CN105663190B - 罗布麻提取物及其纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种罗布麻提取物及其纯化方法。本发明的罗布麻提取物中，总黄酮含量在65wt％以上，鞣质含量低于16wt％；所述的总黄酮含量采用液相色谱测定。本发明的纯化方法通过使用酰胺化的聚丙烯酸酯树脂、并控制吸附条件，可以有效提高罗布麻提取物中的总黄酮含量、且有效去除鞣质。

Description

罗布麻提取物及其纯化方法

技术领域

本发明涉及一种罗布麻提取物及其纯化方法，尤其是一种罗布麻黄酮含量很高的罗布麻提取物及其纯化方法。

背景技术

罗布麻是夹竹桃科植物。作为一种传统中药材，罗布麻提取物可以用于治疗高血压、心脑缺血等疾病。罗布麻叶中含有黄酮，有机酸及鞣质成分。由于黄酮和鞣质结构相近，通常的提取方法无法将二者分离开。

现代化的分离纯化技术，如二氧化碳超临界萃取技术、高速逆流色谱技术、工业制备色谱技术、大孔吸附树脂技术以及微波、超声等辅助设备的开发，使得高纯度有效成分提取物的制备成为可能。

在目前开发的分离方法中，适于大规模工业化制备的生产工艺的分离方法并不是很多。大孔树脂吸附分离法由于其低成本、无污染、操作简便、易于工业化等优势在天然植物提取分离中占据重要地位。但是，大孔吸附树脂具有广谱吸附作用，使它对某一吸附质或者对某一类吸附质的吸附选择性并不好，这导致提取物的纯度不高。例如，CN1385188A公开了一种罗布麻有效部位的提取分离方法，包含罗布麻上柱液的制备步骤、由分离柱进行分离的步骤、用洗脱剂对分离柱进行洗脱的步骤以及对洗脱液进行浓缩的步骤，其中分离柱为大孔吸附树脂柱，在洗脱步骤首先采用20-39％的乙醇水溶液洗脱，再用40-70％的乙醇水溶液洗脱。该专利文献声称可以获得总黄酮含量达到50wt％以上的浸膏。但是该方法并没有给出总黄酮含量的测试方法。CN1634325A公开了一种罗布麻提取物及其提取方法，声称其提取物中总黄酮含量35-90％。上述总黄酮含量是通过紫外光谱测定的，该方法对于罗布麻总黄酮含量的测定专属性不强，误差非常大。本申请的发明人发现，液相色谱(HPLC)适合于总黄酮含量的测定，测定的数据较为准确。本申请的发明人也发现，上述两篇专利文献的提取物中总黄酮含量在50wt％以下(液相色谱测定)。因此，目前尚未制备出来总黄酮含量很高的罗布麻提取物。

目前，关于中药成分常用的除鞣质方法主要有热处理冷置法、明胶沉淀法、酸性醇沉法、碱性醇沉法和铅盐沉淀法等，但是，大多方法的选择性差(廖学品等，中草药提取物中单宁(鞣质)的选择性脱除，天然产物研究与开发，第16卷第1期，第10-15页，2004年)。除鞣质方法还包括聚酰胺法，但是这种方法存在不能用于酸性环境、流速慢和混入低分子杂质等问题。因此，需要寻找一种简单且易于工业化生产的方法，其可以将黄酮纯化、并将鞣质分离出来。

发明内容

为克服现有技术的缺陷，本申请的发明人进行了深入研究。本发明的一个目的是提供一种罗布麻提取物，其总黄酮含量高、但鞣质含量低。

本发明的另一个目的在于提供一种纯化方法，该方法可以显著提高罗布麻提取物中的总黄酮含量，且可以将罗布麻粗提物中的一部分鞣质分离出来。

本发明提供一种罗布麻提取物，所述的罗布麻提取物的总黄酮含量在65wt％以上，鞣质含量低于16wt％；所述的总黄酮含量采用液相色谱测定。

根据本发明所述的罗布麻提取物，优选地，所述的罗布麻提取物的总黄酮含量在70～85wt％，鞣质含量为5～15wt％；所述的总黄酮含量采用液相色谱测定。

本发明还提供一种罗布麻提取物的纯化方法包括如下具体步骤：

(1’)将罗布麻粗提物分散于第一乙醇水溶液中形成吸附液，所述吸附液中的罗布麻粗提物浓度为5～10mg/ml；其中，所述罗布麻粗提物的总黄酮含量低于20wt％，鞣质含量在7wt％以上，所述的总黄酮含量采用液相色谱测定；

(2’)将罗布麻黄酮纯化树脂装入吸附柱；其中，所述的罗布麻黄酮纯化树脂为酰胺化的聚丙烯酸酯树脂，粒径为0.3～1.0mm、比表面积为70～150m²/g干树脂和平均孔径为10～30nm；

(3’)将1～2BV的所述吸附液加入步骤(2’)获得的吸附柱中，以1～2BV/h的吸附速率将所述吸附液通过所述吸附柱，吸附完毕后，用1～2BV的水洗涤所述吸附柱，再用第二乙醇水溶液对所述吸附柱进行洗脱，收集解吸液，干燥后得到罗布麻提取物；其中，所述的BV表示柱体积单位。

根据本发明所述的纯化方法，优选地，所述的第一乙醇水溶液含有5～20vt％的乙醇；所述吸附柱的长径比为5～20:1；所述的第二乙醇水溶液含有60～85vt％的乙醇。

根据本发明所述的纯化方法，优选地，所述的第一乙醇水溶液含有12～15vt％的乙醇；所述吸附柱的长径比为10～20:1；所述的第二乙醇水溶液含有65～70vt％的乙醇。

根据本发明所述的纯化方法，优选地，所述的罗布麻黄酮纯化树脂的粒径0.4～0.8mm、比表面积为80～130m²/g干树脂和平均孔径为15～25mm。

根据本发明所述的纯化方法，优选地，所述的罗布麻黄酮纯化树脂以正庚烷为致孔剂进行制备得到。

根据本发明所述的纯化方法，优选地，所述的罗布麻黄酮纯化树脂通过如下方法制备得到：

以丙烯酸酯为单体，二乙烯苯为交联剂，以偶氮二异丁腈ABIN、偶氮二异庚腈ABVN或过氧化苯甲酰BPO为引发剂，以正庚烷为致孔剂通过悬浮聚合步骤得到酯基树脂，然后经过胺解和酰胺化步骤得到罗布麻黄酮纯化树脂；

其中，所述的致孔剂用量为丙烯酸酯和二乙烯苯总量的101wt％～150wt％。

根据本发明所述的纯化方法，优选地，所述的悬浮聚合步骤为：将丙烯酸酯、二乙烯苯、引发剂和致孔剂混合均匀形成油相，然后将该油相加入到分散介质中，调节搅拌速度以使得分散介质中形成的油珠尺寸控制在0.4～0.8mm之间；保持该搅拌速度，并以0.1～0.6℃/min的第一速度升温至65～80℃，保持3～6小时；继续以0.1～0.6℃/min的第二速度升温至85～90℃，并保持3～6小时以形成酯基树脂。

根据本发明所述的纯化方法，优选地，所述罗布麻粗提物通过如下方法制备：

(1’)将粉碎的罗布麻叶用60～78vt％的乙醇水溶液在60～80℃下加热回流，得到粗提取液；

(2’)将所述的粗提取液旋蒸，在蒸出乙醇的同时补加水，旋蒸至粗提取液中乙醇含量为5～20vt％，将所得溶液抽滤，即得吸附溶液；

(3’)将所述吸附溶液在苯乙烯型树脂上进行吸附分离，吸附速率为1～2BV/h，然后用75～85vt％的乙醇水溶液洗脱得到解吸液；

(4’)将所述的解吸液在50～70℃下真空干燥得到罗布麻粗提物。

采用传统方法并不能有效地提高罗布麻提取物中的总黄酮含量。本发明的纯化方法通过使用酰胺化的聚丙烯酸酯树脂、并控制吸附条件，可以有效提高罗布麻提取物中的总黄酮含量、且有效去除鞣质。

附图说明

图1为制备例1的酯基树脂和酰胺基树脂的红外光谱图。

图2为槲皮素和山奈酚标准品的HPLC谱图。

图3为实施例1的罗布麻粗提物水解后的HPLC谱图。

图4为实施例1的罗布麻提取物水解的HPLC谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

本发明中，“％”表示重量百分比，除非特别声明或标注。

在本发明中，“吸附柱”、“树脂吸附柱”、“树脂柱”具有相同的含义，均表示用于吸附分离的柱子。

在本发明中，所述的BV表示柱体积单位。

<罗布麻提取物>

本发明的罗布麻提取物的总黄酮含量在65wt％以上，优选为70～85wt％，更优选为80～85wt％；鞣质含量低于16wt％，优选为5～15wt％，更优选为10～15wt％。

本发明的总黄酮含量采用高效液相色谱(HPLC)测定。具体测试条件如下：

a.对照品溶液的制备

精密称取槲皮素对照品5.4mg，山奈酚对照品3.7mg置于同一50ml量瓶中，加80％甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液(槲皮素浓度为108mg·L^-1，山奈酚浓度为74mg·L^-1)。

b.样品溶液制备

取适量罗布麻粗提取液，将体积比为20:3的罗布麻粗提取液与浓盐酸加入锥形瓶中，于恒温水浴锅中90℃水浴中加热回流2h，取出，冷却后，转移至容量瓶中，用70％乙醇定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，用HPLC法测得其总黄酮含量。

c.液相色谱(HPLC)条件

采用高效液相色谱仪(Aglient-1260美国安捷伦科技有限公司生产)进行液相色谱操作。使用Aglient-1260紫外检测器和反相AgligentC18(15μm，150mm×4.6mmI.D)色谱柱。流动相：甲醇-0.4％磷酸溶液(体积比为50:50)，检测波长为360nm，柱温25℃，流速为1.0ml·min^-1，进样量10μl。

在上述条件下，槲皮素与山奈酚能与其他成分达到较好的分离，且理论塔板数均不低于3000。

槲皮素与山奈酚标准品、罗布麻粗提物水解后的、罗布麻提取物水解后的HPLC谱图参见图2-4。

d.罗布麻叶的总黄酮含量的计算

罗布麻叶中的黄酮苷水解后的绝大部分成为槲皮素和山奈酚。根据HPLC法测得的槲皮素和山奈酚峰面积计算槲皮素和山奈酚的含量。将6-O-乙酰基异槲皮苷的分子量(505.4)和6-O-乙酰基黄芪苷的分子量(490.4)相加之和除以2，得到平均分子量为497.9的黄酮醇乙酸酯苷作为总的罗布麻叶黄酮醇苷的代表。根据苷元槲皮素的分子量(302.23)和山奈酚的分子量(286.23)计算出黄酮醇乙酸酯苷对槲皮素和山奈酚的转换因子分别为1.65和1.74，再根据下式计算罗布麻叶中总黄酮醇苷的含量。(光琴、周亚球，HPLC测定罗布麻叶中总黄酮的含量，中国实验方剂学杂志，第17卷第6期，第103-106页，2011年)

罗布麻叶总黄酮醇苷含量＝槲皮素含量×1.65+山奈酚含量×1.74

e.总黄酮化合物的纯度的计算

M_烘干：溶液烘干后质量(mg)；

M_e：溶液中总黄酮质量(mg)。

本发明的鞣质含量采用分光光度计测定(樊珍珍等，正交试验优选罗布麻叶中总鞣质提取工艺，中国实验方剂学杂志，第19期第7期，第13-16页，2013年)，具体测试条件如下：

a.磷钼钨酸试剂的配制

取钨酸钠100g，钼酸钠25g，加水700ml使其溶解，加盐酸100ml，磷酸50ml，加热回流10h，放置冷却，再加硫酸锂150g、水50ml和溴0.2ml，煮沸除去残留的溴(约15min)。冷却，加水稀释至1000ml后滤过即得。本液不得显绿色；如放置后变为绿色，可加溴0.2ml，煮沸除去多余的溴即可。

b.对照品溶液的制备

精密称取没食子酸对照品25mg，置于50ml棕色容量瓶中，加水溶解，定容至刻度，精密量取5ml，置于25ml棕色容量瓶中加水至刻度，摇匀，即得。

c.标准曲线的测定

精密量取对照品溶液0.25、0.5、1、1.5、2、2.5ml，分别置于25ml棕色容量瓶中，分别加磷钼钨酸试液1ml，依次精密加20wt％碳酸钠溶液12ml，加水稀释至刻度，摇匀，放置30min:，以水为空白，于760nm处测定吸光度(A)，以A为纵坐标，质量浓度为横坐标，测得对照品的回归线方程，即为标准曲线。

d.总酚含量

精密量取供试品溶液0.2ml，置于25ml棕色容量瓶中，按方法a～c测定吸光度，利用标准曲线计算其质量浓度。

e.不被吸附的多酚含量

精密量取供试品溶液25ml，加入至已有干酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中，密塞，置于30℃水浴中保温1h，时时振摇，取出，放冷，摇匀，过滤弃掉初滤液，取续滤液0.2ml置25ml棕色量瓶中，按方法a～c测定吸光度，利用标准曲线计算其质量浓度。

f.鞣质的计算方法

通过测定对照品的吸光度，得出标准曲线。再分别测定干酪素吸附前后样品的吸光度，将测定的吸光度A代入标准曲线中得出该溶液中的酚类化合物的浓度C。

鞣质含量＝总酚量－不被吸附多酚含量

<纯化方法>

在本发明中，罗布麻粗提物与罗布麻提取物具有不同的含义，根据总黄酮含量的不同而区别。在本发明中，罗布麻粗提物的总黄酮含量低于20wt％，鞣质含量在7wt％以上；罗布麻提取物的总黄酮含量在65wt％以上，鞣质含量低于16wt％。本发明的总黄酮含量采用液相色谱测定，以保证测试数据的准确性。

在本发明中，将罗布麻提取物的纯化方法包括吸附液制备步骤(1’)；装柱步骤(2’)；吸附分离步骤(3’)。在本发明中，步骤(1’)、(2’)的顺序并没有特别限制，可以按照步骤(1’)和(2’)的顺序进行，也可以按照步骤(2’)和(1’)的顺序进行。

本发明的步骤(1’)为：将罗布麻粗提物分散于第一乙醇水溶液中形成吸附液，所述吸附液中的罗布麻粗提物浓度为5～10mg/ml。

在本发明的步骤(1’)中，所述的第一乙醇水溶液含有5～20vt％、优选为8～18vt％、更优选为10～15vt％的乙醇。第一乙醇水溶液用于将罗布麻粗提物分散，并溶解其中的黄酮组分。作为优选，本发明吸附液中的罗布麻粗提物浓度可以为6～8mg/ml。

本发明的步骤(2’)为：将上述罗布麻黄酮纯化树脂装入吸附柱。所述吸附柱的长径比(柱长/柱直径)为5～20:1，优选为10～15:1。这样可以保证吸附分离效果，提高提取物中的黄酮含量。

本发明的步骤(2’)中，所述的罗布麻黄酮纯化树脂为酰胺化的聚丙烯酸酯树脂。本发明的纯化树脂的形状可以为球形。粒径为0.3～1.0mm，优选为0.4～0.8mm；比表面积为70～150m²/g干树脂，优选为80～130m²/g干树脂；含水量为60～70％，优选为62～65％；平均孔径为10～30nm，优选为15～25mm。采用上述吸附分离树脂，可以大幅度提高提取物中的总黄酮含量。

本发明的步骤(3’)为：将1～2BV、优选为1.5～2BV的所述吸附液加入步骤(2’)获得的吸附柱中，以1～2BV/h、优选为1～1.5BV/h的吸附速率将所述吸附液通过所述吸附柱，吸附完毕后，用1～2BV、优选为1～1.5BV/h的水洗涤所述吸附柱，再用第二乙醇水溶液对所述吸附柱进行洗脱，收集解吸液，干燥后得到罗布麻提取物。通过控制吸附速率，可以进一步提高罗布麻提取物中总黄酮含量，同时避免其损失。将上述步骤获得的流出液进行检测，得到几乎不含黄酮的鞣质样品，这进一步证明总黄酮的损失很少，且鞣质得到有效去除。

在本发明的步骤(3’)中，所述的第二乙醇水溶液含有60～85vt％、优选为70～80vt％的乙醇。根据本发明的一个具体实施方式，将1.5～2BV的所述吸附液加入步骤(2’)获得的吸附柱中，以1～1.5BV/h的吸附速率将所述吸附液通过所述吸附柱，吸附完毕后，用1～1.5BV的水洗涤所述吸附柱，再用第二乙醇水溶液对所述吸附柱进行洗脱，收集解吸液，干燥后得到罗布麻提取物。

在本发明中，所述的罗布麻黄酮纯化树脂优选为以正庚烷为致孔剂进行制备得到的树脂。根据本发明的一个具体实施方式，所述的罗布麻黄酮纯化树脂通过如下方法制备得到：

以丙烯酸酯为单体，二乙烯苯为交联剂，以偶氮二异丁腈ABIN、偶氮二异庚腈ABVN或过氧化苯甲酰BPO为引发剂，以正庚烷为致孔剂通过悬浮聚合步骤得到酯基树脂，然后经过胺解和酰胺化步骤得到罗布麻黄酮纯化树脂；其中，所述的致孔剂用量为丙烯酸酯和二乙烯苯总量的101wt％～150wt％。本申请的发明人发现，将致孔剂的用量控制在合适的范围，例如101wt％～150wt％，能保证获得黄酮纯度更高的罗布麻提取物。

在本发明中，所述的悬浮聚合步骤可以为：将丙烯酸酯、二乙烯苯、引发剂和致孔剂混合均匀形成油相，然后将该油相加入到分散介质中，调节搅拌速度以使得分散介质中形成的油珠尺寸控制在0.4～0.8mm之间；保持该搅拌速度，并以0.1～0.6℃/min的第一速度升温至65～80℃，保持3～6小时；继续以0.1～0.6℃/min的第二速度升温至85～90℃，并保持3～6小时以形成酯基树脂。

在本发明的悬浮聚合步骤中，所述的丙烯酸酯可以选自丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯的一种或多种；优选为丙烯酸甲酯或丙烯酸乙酯；更优选为丙烯酸甲酯。本申请的发明人发现，甲基丙烯酸甲酯等疏水性大的单体，由于胺解困难、且树脂疏水性较强，并不适合于本发明。在本发明中，所述的二乙烯苯剂用量为丙烯酸酯和二乙烯苯总量的15wt％～45wt％，优选为20wt％～40wt％，更优选为20wt％～30wt％。在本发明中，所述的引发剂可以为偶氮二异丁腈ABIN、偶氮二异庚腈ABVN或过氧化苯甲酰BPO；优选为偶氮二异丁腈ABIN。在本发明中，所述的引发剂用量可以为丙烯酸酯和二乙烯苯总量的1.1wt％～2.0wt％，优选为1.3wt％～1.5wt％。在本发明中，所述的分散介质可以选自浓度为1.0-1.5wt％的聚乙烯醇水溶液或浓度为1.0-1.5wt％的明胶水溶液；优选为浓度为1.0-1.5wt％的聚乙烯醇水溶液。

在本发明的悬浮聚合步骤中，所述的油珠尺寸可以控制在0.5～0.7mm之间，更优选为0.55～0.65mm之间；所述的第一速度可以为0.2～0.5℃/min，更优选为0.4～0.5℃/min；所述的第二速度可以为0.2～0.5℃/min，更优选为0.4～0.5℃/min。本申请的发明人发现，采用上述工艺条件获得的纯化树脂，更有利于获得黄酮纯度更高的罗布麻提取物。

在本发明中，胺解步骤为将酯基树脂烘干，然后采用溶胀试剂进行溶胀5～24小时，然后与过量的胺解试剂在110～140℃下反应5～15小时，再用蒸馏水将溶胀后的酯基树脂洗涤至中性，得到胺基树脂。在本发明中，酰胺化步骤为将胺基树脂与过量的醋酸酐在80～90℃下反应5～15小时，得到罗布麻黄酮纯化树脂。

在本发明中，所述罗布麻粗提物通过如下方法制备：

(1’)将粉碎的罗布麻叶用60～78vt％的乙醇水溶液在60～80℃下加热回流，得到粗提取液；

(2’)将所述的粗提取液旋蒸，在蒸出乙醇的同时补加水，旋蒸至粗提取液中乙醇含量为5～20vt％，将所得溶液抽滤，即得吸附溶液；

(3’)将所述吸附溶液在苯乙烯型树脂上进行吸附分离，吸附速率为1～2BV/h，然后用75～85vt％的乙醇水溶液洗脱得到解吸液；

(4’)将所述的解吸液在50～70℃下真空干燥得到罗布麻粗提物。

在本发明的步骤(1’)中，粉碎的罗布麻叶的粒径可以为小于等于50目，更优选为小于等于40目。乙醇水溶液中的乙醇浓度优选为65～75vt％，更优选为68～70vt％；加热回流的温度优选为65～75℃，更优选为68～70℃。步骤(2’)中，旋蒸至粗提取液中乙醇含量优选为10～15vt％。步骤(3’)中，吸附速率优选为1～1.5BV/h；乙醇水溶液中的乙醇浓度优选为65～75vt％，更优选为68～70vt％；苯乙烯型树脂的实例包括但不限于HPD-100、HPD-300型大孔吸附树脂。HPD-100型大孔吸附树脂是苯乙烯型非极性共聚体，适用于皂甙类、黄酮类、萜类等天然产物及植物的提取分离。步骤(4’)中，真空干燥的温度优选为60～65℃。

下面将详细描述本发明实施例中所使用的测试方法：

<测试方法说明>

1、树脂的含水率测定

准确称取一定量树脂干球置于称量瓶中，置于110℃烘箱中烘干4h，取出后置于干燥器中冷却，冷却后称重。用以下公式计算树脂的含水率:

x＝(w2-w3)/(w2-w1)×100％

式中：x为含水率，w1为称量瓶的重量，w2为称量瓶和试样重量，w3为称量瓶和干燥后试样的重量。

2、树脂的红外光谱测定

将树脂样品在110℃下烘干、研碎，取2～3mg研碎的树脂样品与200～300mg干燥的KBr粉末在玛瑙研钵中混匀，充分研细至颗粒直径小于2μm，用不锈钢铲取70～90mg放入压片模具内，在压片机上用5～10×10⁷Pa压力压成透明薄片，然后在傅里叶变换红外光谱仪(IRPrestige-21/FTIR-8400S，日本岛津公司生产)上测定。

3、树脂的比表面积及孔径测定

将树脂样品在80℃下烘干至恒重，置于干燥器中备用。准确称取0.3g树脂样品用SSA-4200孔径及比表面积分析仪(北京彼奥德电子技术有限公司)进行比表面积和孔径分析。

制备例1

将聚乙烯醇溶解于水中配成质量百分数为1％的聚乙烯醇水溶液。将240g聚乙烯醇水溶液加入500ml三口瓶中，水浴加热至40℃；以32g丙烯酸甲酯为单体、8g二乙烯苯为交联剂，以42g正庚烷作为致孔剂、以0.6g偶氮二异丁腈为引发剂，将上述物质混合均匀后加入三口瓶中，开动搅拌，调节油珠尺寸在0.5～0.7mm之间，经悬浮聚合，以0.5℃/min的升温速度缓慢升温至67℃反应4小时，再继续以0.5℃/min的升温速度缓慢升温至85℃反应4小时，停止反应反应产物。将反应产物冷却，再用60℃的热水洗涤，然后依次用蒸馏水、无水乙醇、丙酮洗涤和抽滤，再用石油醚作为溶剂抽提8小时，得到酯基树脂。

将50g上述酯基树脂加入500ml三口瓶中，以300ml的N,N-二甲基甲酰胺充分溶胀，加入100g二乙烯三胺，搅拌均匀后，升温至130℃反应10小时，反应完成后，经过洗涤处理后得到胺基树脂。

将50g上述胺基树脂加入500ml三口瓶中，再加入200ml醋酸酐，在80℃反应10小时，经过洗涤处理后得到酰胺基树脂。

酰胺基树脂的外观特征和结构参数为：树脂为球形，粒径0.4mm，比表面积为80m²/g干树脂，含水量为60％，平均孔径为25nm。该制备例中，所得酯基树脂和酰胺基树脂的红外光谱图参见图1。其中，1为酯基树脂的红外光谱图，2为酰胺基树脂的红外光谱图。酯基树脂中的酯羰基C＝O的伸缩振动峰在1735.93cm^-1附近，经过酰胺化后的树脂在此处(1734.01cm^-1)的吸收明显减弱，而且出现了吸收更强的峰(1653.00cm^-1)，为酰胺基上羰基C＝O的伸缩振动吸收峰。

实施例1

1.罗布麻粗提物的制备

将罗布麻叶用粉碎机粉碎，过40目筛，称取30g粉碎的罗布麻，用900ml的70vt％乙醇水溶液分三次回流提取，70℃加热回流，每次2小时，三次所得滤液合并得到粗提取液。

将粗提取液用旋转蒸发仪进行旋蒸，在蒸出乙醇的同时补加水，旋蒸至溶液中乙醇含量为5-20vt％。将得到的溶液进行抽滤，即得吸附溶液。

将商品化树脂HPD-100型大孔吸附树脂装柱(长径比为6:1)后加入上柱液，将上柱液以1BV/h的吸附速率通过树脂柱，吸附完毕用1BV水洗，再加入2BV的80vt％的乙醇水溶液，将吸附在树脂上的物质洗脱下来，收集解吸液。65℃真空干燥得到罗布麻粗提物(固体粉末)，经测定其中黄酮含量为14.5wt％，鞣质含量为9.7wt％。水解后的HPLC谱图参见图3(水解条件参见前文)。

2.罗布麻提取物的制备

将上述罗布麻粗提物溶解在15vt％乙醇水溶液中，制得上柱液，上柱液浓度为10mg/ml。

将酰胺基树脂装入吸附柱中，吸附柱的长径比为20:1。

在室温下，将2BV的上柱液加入吸附柱，以1.0BV/h的流速通过吸附柱，其中的黄酮化合物被吸附在吸附柱上，而同时含有部分鞣质的流出液从吸附柱上流出。经检测，流出液中得到几乎不含黄酮的鞣质样品。

以70vt％乙醇溶液洗脱吸附柱，树脂得以再生，同时将洗脱液(解吸液)回收，真空干燥后得到罗布麻提取物。水解后的HPLC谱图参见图4(水解条件参见前文)。总黄酮含量与鞣质含量参见表1。

对比例1～2

分别作为对比应用例1和2，CN1385188A的实施例2和CN1634325A的实施例2的方法获得罗布麻提取物，采用本发明的测试方法测定总黄酮含量。

表1

本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (5)

1.一种罗布麻提取物的纯化方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

(1’)将罗布麻粗提物分散于第一乙醇水溶液中形成吸附液，所述吸附液中的罗布麻粗提物浓度为5～10mg/ml；其中，所述罗布麻粗提物的总黄酮含量低于20wt％，鞣质含量在7wt％以上，所述的总黄酮含量采用液相色谱测定；

(2’)将罗布麻黄酮纯化树脂装入吸附柱；其中，所述的罗布麻黄酮纯化树脂为酰胺化的聚丙烯酸酯树脂，粒径为0.3～1.0mm、比表面积为70～150m²/g干树脂和平均孔径为10～30nm；

(3’)将1～2BV的所述吸附液加入步骤(2’)获得的吸附柱中，以1～2BV/h的吸附速率将所述吸附液通过所述吸附柱，吸附完毕后，用1～2BV的水洗涤所述吸附柱，再用第二乙醇水溶液对所述吸附柱进行洗脱，收集解吸液，干燥后得到罗布麻提取物；其中，所述的BV表示柱体积单位；所述的罗布麻提取物的总黄酮含量在65wt％以上，鞣质含量低于16wt％；所述的总黄酮含量采用液相色谱测定；

其中，所述的第一乙醇水溶液含有12～15vol％的乙醇；所述吸附柱的长径比为10～20:1；所述的第二乙醇水溶液含有65～70vol％的乙醇；

所述的罗布麻黄酮纯化树脂通过如下方法制备得到：以丙烯酸酯为单体，二乙烯苯为交联剂，以偶氮二异丁腈ABIN、偶氮二异庚腈ABVN或过氧化苯甲酰BPO为引发剂，以正庚烷为致孔剂通过悬浮聚合步骤得到酯基树脂，然后经过胺解和酰胺化步骤得到罗布麻黄酮纯化树脂；

其中，所述的致孔剂用量为丙烯酸酯和二乙烯苯总量的101wt％～150wt％。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的罗布麻提取物的总黄酮含量在70～85wt％，鞣质含量为5～15wt％；所述的总黄酮含量采用液相色谱测定。

3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述的罗布麻黄酮纯化树脂的粒径为0.4～0.8mm、比表面积为80～130m²/g干树脂和平均孔径为15～25nm。

4.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述的悬浮聚合步骤为：将丙烯酸酯、二乙烯苯、引发剂和致孔剂混合均匀形成油相，然后将该油相加入到分散介质中，调节搅拌速度以使得分散介质中形成的油珠尺寸控制在0.4～0.8mm之间；保持该搅拌速度，并以0.1～0.6℃/min的第一速度升温至65～80℃，保持3～6小时；继续以0.1～0.6℃/min的第二速度升温至85～90℃，并保持3～6小时以形成酯基树脂。

5.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述罗布麻粗提物通过如下方法制备：

(1’)将粉碎的罗布麻叶用60～78vol％的乙醇水溶液在60～80℃下加热回流，得到粗提取液；

(2’)将所述的粗提取液旋蒸，在蒸出乙醇的同时补加水，旋蒸至粗提取液中乙醇含量为5～20vol％，将所得溶液抽滤，即得吸附溶液；

(3’)将所述吸附溶液在苯乙烯型树脂上进行吸附分离，吸附速率为1～2BV/h，然后用75～85vol％的乙醇水溶液洗脱得到解吸液；

(4’)将所述的解吸液在50～70℃下真空干燥得到罗布麻粗提物。