CN101386614B - 树脂吸附法制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种树脂吸附法制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，此法以茶提取物为原料，用35～40％乙醇水溶液将其溶解后，先上超高交联吸附树脂柱，层析分离除去其它儿茶素组分，收集液再上极性大孔吸附树脂树脂柱脱色，纳滤浓缩后，再经Sephadex LH-20柱层析进一步纯化，冷冻干燥，得EGCG单体，产品的纯度大于90％，得率30％以上。本方法工艺简单，常温浓缩，避免儿茶素的高温氧化，溶剂无毒，产品质量高，满足了食品和医药行业的需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种天然产物的生产方法，特别是涉及一种采用树脂吸附法制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，它属于天然有机化学和农产品的深度加工领域。
背景技术
儿茶素作为茶叶中重要的一类天然活性物质，近年来随着对其组分化学结构、理化性质及生物活性研究的深入，需要提供大量高纯度儿茶素作为制药原料、标准品或生物合成品的前体物质，新的领域对产品总儿茶素含量，特别是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的含量提出了更高的要求，传统提制技术和产品已经不能满足发展的需要。研究各种儿茶素的药理活性和协同作用以及在体内的代谢，开发儿茶素类新药，也均需大量高纯度的多种儿茶素单体，尤其是EGCG单体，现已被列为一种潜在的抗癌药物在中美等国被研究。
近年来，国内外有许多关于提纯制备EGCG的研究，利用了许多新型分离、制备方法，但主要还是以色谱分离为主。原理是利用儿茶素各单体之间的性质差异，选择不同的吸脱附剂，使之得到分离，具体而言，主要有以下几种方法：
1)柱色谱：以绿茶萃取物为原料，直接上填料柱，选用合适的洗脱剂进行等度或梯度洗脱，并定性收集无交叉的流份，从而得到EGCG纯品。
2)柱色谱预分离-制备型HPLC提纯：以绿茶提取物为原料，经柱色谱除去杂质，并将儿茶素中几种单体预分离为几个组分后，再用制备型HPLC分离其中含EGCG的组分，可得到EGCG纯品。
3)有机溶剂富集-柱色谱纯化：以绿茶提取物或茶多酚为原料，经有机溶剂多次萃取，除去杂质，提高儿茶素总纯度后，再用SephadexLH-20柱色谱法分离可得EGCG单体。
4)高效液相色谱法：以儿茶素粗品为原料，选择、优化出合适的柱操作条件，直接用HPLC分离出儿茶素单体。
5)沉淀-吸附法：利用儿茶素能与某些金属形成金属盐沉淀，再用酸将其沉淀溶解，最后用柱色谱法除杂质，可得到EGCG单体。
溶剂萃取法中大量使用有毒有机溶剂(氯仿)，溶剂残留难为食品和医药等行业所接受；沉淀法需调节酸碱度，使部分多酚类物质因氧化而破坏，影响产品质量；HPLC法处理量小，成本高；此外，现代新型分离技术，如制备型高效逆流色谱法和超临界流体萃取技术，虽也已应用于EGCG的提取研究，但尚处于起始阶段。柱色谱法既可克服溶剂萃取法中大量使用有毒有机溶剂的缺点又可避免沉淀法中大量使用重金属沉淀剂的缺点，处理量大，适于EGCG的工业化分离制备，但产品纯度偏低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工艺简单、不使用有毒有机溶剂，产物纯度高、符合食品安全要求的树脂吸附法制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法。其工艺设计原理是利用吸附分离高分子材料对各儿茶素单体及色素吸附选择性的不同，进行柱色谱分离，并结合膜分离技术、凝胶色谱分离技术制备高纯度EGCG单体。
为实现上述目的，本实用新型的技术解决方案是：
本发明是一种树脂吸附法制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，包括如下步骤：1)配液：用30～40％乙醇水溶液溶解茶多酚提取物，得深茶红色茶多酚溶液，茶多酚浓度为1.5～2.5g/L；2)吸附层析：常温常压下，茶多酚溶液经超高交联吸附树脂吸附层析脱其它儿茶素得到表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)收集液；3)吸附脱色：常温常压下，1000～1200毫升的EGCG收集液经60～80毫升的极性大孔吸附树脂脱色，除去色素杂质，溶液由深茶红色变为淡黄色；4)纳滤浓缩：EGCG脱色后，收集液纳滤浓缩；5)EGCG单体制备：将EGCG的纳滤浓缩液经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析纯化，收集EGCG单体流份，冷冻干燥得固体产品。
步骤1)中用1000毫升的30～40％乙醇水溶液溶解茶多酚提取物1.5～2.5克。
步骤2)中用1000毫升的茶多酚溶液经60～80毫升的超高交联吸附树脂吸附层析脱其它儿茶素得到表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)收集液。
步骤2)吸附脱除其它儿茶素组分是采用对其它儿茶素组分吸附选择性较高的超高交联吸附树脂作为柱填料，茶提取物中其它儿茶素被树脂吸附，EGCG随上柱液流出，流速1BV/h；选用的树脂为高比表面积超高交联苯乙烯-二乙烯苯聚合物，平均孔径85～95nm，比表面积1000～1100m2/g，平均粒径0.177～0.42mm。
步骤3)所述的吸附脱色是采用极性大孔吸附树脂进行脱色，除去色素杂质，EGCG流出液由深茶红色变为淡黄色，流速1BV/h；选用的树脂为极性大孔苯乙烯-二乙烯苯聚合物，平均孔径280～300nm，比表面积100～120m2/g，平均粒径0.177～0.42mm。
步骤4)所述的纳滤浓缩是将经步骤3)吸附脱色后的EGCG流出液经纳滤浓缩，使其含固量提高至20％左右。
步骤4)所述的纳滤浓缩所用的纳滤膜为聚偏氟乙烯、聚砜、聚醚砜、醋酸纤维素和复合膜，截留分子量150-200。
步骤4)中的葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱高为70～90cm。
采用上述方案后，本方法与现有柱色谱分离方法比较，具有如下显著的优点：
1、采用两级柱色谱法层析分离：第一级是采用超高交联吸附树脂，此树脂对其它儿茶素单体吸附选择性较强，上柱过程中被吸附截留，EGCG吸附容量较小，随上柱液流出；第二级是采用极性大孔吸附树脂选择性吸附脱色。两级吸附中其它儿茶素单体和色素杂质分别被吸附，EGCG流出，这与一般柱色谱法纯化EGCG的工艺中EGCG同时被吸附的分级洗脱方法不同。大部分柱色谱法纯化EGCG的方法，多采用对EGCG具有较高吸附容量的吸附剂将溶液中的EGCG吸附，其它儿茶素单体也会被吸附，色素流出，然后选用合适的洗脱剂进行等度或梯度洗脱，定性收集EGCG流份，从而得到EGCG纯品。本方法缩短了EGCG的吸附和洗脱工艺，缩短了工艺周期，可大幅度减少洗脱液的用量，降低了生产成本。
2、树脂吸附分离后，再由葡聚糖凝胶SephadexHL-20柱层析得到EGGC单体，产品纯度达90％以上，最高可达95％左右。
本发明方法具有工艺简单、不使用有毒有机溶剂，产物纯度高、符合食品安全要求等特点。
具体实施例
实施例1：
1)配液：选EGCG含量67.8％的茶多酚为原料，称取1.5g，用1000mL35％的乙醇水溶液溶解，得深茶红色溶液。
2)超高交联吸附树脂柱层析：在常温常压下，将所配1000mL茶多酚溶液泵入超高交联树脂吸附柱中，树脂柱体积60mL(即1BV＝60mL)，吸附流速1BV/h，选用的超高交联吸附树脂为苯乙烯-二乙烯苯共聚体，平均孔径85nm，比表面积1000m2/g，平均粒径0.177mm，颜色泄漏即开始收集流出液，吸附完毕，加60mL(1BV)35％乙醇水溶液顶洗，共收集吸附流出液及顶洗液约1000mL，即为EGCG收集液。
3)大孔树脂吸附脱色：在常温常压下，将1000毫升的EGCG收集液泵入大孔树脂吸附柱中，树脂柱体积60mL(即1BV＝60mL)，吸附流速1BV/h，所选用的大孔树脂为极性大孔苯乙烯-二乙烯苯聚合物，平均孔径280nm，比表面积100m2/g，平均粒径0.177mm。上柱过程中大量色素被树脂吸附，EGCG流出，溶液由深茶红色变为淡黄色。吸附完毕，加120mL(3BV)35％乙醇水溶液顶洗树脂柱，共收集流出液及顶洗液约1120mL。
4)纳滤浓缩：在常温常压下，将脱色后的EGCG收集液转移至卷式纳滤设备中进行纳滤浓缩，浓缩约20倍，得浓缩液55mL，浓缩液含固量为19.7％。选用的纳滤膜为聚酰胺(PA)复合膜，截留分子量为200。
5)Sephadex LH-20柱层析：葡聚糖凝胶Sephadex LH-20为柱填料，装柱高70cm，将步骤4)所得浓缩液进样量6ml，无水乙醇作为洗脱剂，洗脱流速0.5BV/h，洗脱剂用量15BV，收集EGCG单体组分。
6)冷冻干燥：将EGCG单体收集液脱乙醇溶剂、冷冻干燥得EGCG单体产品35.6mg，纯度为94.5％，收率为30.32％。
实施例2：
1)配液：选EGCG含量67.8％的茶多酚为原料，称取2g，用1000mL35％的乙醇水溶液溶解，得深茶红色溶液。
2)超高交联吸附树脂柱层析：在常温常压下，将所配1000mL茶多酚溶液泵入超高交联树脂吸附柱中，树脂柱体积60mL(即1BV＝60mL)，吸附流速1BV/h，选用的超高交联吸附树脂为苯乙烯-二乙烯苯共聚体，平均孔径95nm，比表面积1100m2/g，平均粒径0.3mm，颜色泄漏即开始收集流出液，吸附完毕，加120mL(1BV)35％乙醇水溶液顶洗，共收集吸附流出液及顶洗液约1100mL，即为EGCG收集液。
3)大孔树脂吸附脱色：在常温常压下，将1100毫升的EGCG收集液泵入大孔树脂吸附柱中，树脂柱体积80mL(即1BV＝80mL)，吸附流速1BV/h，所选用的大孔树脂为极性大孔苯乙烯-二乙烯苯聚合物，平均孔径300nm，比表面积120m2/g，平均粒径0.3mm。上柱过程中大量色素被树脂吸附，EGCG流出，溶液由深茶红色变为淡黄色。吸附完毕，加180mL(3BV)35％乙醇水溶液顶洗树脂柱，共收集流出液及顶洗液约1180mL。
4)纳滤浓缩：在常温常压下，将脱色后的EGCG收集液转移至卷式纳滤设备中进行纳滤浓缩，浓缩约20倍，得浓缩液60mL，浓缩液含固量为19.7％。选用的纳滤膜为聚酰胺(PA)复合膜，截留分子量为200。
5)Sephadex LH-20柱层析：葡聚糖凝胶Sephadex LH-20为柱填料，装柱高80cm，将步骤4)所得浓缩液进样量6ml，无水乙醇作为洗脱剂，洗脱流速0.5BV/h，洗脱剂用量15BV，收集EGCG单体组分。
6)冷冻干燥：将EGCG单体收集液脱乙醇溶剂、冷冻干燥得EGCG单体产品45.9mg，纯度为92.3％，收率为31.24％。
实施例3：
1)配液：选EGCG含量67.8％的茶多酚为原料，称取2.5g，用1000mL35％的乙醇水溶液溶解，得深茶红色溶液。
2)超高交联吸附树脂柱层析：在常温常压下，将所配1000mL茶多酚溶液泵入超高交联树脂吸附柱中，树脂柱体积60mL(即1BV＝60mL)，吸附流速1BV/h，选用的超高交联吸附树脂为苯乙烯-二乙烯苯共聚体，平均孔径90nm，比表面积1050m2/g，平均粒径0.42mm，颜色泄漏即开始收集流出液，吸附完毕，加200mL(1BV)35％乙醇水溶液顶洗，共收集吸附流出液及顶洗液约1200mL，即为EGCG收集液。
3)大孔树脂吸附脱色：在常温常压下，将1200毫升的EGCG收集液泵入大孔树脂吸附柱中，树脂柱体积65mL(即1BV＝65mL)，吸附流速1BV/h，所选用的大孔树脂为极性大孔苯乙烯-二乙烯苯聚合物，平均孔径2909nm，比表面积110m2/g，平均粒径0.42mm。上柱过程中大量色素被树脂吸附，EGCG流出，溶液由深茶红色变为淡黄色。吸附完毕，加200mL(3BV)35％乙醇水溶液顶洗树脂柱，共收集流出液及顶洗液约1200mL。
4)纳滤浓缩：在常温常压下，将脱色后的EGCG收集液转移至卷式纳滤设备中进行纳滤浓缩，浓缩约20倍，得浓缩液62mL，浓缩液含固量为18.5％。选用的纳滤膜为聚酰胺(PA)复合膜，截留分子量为200。
5)Sephadex LH-20柱层析：葡聚糖凝胶Sephadex LH-20为柱填料，装柱高90cm，将步骤4)所得浓缩液进样量6ml，无水乙醇作为洗脱剂，洗脱流速0.5BV/h，洗脱剂用量15BV，收集EGCG单体组分。
6)冷冻干燥：将EGCG单体收集液脱乙醇溶剂、冷冻干燥得EGCG单体产品55.2mg，纯度为91.7％，收率为30.86％。
Claims (8)
1.一种树脂吸附法制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，包括如下步骤：1)配液：用30～40％乙醇水溶液溶解茶多酚提取物，得深茶红色茶多酚溶液，茶多酚浓度为1.5～2.5g/L；2)吸附层析：常温常压下，茶多酚溶液经超高交联吸附树脂吸附层析脱其它儿茶素得到表没食子儿茶素没食子酸酯收集液；3)吸附脱色：常温常压下，1000～1200毫升的EGCG收集液经60～80毫升的极性大孔吸附树脂脱色，除去色素杂质，溶液由深茶红色变为淡黄色；4)纳滤浓缩：EGCG脱色后，收集液纳滤浓缩；5)EGCG单体制备：将EGCG的纳滤浓缩液经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析纯化，收集EGCG单体流份，冷冻干燥得固体产品。
2.根据权利要求1所述的树脂吸附法制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于：步骤1)中用1000毫升的30～40％乙醇水溶液溶解茶多酚提取物1.5～2.5克。
3.根据权利要求1所述的树脂吸附法制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于：步骤2)中用1000毫升的茶多酚溶液经60～80毫升的超高交联吸附树脂吸附层析脱其它儿茶素得到表没食子儿茶素没食子酸酯收集液。
4.根据权利要求1所述的树脂吸附法制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于：步骤2)吸附脱除其它儿茶素组分是采用对其它儿茶素组分吸附选择性较高的超高交联吸附树脂作为柱填料，茶提取物中其它儿茶素被树脂吸附，EGCG随上柱液流出，流速1BV/h；选用的树脂为高比表面积超高交联苯乙烯-二乙烯苯聚合物，平均孔径85～95nm，比表面积1000～1100m2/g，平均粒径0.177～0.42mm。
5.根据权利要求1所述的树脂吸附法制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于：步骤3)所述的吸附脱色是采用极性大孔吸附树脂进行脱色，除去色素杂质，EGCG流出液由深茶红色变为淡黄色，流速1BV/h；选用的树脂为极性大孔苯乙烯-二乙烯苯聚合物，平均孔径280～300nm，比表面积100～120m2/g，平均粒径0.177～0.42mm。
6.根据权利要求1所述的树脂吸附法制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于：步骤4)所述的纳滤浓缩是将经步骤3)吸附脱色后的EGCG流出液经纳滤浓缩，使其含固量提高至20％左右。
7.根据权利要求1或6所述的树脂吸附法制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于：步骤4)所述的纳滤浓缩所用的纳滤膜为聚偏氟乙烯、聚砜、聚醚砜、醋酸纤维素和复合膜，截留分子量150-200。
8.根据权利要求1或6所述的树脂吸附法制备表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于：步骤4)中的葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱高为70～90cm。
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