50)；流速：1ml/min；检测波长：360nm；进样量：10-20μl，所得HPLC图谱如图4示，其中保留时间(min)为10的为槲皮素。罗布麻高纯提取物(实例2)水解后的槲皮素含量为66.0％。

(3)总黄酮的含量测定

对照品溶液制备：

精密称取金丝桃苷对照品(120℃下减压干燥至恒重)适量，用甲醇配置成1ml含0.06mg的溶液。

供试品溶液制备：

精密称取干燥本品(实施例2)20mg，置于100mL量瓶中，加入甲醇溶液溶解，定容至刻度，摇匀，备用。

测定方法：取对照品溶液及供试品溶液，置10mL容量瓶中，用甲醇加至5mL，经AlCl3和乙酸钠显色后，按分光光度法(中国药典2000版附录IVA)，在400nm处测定吸光度，实例2总黄酮物质含量为82.5％。

实施例3.

1.罗布麻高纯提取物的制备

取干燥紫斑罗布麻叶300g，在85℃-100℃的温度下，以45％乙醇水回流提取3次(3000mL，2700mL，2400mL)，每次1hr，合并提取液，室温下静置过夜、过滤，去沉淀，滤液减压浓缩(60℃，0.08-0.1MPa)，至总体积900mL，浓缩液加1％ZTC溶液A组分160mL，再加加1％ZTC溶液B组分160mL搅拌2min，室温静置2-4hr，抽滤，弃去残渣，上清夜过处理好的聚酰胺树脂柱(柱体积约300mL，流速300mL/hr)，以FeCl3反应检测流出液，以确证树脂是否吸附饱和；随后以900mL水洗脱，弃去洗脱液，然后用85％甲醇水溶液洗脱，洗脱至无AlCl3反应，洗脱流速约300mL/hr收集85％甲醇水溶液并减压浓缩(60℃，0.08-0.1MPa)至近干；水浴蒸干后，80℃烤箱干燥12-72hr，得黄棕色至黄色粉末，为罗布麻高纯提取物，总量为3.39g(含水量≤5％)。出膏率为1.13％。

含量测定：

(1)金丝桃苷的测定：

色谱条件：固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)；流动相：乙腈∶四氢呋喃∶1.1％乙酸(15.5∶5.5∶79)；流速：1ml/min；检测波长：360nm；进样量：10-20μl，所得HPLC图谱如图5示，其中保留时间(min)为9的为金丝桃苷。罗布麻高纯提取物(实例3)的金丝桃苷含量为26.8％。

(2)总槲皮素的测定：

样品水解条件：取10mg样品至50ml量瓶中，加80％的甲醇溶解定容，取10ml续滤液加1ml盐酸回流水解1小时后，定容至25ml得供试液。

色谱条件：固定相ODS柱(4.6mm I.D.×150mm，5μm)；流动相：甲醇∶0.4％磷酸(50∶50)；流速：1ml/min；检测波长：360nm；进样量：10-20μl，所得HPLC图谱如图6示，其中保留时间(min)为10的为槲皮素。罗布麻高纯提取物(实例3)水解后的槲皮素含量为47.8％。

(3)总黄酮的含量测定

对照品溶液制备：

精密称取金丝桃苷对照品(120℃下减压干燥至恒重)适量，用甲醇配置成1ml含0.06mg的溶液。

供试品溶液制备：

精密称取干燥本品(实施例3)20mg，置于100mL量瓶中，加入甲醇溶液溶解，定容至刻度，摇匀，备用。

测定方法：取对照品溶液及供试品溶液，置10mL容量瓶中，用甲醇加至5mL，经AlCl3和乙酸钠显色后，按分光光度法(中国药典2000版附录IVA)，在400nm处测定吸光度，实例3总黄酮物质含量为59.8％。

Claims (5)

1、一种罗布麻提取物，其特征为：

(1)以金丝桃苷作为代表成分对该提取物进行测定，提取物中总黄酮含量35％-90％；

(2)完全水解该提取物后，槲皮素化合物的含量30％-80％；

(3)提取物中，金丝桃苷化合物的含量15％-55％。

2、一种如权利要求1所述的罗布麻提取物的提取方法，包括罗布麻上柱液的制备、上柱液上分离柱分离、对分离柱的洗脱、洗脱液浓缩、干燥；其特征为：分离柱采用聚酰胺树脂，上柱液通过聚酰胺树脂吸附后，先用水或重量浓度为5％-25％的溶剂洗涤，洗脱液弃取；再用重量浓度为40～90％的溶剂洗脱，至洗脱液与三氯化铝无黄酮反应，洗脱液备用，其中洗脱所用的溶剂为低级的醇、酮、酯的一种或几种以任意比例组合的水溶液。

3、如权利要求2所述的提取方法，其特征为：用1-5倍树脂柱体积的水或重量浓度为5％-25％的溶剂洗涤。

4、如权利要求2或3所述的提取方法，其特征为：优选水为除杂溶剂，50％-85％的乙醇为洗脱剂。

5、如权利要求2或3所述的提取方法，其特征为：在上柱液上柱前，在上柱液中加入澄清剂来进行澄清、纯化处理，澄清剂是甲壳素类、蛋白类、ZTC澄清剂的其中一种溶液或甲壳素类、蛋白类、ZTC澄清剂中的任两种以1-2∶1-2比例制成的溶液，甲壳素类、蛋白类、ZTC澄清剂单独或两种组合的用量占罗布麻用量的0.2％-2％。

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