CN1724530A

CN1724530A - 一种连续中压柱层析制备高纯度egcg的方法

Info

Publication number: CN1724530A
Application number: CN 200510010176
Authority: CN
Inventors: 祖元刚; 杨磊; 高彦华; 祖柏实; 李庆勇; 付玉杰; 张玉红
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2005-07-13
Filing date: 2005-07-13
Publication date: 2006-01-25

Abstract

一种连续中压柱层析制备高纯度EGCG的方法，使用含量不低于50％EGCG的茶多酚为原料，制备纯度高于98％的EGCG产品。使用中压硅胶填充柱，将层析硅胶用烃溶剂分散后装柱，酯溶剂溶样，烃溶剂与酯溶剂和甲酸的混合液为洗脱剂，柱塞式溶剂泵进液，洗脱后的流分分段收集，减压浓缩回收洗脱剂，浓缩物加去离子水溶解后喷雾干燥得纯度高于98％EGCG产品，低纯度组分作为层析原料再次纯化。回收的洗脱剂经薄层层析、pH校正后重复使用。使用后的层析柱用酯溶剂再生，烃溶剂为平衡剂平衡，平衡后的层析柱可重复使用，使用次数达30次以上。本方法的主要特点为纯化过程无污染，所有溶剂均可回收使用，便于工业连续化生产。

Description

一种连续中压柱层析制备高纯度EGCG的方法

所属技术领域：

本发明涉及天然产物化学领域，特别是涉及一种连续中压柱层析制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG的方法。

背景技术：

表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG是从茶叶中提取的一种生物活性成分。流行病学和动物学实验研究表明：具有抗氧化活性的EGCG可以防治多种癌症如肺癌、前列腺癌、乳腺癌等等。层粘蛋白(laminin，LN)是细胞外基质中重要的一种糖蛋白，具有很强的介导细胞粘附和受体结合的特性。最新研究表明，EGCG能够与层粘蛋白受体(67-kDa laminin receptor，67LR)作用，抑制67LR与层粘蛋白的结合，而肿瘤细胞通过67LR与LN的粘附作用，分泌多种蛋白水解酶，使贴近肿瘤表面的有限区域的基质降解，从而促使肿瘤的浸润与转移，形成肿瘤细胞转移通路。同时，EGCG能够直接抑制基质金属蛋白酶MMP的水解活性，抑制肿瘤血管生成。因此，EGCG的开发和应用已受到广泛关注。

由于茶叶中各种多酚组分的化学结构与性质十分相近，极性强，一般方法很难达到对其单体的分离。目前，根据已公开的专利，EGCG的纯化工艺有如下几种：

公开号为CN1367171A的专利介绍了一种高含量EGCG儿茶素的提取方法，该法以普通的黄色茶多酚为原料，在室温、压力范围为0.1～1.0MPa的条件下，经过一系列的无害惰性有机溶剂多步逆流萃取后，调整溶液的pH值在2.5～7.5之间，进行二价或三价金属盐沉淀反应，沉淀经过滤、热水洗涤和酸溶后，用乙酸乙酯萃取，萃取的有机溶剂相再进行水洗脱酸、减压浓缩、重结晶，养晶后的结晶物经过滤、冷冻双重水洗涤，最后进行冷冻干燥而成。该工艺得到EGCG有效含量为90％产品。但该工艺过程较复杂，即有大量有机溶剂的萃取，又有金属盐沉淀反应，并且还涉及重结晶等过程。所需溶剂量大，处理量较小，难以工业化生产。

公开号为CN1277068A的专利介绍了一种高纯度单体儿茶素的高速逆流色谱分离制备方法，它包括配制构成固定相、流动相的溶剂体系；使逆流色谱仪柱子中充满固定相；然后使其主机转动，再将流动相泵入柱内；由进样阀进样；根据检测器谱图接收目标成分，所用溶剂体系可以是脂肪酯，脂肪醇或脂肪酮，水；或者是烷烃，脂肪酯，水所构成的两相溶剂体系，以上相为固定相，下相为流动相。目前的逆流色谱技术难以得到含量大于98％的产品，且一次分离样品量小，分离时间长，目前仅处于研究阶段。

公开号为CN1319597A的专利介绍了一种茶多酚中儿茶素类化合物的分离方法，使茶多酚通过1.5米高度的葡聚糖Sephadex LH-20填充柱，用丙酮含量在10～30％之间的丙酮——乙醇二元混合溶剂洗脱，流速每小时5～30毫升，分离出表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，表儿茶素没食子酸酯(ECG)儿茶素单体，纯度为90％，少量可达95％。但该工艺使用1.5米高度的葡聚糖Sephadex LH-20填充柱，价格昂贵，且茶多酚处理量较少，每次1.5g左右，并且产品的得率较低。

公开号为CN1470510A的专利本发明公开了一种表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG单体制备方法。它包括绿茶提取物加水使之溶解，加入氯化钠，盐析，过滤除杂，滤液用等体积乙酸乙酯萃取，活性炭脱色，减压回收乙酸乙酯至干，加入90％乙醇水溶液溶解后，上Sephadex LH-20柱层析(绿茶提取物重与吸附剂重量比为1∶15)，用90％乙醇水溶液作为洗脱剂洗脱，根据紫外检测结果，收集表没食子儿茶素没食子酸酯流份，减压回收乙醇至干，再加适量水溶解，于10℃以下结晶，EGCG纯度可达98％以上。但该工艺复杂，包括盐析、溶剂萃取、活性炭脱色、葡聚糖Sephadex LH-20柱层析、重结晶等过程。成本高，不易于工业化生产。

公开号为CN1465572A的专利将1g茶叶提取物，加入3～4ml的溶解溶剂，过滤，得红棕色溶液，在4～6℃低温下慢慢加入18～32ml的结晶溶剂，待儿茶素析出完全，搅拌使结块沉淀分散，放置，充氮真空抽滤，取滤渣加入与上述等体积的溶解溶剂溶解，等体积的结晶溶剂沉淀，充氮真空抽滤，取滤渣。如此重复不少于7次，滤渣用蒸馏水溶解制成浓度为15％的溶液，过葡聚糖凝胶LH-20柱，用洗脱溶剂洗脱，收集EGCG流分，绿色条带出尽后收集，40℃减压真空回收洗脱溶剂，冰冻干燥，即可。可获纯度大于98％的产品。但该工艺较复杂，涉及多步结晶，甚至重复达9次之多，并且结合葡聚糖凝胶LH-20柱层析，价格昂贵，不利于实现。

综上所述，上述诸多提纯方法虽然可以达到较高的纯度，但存在的诸多问题限制了它在工业化生产中的应用。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种连续中压柱层析制备高纯度EGCG的方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案包括：使用含量不低于50％EGCG的茶多酚为原料，制备纯度高于98％的EGCG产品。使用中压硅胶填充柱，将层析硅胶用烃溶剂分散后装柱，酯溶剂溶样，烃溶剂与酯溶剂和甲酸的混合液为洗脱剂，柱塞式溶剂泵进液，洗脱后的流分分段收集，减压浓缩回收洗脱剂，浓缩物加去离子水溶解后喷雾干燥得纯度高于98％EGCG产品，低纯度组分作为层析原料再次纯化。回收的洗脱剂经薄层层析、pH校正后重复使用。使用后的层析柱用酯溶剂再生，烃溶剂为平衡剂平衡，平衡后的层析柱可重复使用。

中压层析硅胶填充柱柱长30～350cm，柱直径5～100cm，填充层析硅胶粒径为200～800目，柱压为0.1～5MPa。

洗脱剂为酯溶剂∶烃溶剂∶甲酸(v/v/v)＝4∶7∶1～9∶7∶1的混合溶液。

所用的烃溶剂为正己烷、正庚烷、环己烷、石油醚，酯溶剂为乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯，甲酸为含水甲酸，含量88％。

EGCG原料溶解于酯溶剂中，质量浓度为20～80％。每次分离所用原料质量与柱中层析硅胶质量之比在1∶15～1∶100之间。

分段收集的流分含量高于97％的进入喷雾干燥过程，含量低于97％的按照上述分离方法重新上样分离。

洗脱剂的薄层层析校正是将回收的洗脱剂做为薄层展开剂，将EGCG对照品点于薄层层析板上展开，根据展开的R_f值，添加烃溶剂或酯溶剂使与原始配比的R_f值相近，甲酸的配比根据pH调节。

再生剂用量为2～10Bv，平衡剂用量为5～20Bv。

本发明的优点是：

1、整个工艺生产周期短，只需8～12h，溶剂用量少。

2、本发明改变了传统的生产工艺，本法的层析柱可重复使用，使用次数达30次以上，降低了成本，大大提高了生产效率。

3、纯化过程无污染，所有溶剂均可回收使用，便于工业连续化生产。

具体实施方式：

下面对本发明实施作进一步详细描述：

使用含量不低于50％EGCG的茶多酚为原料，制备纯度高于98％的EGCG产品。使用中压硅胶填充柱，将层析硅胶用烃溶剂分散后装柱，酯溶剂溶样，烃溶剂与酯溶剂和甲酸的混合液为洗脱剂，柱塞式溶剂泵进液，洗脱后的流分分段收集，减压浓缩回收洗脱剂，浓缩物加去离子水溶解后喷雾干燥得纯度高于98％EGCG产品，低纯度组分作为层析原料再次纯化。回收的洗脱剂经薄层层析、pH校正后重复使用。使用后的层析柱用酯溶剂再生，烃溶剂为平衡剂平衡，平衡后的层析柱可重复使用。中压层析硅胶填充柱柱长30～350cm，柱直径5～100cm，填充层析硅胶粒径为200～800目，柱压为0.1～5MPa。

洗脱剂的薄层层析校正是将回收的洗脱剂作为薄层展开剂，将EGCG对照品点于薄层层析板上展开，根据展开的R_f值，添加烃溶剂或酯溶剂使与原始配比的R_f值相近，甲酸的配比根据pH调节。

再生剂用量为2～10Bv，平衡剂用量为5～20Bv。

下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。

实施例1：

将活度为II级的300～500目层析硅胶3kg用石油醚匀浆湿法装于内径为8cm的玻璃层析柱中，洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸(v/v/v)＝5.8∶7∶1，100g 65％含量的EGCG粗品加入上述洗脱剂溶解，滤除不溶物后用柱塞式溶剂泵上于柱头，然后泵入洗脱剂洗脱，分段收集流分，TLC和HPLC检测，合并含量97％以上的流出液，减压回收洗脱剂后得浓缩物，加入100ml去离子水溶解，喷雾干燥得EGCG 45g，纯度98.2％，含量低于97％的减压回收洗脱剂后作为下次柱层析的原料。回收的洗脱剂经薄层层析和pH校正后下次重复使用，洗脱后的层析硅胶柱泵入10L乙酸乙酯再生，然后再泵入15L石油醚平衡，平衡后的层析硅胶柱待下次直接使用。EGCG总回收率95.3％。

实施例2：

100g 65％含量的EGCG粗品加入乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸(v/v/v)＝5.8∶7∶1洗脱剂溶解后泵入实施例1已平衡好的层析硅胶柱，依实施例1方法操作，得精品EGCG 47.1g，纯度98.5％。EGCG总回收率96.1％。

实施例3：

实施例1方法得到的75％含量EGCG 85g加入乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸(v/v/v)＝5.8∶7∶1洗脱剂溶解后泵入实施例1已平衡好的层析硅胶柱，依实施例1方法操作，得精品EGCG 44.6g，纯度98.1％。EGCG总回收率96.5％。

实施例4：

将活度为II级的300～500目层析硅胶3kg用石油醚匀浆湿法装于内径为8cm的玻璃层析柱中，洗脱剂为乙酸甲酯∶正己烷∶甲酸(v/v/v)＝4.5∶7∶1，100g 65％含量的EGCG粗品加入上述洗脱剂溶解，滤除不溶物后用柱塞式溶剂泵上于柱头，然后泵入洗脱剂洗脱，分段收集流分，TLC和HPLC检测，合并含量97％以上的流出液，减压回收洗脱剂后得浓缩物，加入100ml去离子水溶解，喷雾干燥得EGCG 48g，纯度98.6％，含量低于97％的减压回收洗脱剂后作为下次柱层析的原料。回收的洗脱剂经薄层层析和pH校正后下次重复使用，洗脱后的层析硅胶柱泵入10L乙酸甲酯再生，然后再泵入15L正己烷平衡，平衡后的层析硅胶柱待下次直接使用。EGCG总回收率95.2％。

Claims

1、一种连续中压柱层析制备高纯度EGCG的方法，使用含量不低于50％EGCG的茶多酚为原料，制备纯度高于98％的EGCG产品，使用中压硅胶填充柱，将层析硅胶用烃溶剂分散后装柱，酯溶剂溶样，烃溶剂与酯溶剂和甲酸的混合液为洗脱剂，柱塞式溶剂泵进液，洗脱后的流分分段收集，减压浓缩回收洗脱剂，浓缩物加去离子水溶解后喷雾干燥得纯度高于98％EGCG产品，低纯度组分作为层析原料再次纯化，回收的洗脱剂经薄层层析、pH校正后重复使用，使用后的层析柱用酯溶剂再生，烃溶剂为平衡剂平衡，平衡后的层析柱可重复使用。

2、按照权利要求1所述的连续中压柱层析制备高纯度EGCG的方法，其特征在于：中压层析硅胶填充柱柱长30～350cm，柱直径5～100cm，填充层析硅胶粒径为200～800目，柱压为0.1～5MPa。

3、按照权利要求1所述的连续中压柱层析制备高纯度EGCG的方法，其特征在于：洗脱剂为酯溶剂∶烃溶剂∶甲酸(v/v/v)＝4∶7∶1～9∶7∶1的混合溶液。

4、按照权利要求1和3所述的连续中压柱层析制备高纯度EGCG的方法，其特征在于：所用的烃溶剂为正己烷、正庚烷、环己烷、石油醚，酯溶剂为乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯，甲酸为含水甲酸，含量88％。

5、按照权利要求1所述的连续中压柱层析制备高纯度EGCG的方法，其特征在于：EGCG原料溶解于酯溶剂中，质量浓度为20～80％。

6、按照权利要求1所述的连续中压柱层析制备高纯度EGCG的方法，其特征在于：每次分离所用原料质量与柱中层析硅胶质量之比在1∶15～1∶100之间。

7、按照权利要求1所述的连续中压柱层析制备高纯度EGCG的方法，其特征在于：分段收集的流分含量高于97％的进入喷雾干燥过程，含量低于97％的按照上述分离方法重新上样分离。

8、按照权利要求1所述的连续中压柱层析制备高纯度EGCG的方法，其特征在于：洗脱剂的薄层层析校正是将回收的洗脱剂作为薄层展开剂，将EGCG对照品点于薄层层析板上展开，根据展开的R_f值，添加烃溶剂或酯溶剂使与原始配比的R_f值相近，甲酸的配比根据pH调节。

9、按照权利要求1所述的连续中压柱层析制备高纯度EGCG的方法，其特征在于：再生剂用量为2～10Bv，平衡剂用量为5～20Bv。