CN102964329B - 一种中压高聚物反相色谱分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中压高聚物反相色谱分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，采用一定浓度的经酸化的乙醇水溶液作为流动相溶解茶多酚原料，微滤膜过滤后上单分散高聚物反相色谱柱，流动相洗脱，洗脱后的馏分分段收集，纳滤膜浓缩至一定浓度，浓缩物置真空冷冻干燥机干燥可得高纯度儿茶素单体EGCG产品。本发明工艺简单，操作方便，生产周期短，分离效率高，产品纯度高，分离提纯过程所用的溶剂为乙醇溶液，无毒且可循环利用，低碳环保，有效避免使用有机溶剂带来的安全问题。

Description

一种中压高聚物反相色谱分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法

技术领域

本发明涉及儿茶素的分离提纯方法，尤其涉及一种中压高聚物反相色谱分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法。

背景技术

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶多酚中最有效的活性成分，属于儿茶素，是儿茶素中含量最高的组分，具有强抗氧化性,在医药保健上具有抗肿瘤、抗衰老、降血脂、防止动脉粥样硬化、增强免疫等功能作用；在食品工业上可作抗氧化、抑菌、保鲜、祛臭剂；在日化产品上作特殊功能的保质剂、护肤剂。因此其在医药、食品、日化工业中有广泛用途和应用前景。

目前，儿茶素单体的分离纯化方法主要有吸附树脂层析、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析、高速逆流色谱、硅胶柱层析和高效液相制备色谱等。儿茶素的分离纯化不乏其他方法，也常常采用两种或多种方法结合。

但在实际应用中不得不考虑溶剂毒性、成本和分离效率的问题。吸附树脂和葡聚糖凝胶层析分离性能较差，需结合HPLC等分离方法；葡聚糖凝胶价格昂贵；高速逆流色谱和高效液相制备色谱制备量小，分离效率低，所需能耗高。黄永东等使用B型三带模拟移动床技术，以C18键合硅胶为固定相，乙醇与水(20:80，v/v)为流动相，采用Varicol工艺能得到纯度为91.33％的ECG，回收率为91.41％[黄永东，江和源，江用文，等.传统SMB、Varicol和Partial-discard工艺分离纯化ECG和EGCG的比较研究[J].茶叶科学，2011，31(3)：201-210]，但上述两种方法分别存在C18键合硅胶价格昂贵，有机溶剂用量大，分离平台(逆流色谱仪，移动床)装载量小等缺点。

这些不足制约了其在儿茶素分离中的应用。因此，需要一种分离性能更好、分离效率更高、成本更低的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，该方法分离效率高、分离成本低且分离过程不使用毒性有机溶剂。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：采用一定浓度的经酸化的乙醇水溶液作为流动相溶解茶多酚原料，微滤膜过滤后上单分散高聚物反相色谱柱，该色谱柱适用的pH值变化范围大，化学稳定性好，极易清洗，且再生容易，流动相洗脱后的馏分分段收集，纳滤膜浓缩至一定浓度，浓缩物置真空冷冻干燥机干燥可得高纯度儿茶素单体EGCG产品。具体包括如下步骤：

(1)将乙醇水溶液用有机酸进行酸化，得到酸化的乙醇水溶液；

(2)酸化的乙醇水溶液作为流动相溶解茶多酚原料，得到混合溶液；

(3)将步骤(2)得到的混合溶液经孔径小于1.0μm的微滤膜过滤；

(4)将步骤(3)所得滤液经超声脱气，静置；

(5)利用单分散高聚物反相色谱柱对步骤(4)得到的滤液进行色谱分离；

(6)色谱分离后，EGCG含量低于97％的馏分重新进行步骤(5)，EGCG含量高于97％的馏分经纳滤膜浓缩至质量浓度为6％～20％；

(7)将步骤(6)得到的浓缩物进行冷冻干燥。

作为优选，所述的茶多酚原料中EGCG的含量不低于40％。

茶多酚易溶于温水或含水乙醇中，且茶多酚在弱酸性条件下稳定，因此，本发明选用经酸化的乙醇水溶液作为流动相，乙醇的化学稳定性好，不与茶多酚发生化学反应，且粘度较低，利于色谱分离，作为优选，所述酸化的乙醇水溶液中乙醇的质量浓度为15％～65％。

作为优选，用于酸化乙醇的有机酸为柠檬酸、酒石酸、苹果酸、抗坏血酸中的一种或任意几种任意比例的混合物，这些有机酸不与茶多酚中的成分发生反应，保证了茶多酚的稳定性。

作为优选，所述酸化的乙醇水溶液的pH值为3.0～5.0。

兼顾茶多酚的溶解性及色谱分离的能力，所述步骤(2)中混合溶液中茶多酚原料的质量浓度为15％～40％。

高聚物色谱填料适用的pH值变化范围很宽，在较宽的pH值范围内可保持较好的化学稳定，且表面疏水，适合于生物分子的反相分离，因此，本发明选用单分散高聚物反相色谱对茶多酚中表没食子儿茶素没食子酸酯的分离提纯，该色谱柱极易清洗、再生容易、价格便宜、使用寿命长、极具成本优势、便于工业化连续生产。

色谱分离时，色谱柱的柱长、柱内径对色谱柱的分离能力有较大的影响，通常情况，柱管增长，可改善分离能力，柱管短则组分馏出的快些；柱内径小分离效果好，柱内径大处理量大，但柱内径过大，将导致单体不能均匀地分布在色谱柱中。此外，色谱填料的孔径大小、表面积及性状对填料的分离性能也有很大的影响，粒径均一、呈球形、刚性强、耐压性好的色谱填料有相对较好的柱效，因此对于目标分离物质，选择优化的孔径结构的色谱填料可以增加上样量，提高分离效率和纯度。

因此优选，所述单分散高聚物反相色谱柱柱长为26～68cm，柱直径为1.2～13.6cm，单分散高聚物反相色谱柱填料粒径为5～50μm，柱压为2～10MPa。

进行色谱分离时，即使待分离样品和流动相已做过前处理，也仍难以避免色谱柱受到污染，因此需用洗柱剂对柱子进行清洗；在色谱柱使用一段时间后，柱效将会下降，必须进行再生处理；单分散高聚物反相色谱柱经连续制备20次以上需进行清洗与再生。另外，反相色谱柱在经过出厂测试后在储存或运输过程中可能会干掉，因此在分离提纯待分离样品之前最好使用流动相平衡色谱柱；本发明中，优选所述单分散高聚物反相色谱柱采用的洗柱剂为50％～70％乙醇，用量为5～10BV；再生剂为70％～100％丙酮，用量为10～15BV；平衡剂为20％～50％乙醇，用量为8～15BV。

色谱分离过程中，除了色谱柱自身的规格对分离效果的影响外，进样的速度也会直接影响分离效果，进样速度过快，会造成分离效果差，严重时会使色谱柱超载，因此优选，所述步骤(5)中进行色谱分离时，流动相的流速为5～900mL/min。

所述步骤(6)中的纳滤膜的分子截留量为200～2000Da，主要用于除去色素、水及一些小分子物质，实现EGCG的有效浓缩。纳滤分离过程的优势为：膜组件耐高浓度乙醇，分离过程无化学反应，无需加热，无相变，不会破坏目标产物的生物活性，且操作压力低，能耗低。

本发明采用中压高聚物反相制备色谱分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，该方法提供了一种能连续进样、分离性能好、分离效率高的分离技术，与现有技术相比，具有以下优势：

(1)整个生产过程所用的溶剂为较低浓度的乙醇溶液，无毒且可循环利用，低碳环保，有效避免使用有机溶剂带来的安全问题。

(2)所用的高聚物填料粒径高度均一，表面无极性，不含键合的烷基官能团和残留的硅羟基，不易产生不可逆的非特性吸附作用，能有效地保持样品的生物活性，且分离快速(一次分离时间为三小时左右)，得率高达85％，可代替硅胶基质用于反相分离儿茶素单体。

(3)单分散高聚物反相色谱柱适用的pH值变化范围大(pH＝1～14)，在强(酸/碱)离子溶剂中化学稳定性好，极易清洗，再生容易，适用于FDA规定下CIP/SIP要求的清洗方案，使用寿命长，价格便宜，极具成本优势，便于工业化连续生产。

(4)对收集的目标产物采取经纳滤膜浓缩至一定浓度，直接置于真空冷冻干燥机进行干燥的方法，有效避免常规减压浓缩温度的影响，适于热敏性物质的分离。

(5)工艺简单，操作方便，生产周期短，生产效率高，产品纯度高。

附图说明

图1为本发明中压高聚物反相色谱分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的工艺路线图；

图2为本发明实施例1得到的制备液相色谱图；

图3为本发明实施例2得到的制备液相色谱图；

图4为本发明实施例3得到的制备液相色谱图；

图5为本发明工艺条件下制备的EGCG的HPLC法分析图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明技术方案做进一步详细说明，以下实施例不构成对本发明的限定。本发明中压高聚物反相色谱分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的工艺路线如图1所示。

实施例1

用质量分数为65％的乙醇水溶液(pH＝3.0，柠檬酸酸化)作为流动相并配制质量浓度为25％的茶多酚溶液。将溶液过0.45μm的微滤膜，收集滤液。滤液经超声脱气(超声频率50HZ)30min，静置10min。溶液上单分散高聚物反相色谱柱，上样量3mL，柱长26cm，柱直径1.2cm，填料粒径为10μm，柱压为10Mpa，用流动相进行洗脱，流动相流速为5mL/min，洗脱后的馏分分段收集，EGCG＜97％的馏分重新上柱分离，将EGCG≥97％的馏分通过纳滤膜浓缩至10％～12％浓度，浓缩物置真空冷冻干燥机(﹤0.1mbar,－50℃)干燥96h，得白色粉末状EGCG产品，产品得率为86.7％，制备液相色谱图如图2所示，经HPLC法检测，得到的EGCG纯度为98.69％。

实施例2

用质量分数为15％的乙醇水溶液(pH＝4.0，柠檬酸酸化)作为流动相并配制质量浓度为25％的茶多酚溶液。将溶液过0.45μm的微滤膜，收集滤液。滤液经超声脱气(超声频率50HZ)30min，静置10min。溶液上单分散高聚物反相色谱柱，上样量100mL，柱长49cm，柱直径5cm，填料粒径为40μm，柱压为5Mpa，用流动相进行洗脱，流动相流速为100mL/min，洗脱后的馏分分段收集，EGCG＜97％的馏分重新上柱分离，将EGCG≥97％的馏分通过纳滤膜浓缩至10％～12％浓度，浓缩物置真空冷冻干燥机(﹤0.1mbar,－50℃)干燥96h，得白色粉末状EGCG产品，产品得率为90.1％，制备液相色谱图如图3所示，经HPLC法检测，得到的EGCG纯度为98.1％。

实施例3

用质量分数为40％的乙醇水溶液(pH＝5.0，柠檬酸酸化)作为流动相并配制质量浓度为25％的茶多酚溶液。将溶液过0.45μm的微滤膜，收集滤液。滤液经超声脱气(超声频率50HZ)30min，静置10min。溶液上单分散高聚物反相色谱柱，上样量100mL，柱长48cm，柱直径6.8cm，填料粒径为40μm，柱压为2Mpa，用流动相进行洗脱，流动相流速为900mL/min，洗脱后的馏分分段收集，EGCG＜97％的馏分重新上柱分离，将EGCG≥97％的馏分通过纳滤膜浓缩至10％～12％浓度，浓缩物置真空冷冻干燥机(﹤0.1mbar,－50℃)干燥96h，得白色粉末状EGCG产品，产品得率为90.1％，制备液相色谱图如图4所示，经HPLC法检测，得到的EGCG纯度为97.6％。

实施例4

将实施例1、2、3得到的白色粉末状EGCG产品充分混匀，准确称取50mg样品于50mL容量瓶中，用体积比为1∶1的CH3OH-H2O混合溶液溶解并定容至刻度，过0.22μm膜，滤液经超声脱气(超声频率50HZ)30min，静置10min，待测。色谱条件为：(1)色谱柱：Hypersil BDS C18(416mm×250mm,10μm)。流动相A为甲醇，流动相B为体积分数为0.1％的乙酸水溶液，梯度程序为20％A相保持10min，40min内由20％A相→40％A相，40％A相保持40min。检测波长：278nm；流速：1mL/min；柱温：35℃。经HPLC法检测，EGCG纯度为98.9％，HPLC色谱图如图5所示。

Claims (7)

1.一种中压高聚物反相色谱分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将乙醇水溶液用有机酸进行酸化，得到酸化的乙醇水溶液；所述酸化的乙醇水溶液的pH值为3.0～5.0；

(2)酸化的乙醇水溶液作为流动相溶解茶多酚原料，得到混合溶液；

(3)将步骤(2)得到的混合溶液经孔径小于1.0μm的微滤膜过滤；

(4)将步骤(3)所得滤液经超声脱气，静置；

(5)利用单分散高聚物反相色谱柱对步骤(4)得到的滤液进行色谱分离；所述单分散高聚物反相色谱柱柱长为26～68cm，柱直径为1.2～13.6cm，单分散高聚物反相色谱柱填料粒径为5～50μm，柱压为2～10MPa；

(6)色谱分离后，EGCG含量低于97％的馏分重新进行步骤(5)，EGCG含量高于97％的馏分经纳滤膜浓缩至质量浓度为6％～20％；

(7)将步骤(6)得到的浓缩物进行冷冻干燥。

2.根据权利要求1所述的中压高聚物反相色谱分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，所述的茶多酚原料中的EGCG的含量不低于40％。

3.根据权利要求1所述的中压高聚物反相色谱分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，所述酸化的乙醇水溶液中乙醇的质量浓度为15％～65％。

4.根据权利要求1所述的中压高聚物反相色谱分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，用于酸化乙醇的有机酸为柠檬酸、酒石酸、苹果酸、抗坏血酸中的一种或几种任意比例的混合物。

5.根据权利要求1所述的中压高聚物反相色谱分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，所述步骤(2)中混合溶液中茶多酚原料的质量浓度为15％～40％。

6.根据权利要求1所述的中压高聚物反相色谱分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，所述单分散高聚物反相色谱柱采用的洗柱剂为50％～70％乙醇，用量为5～10BV；再生剂为70％～100％丙酮，用量为10～15BV；平衡剂为20％～50％乙醇，用量为8～15BV。

7.根据权利要求1所述的中压高聚物反相色谱分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯的方法，其特征在于，所述步骤(5)中进行色谱分离时，流动相的流速为5～900mL/min。