CN112010911A - 一种人参总皂苷的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人参总皂苷的纯化方法，包括将人参筛去杂质、洗净、软化、切片、干燥后，加20%~80%的乙醇浸泡5~15h，煎煮0.5~12h，滤取药液；药渣再依上述方法煎煮2~3次，滤取药液，并与上述药液合并浓缩，得人参粗提物溶液；将其浓缩、干燥，得人参粗提物干粉；将人参粗提物溶液进行膜过滤，取膜透过液，采用高效制备液相色谱将膜透过液纯化，得精制液，将其浓缩、干燥，得精制人参总皂苷粉末；将精制人参总皂苷粉末用纯化水溶解，采用离子交换色谱对其进行脱色除杂，收集除杂后液体，将其浓缩、干燥，得人参总皂苷纯品粉末。本发明可解决人参总皂苷提取收率低、纯化产品中含量低、有机溶剂残留大及生产成本高等问题。

Description

一种人参总皂苷的纯化方法

技术领域

本发明属于中药提取技术领域，具体涉及一种人参总皂苷的纯化方法。

背景技术

人参皂苷(Panax Notoginseng Saponins,PNS)是一种固醇类化合物，属于三萜皂苷。主要存在于人参药材中。PNS主要是由皂苷元与糖链接所构成，其性状多为白色粉末或针状晶体，吸湿性较强，被视为人参中的主要化学成分，也是人参发挥主要功效的有效成分。研究表明人参皂苷Rg1可快速缓解疲劳、改善学习记忆、延缓衰老，具有兴奋中枢神经作用、抑制血小板凝集作用；人参皂苷Re能抑制中枢神经，促进DNA，RNA合成，升高血浆皮质酮的作用，扩张血管，能减少乙酰胆碱引起的豚鼠离体子宫的收缩，对大鼠有减慢心率和双相性血压(先升后降)作用；人参皂苷Rb1的含量可影响动物睾丸的潜力，亦会影响小鼠的胚胎发育，具有增强胆碱系统的功能，增加乙酰胆碱的合成和释放以及改善记忆力作用。

人参总皂苷分离纯化工艺种类繁多，包括有溶剂萃取法、沉淀法、结晶法、大孔树脂吸附法等。溶剂萃取法由于多用二氯甲烷、氯仿、苯等脱脂，此法有机溶剂用量较大，提取时间长、效率低下，且存在有机溶剂易残留的缺点，产品质量低。沉淀法常用的沉淀剂是铅盐，它能与许多物质生成难溶的铅盐或络合物，选择性差；同时铅盐有剧毒，严重影响产品质量，并且容易造成资源浪费，产品纯度不高，液料比大，酸消耗量大，需要脱盐纯化等，不利于商业化发展。结晶法是利用两种或多种可溶性固体在同一种溶剂里溶解度的不同加以分离的方法，该法生成速率慢，生长条件难以控制。大孔树脂吸附分离工艺操作简便，成本较低，树脂可反复使用，适合工业生产，但大孔树脂吸附法对提取液纯度有一定要求，预处理难度大，有机残留物高，强度差，使用过程中破碎严重，使用寿命短，粒径分布广，分离效果不佳，且只适用于产品的粗分离，实验重现性较差。

发明内容

有鉴于此，本发明实施例期望提供一种人参总皂苷的纯化方法，可解决目前人参总皂苷提取制备工艺收率低、纯化产品中含量低、有机溶剂残留大和生产成本高等问题。

为达到上述目的，本发明采用一种人参总皂苷的纯化方法，包括以下步骤：

a)将人参筛去杂质、洗净、软化、切片、干燥后，加20％～80％的乙醇进行浸泡5h～15h，然后煎煮0.5h～12h，滤取药液；药渣再依上述方法煎煮2～3次，滤取药液，并与上述药液合并进行浓缩，即得人参粗提物溶液；将所述人参粗提物溶液浓缩、干燥，即得人参粗提物干粉；

b)将所述人参粗提物溶液进行膜过滤，收集膜透过液，采用高效液相色谱仪将膜透过液进行纯化，得精制液，将其浓缩、干燥，即得精制人参总皂苷粉末；

c)将所述精制人参总皂苷粉末用纯化水溶解，采用离子交换色谱仪对其进行脱色除杂，收集脱色除杂后的液体，将其浓缩、干燥，即得人参总皂苷纯品粉末。

优选地，所述步骤b)中的膜可以是中空纤维膜、卷式膜、管式膜或板框式膜，所述膜孔径为0.22μm～0.65μm或500KD～1000KD。

优选地，所述步骤b)中采用高效液相色谱仪将膜透过液进行纯化包括：采用平衡缓冲液冲洗所述高效液相色谱仪中的色谱柱，将所述膜透过液通过所述色谱柱纯化，通过有机溶剂淋洗杂质、洗脱目标物，其中色谱上样和洗脱流速为140cm/h～350cm/h。

优选地，所述色谱柱采用C18反相色谱柱，所述有机溶剂为甲醇、乙醇或乙腈，所述洗脱目标物的有机溶剂浓度为30％～90％。

优选地，所述步骤c)中采用离子交换色谱仪进行脱色除杂包括：上样完毕后，采用纯水淋洗所述离子交换色谱仪中的色谱柱，采用1M NaOH和0.1M HCl洗脱结合到色谱柱上的杂质，其中色谱上样和洗脱流速为150cm/h～500cm/h。

优选地，所述色谱柱为离子交换色谱柱。

优选地，所述步骤a)、b)、c)中的浓缩方式可以为常压蒸发、减压蒸发、薄膜蒸发、多效蒸发；所述步骤a)、b)、c)中的干燥方式可以为减压干燥、冷冻干燥、红外线干燥、喷雾干燥。

本发明有益效果如下：1)本发明采用膜过滤技术，常温下即可实现分离、浓缩，整个过程无相变、化学变化发生，能耗低，选择性好，适应性强，操作简单经济实用，效率和稳定性比较高，适合工业化生产；2)本发明采用高效液相色谱技术，可以有效分离皂苷与其结构类似物等物质，实现人参总皂苷的高效纯化制备；3)本发明采用离子交换色谱技术，可以有效去除色素、农药残留、重金属、内毒素等有毒有害物质，实现人参总皂苷的高效纯化制备，且适于工业化生产，可解决中药提取物外观差、口感差、颜色深及保存易沉淀等缺点；4)本发明操作简单，有机溶剂均可回收重复利用，环保高效，可用于大规模生产，具有良好的工业化前景，人参总皂苷纯化过程安全可控，耗能低、时间短，稳定性高，显著提高人参总皂苷的质量和收率。

附图说明

图1为本发明人参总皂苷的纯化方法流程示意图；

图2为本发明实施例一制备的人参粗提液的HPLC分析色谱图；

图3为本发明实施例一制备的人参总皂苷精制液的HPLC分析色谱图；

图4为本发明实施例一制备的人参总皂苷纯品粉末的HPLC分析色谱图。

具体实施方式

为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面对本发明的实现进行详细阐述。

本发明人参总皂苷的纯化方法流程如图1所示，具体包括如下：

步骤101：将人参筛去杂质、洗净、软化、切片、干燥后，加20％～80％的乙醇进行浸泡5h～15h，然后煎煮0.5～12h，滤取药液；药渣再依上述方法煎煮2～3次，滤取药液，并与上述药液合并进行浓缩，即得人参粗提物溶液；将所述人参粗提物溶液浓缩、干燥，即得人参粗提物干粉；

这里，药渣再依上述方法煎煮2～3次，即药渣加入20％～80％的乙醇进行浸泡5h～15h，然后煎煮0.5h～12h，滤取药液，如此重复2～3次；

这里，所述浓缩方式可以为常压蒸发、减压蒸发、薄膜蒸发、多效蒸发；所述干燥方式可以为减压干燥、冷冻干燥、红外线干燥、喷雾干燥；

步骤102：将所述人参粗提物溶液进行膜过滤，收集膜透过液，采用高效液相色谱仪将膜透过液进行纯化，得精制液，将其浓缩、干燥，即得精制人参总皂苷粉末；

这里，所述膜可以是中空纤维膜、卷式膜、管式膜或板框式膜，所述膜孔径为0.22μm～0.65μm或500KD～1000KD；

这里，采用高效液相色谱仪将膜透过液进行纯化包括：采用平衡缓冲液冲洗所述高效液相色谱仪中的色谱柱，将所述膜透过液通过所述色谱柱纯化，通过有机溶剂淋洗杂质、洗脱目标物，其中色谱上样和洗脱流速为140cm/h～350cm/h；

这里，所述色谱柱采用C18反相色谱柱，所述有机溶剂为甲醇、乙醇或乙腈，所述洗脱目标物的有机溶剂浓度为30％～90％；

这里，所述浓缩方式可以为常压蒸发、减压蒸发、薄膜蒸发、多效蒸发；所述干燥方式可以为减压干燥、冷冻干燥、红外线干燥、喷雾干燥；

这里，反相色谱柱的填料基质为硅胶或高分子聚合物，填料配基的碳原子数为1～30的正链烷基中的一种或多种，色谱柱内径为20mm～1600mm，色谱柱床高度为100mm～1000mm，色谱平衡缓冲液中含有机溶剂，有机溶剂包括甲醇、乙醇或乙腈，有机溶剂的含量为5％～60％，色谱柱的载样量为固定相重量的0.01％～50％，色谱的上样和洗脱流速为140cm/h～350cm/h，色谱纯化洗脱总皂苷目标组分的有机溶剂浓度为30％～90％，洗脱方式可以是等度或线性梯度；

步骤103：将所述精制人参总皂苷粉末用纯化水溶解，采用离子交换色谱仪对其进行脱色除杂，收集脱色除杂后的液体，将其浓缩、干燥，即得人参总皂苷纯品粉末；

这里，采用离子交换色谱仪进行脱色除杂包括：上样完毕后，采用纯水淋洗所述离子交换色谱仪中的色谱柱，采用1M NaOH和0.1MHCl洗脱结合到色谱柱上的杂质，其中色谱上样和洗脱流速为150cm/h～500cm/h；

这里，所述色谱柱为离子交换色谱柱；

这里，离子交换色谱技术的分离材料基质为琼脂糖、硅胶或高分子聚合物，粒径为40μm～100μm，配基的结构式可为

上样体积为柱体积的10～50倍，色谱操作的上样和洗脱流速可以为150cm/h～500cm/h，色谱纯化目标组分的方式可以为流穿或洗脱模式；

这里，所述浓缩方式可以为常压蒸发、减压蒸发、薄膜蒸发、多效蒸发；所述干燥方式可以为减压干燥、冷冻干燥、红外线干燥、喷雾干燥；

至此，本发明人参总皂苷的纯化方法流程结束。

下面通过列举具体实施例来阐述人参总皂苷的纯化制备过程。

实施例一

步骤1：称取预处理好的人参药材1000g，加65％乙醇10L放入煎药机中在85℃下煎煮2h，纱布过滤，药渣加65％乙醇6L，再次放入煎药机中在85℃下煎煮2h，纱布过滤，合并滤液，旋蒸浓缩后所得提取浓缩液即人参粗提液，将粗提液的样品进行HPLC分析，色谱分析结果如图2所示，将粗提取溶液减压干燥后收集粉末，即得人参提取物干燥粉；

步骤2：将C18反相色谱柱(填料重量300g，粒径15μm)连接到高压液相系统上，设计流速60mL/min(190cm/h)，采用5％乙醇平衡缓冲液冲洗色谱柱3BV，将人参提取浓缩液(使用0.45m滤膜去除颗粒性不溶物)通过系统泵流经色谱柱纯化，通过10％乙醇淋洗杂质，60％乙醇洗脱目标物，收集各馏分即为精制液并进行HPLC分析，将精制液旋蒸去乙醇、置-40℃冰箱冷冻5h后放入冻干机中，真空干燥直至水分全部去除，收集冻干粉末，即为精制人参总皂苷粉末，人参精制液的HPLC分析结果见图3所示；

步骤3：取20g精制人参总皂苷粉末用纯化水溶解，配置浓度100mg/mL，将WorkBeads 40TREN离子交换色谱柱(柱体积20mL)连接到层析系统上，设计流速12mL/min(360cm/h)，将样品通过系统泵过平衡好的色谱柱，上样完毕后，纯水淋洗色谱柱，采用1MNaOH和0.1M HCl洗脱结合到色谱柱上的杂质，收集柱穿出液和淋洗液进行HPLC分析，即为高纯度人参总皂苷组分，将该馏分冷冻后放入冻干机中，抽真空干燥直至水分全部去除，收集冻干粉末，即为人参总皂苷纯品粉末，称重分析计算总皂苷含量，高纯度人参总皂苷组分粉末的HPLC分析结果见图4所示，皂苷含量约为42.54％，收率约为95.65％。

实施例二

步骤1：称取预处理好的人参药材1000g，加55％乙醇10L放入煎药机中在80℃下煎煮2h，纱布过滤，药渣加55％乙醇6L再次放入煎药机中在80℃下煎煮2h，纱布过滤，合并滤液，薄膜蒸发浓缩后得提取浓缩液；

步骤2：将C18反相色谱柱(填料重量300g，粒径30μm)连接到高压液相系统上，设计流速60mL/min(190cm/h)，采用5％乙醇平衡缓冲液冲洗色谱柱3BV，将人参提取浓缩液(使用0.65m滤膜去除颗粒性不溶物)通过系统泵流经色谱柱纯化，通过10％乙醇淋洗杂质，70％乙醇洗脱目标物，收集各馏分即为精制液并进行HPLC分析，将精制液旋蒸去乙醇、真空干燥直至水分全部去除，收集粉末，即为精制人参总皂苷粉末；

步骤3：取20g精制干燥粉用纯化水溶解，配置浓度80mg/mL。将Q Sepharose 6FF离子交换色谱柱(柱体积20mL)连接到层析系统上，设计流速12mL/min(360cm/h)，将样品通过系统泵过平衡好的色谱柱，上样完毕后，纯水淋洗色谱柱，采用1M NaOH和0.1M HCl洗脱结合到色谱柱上的杂质，收集柱穿出液和淋洗液进行HPLC分析，即为高纯度人参总皂苷组分，将该馏分放入喷雾干燥机干燥，收集粉末，即为人参总皂苷纯品粉末，称重分析计算总皂苷含量约为39.75％，收率约为90.88％。

实施例三

步骤1：称取预处理好的人参药材100g，加65％乙醇1.5L电热套加热回流(90℃)1.5h，纱布过滤，药渣再加入65％乙醇1L再次电热套加热回流(90℃)1.5h，纱布过滤，合并滤液，旋蒸浓缩后经喷雾干燥得提取物干燥粉；

步骤2：将C18反相色谱柱(填料重量300g，粒径60μm)连接到高压液相系统上，设计流速60mL/min(190cm/h)，采用10％乙醇平衡缓冲液冲洗色谱柱3BV，将平衡缓冲液溶解的20g人参提取物干燥粉(使用孔径为750KD滤膜去除颗粒性不溶物)通过系统泵流经色谱柱纯化，通过15％乙醇淋洗杂质，65％乙醇洗脱目标物，收集各馏分即为精制液并进行HPLC分析，将精制液减压蒸发，再抽真空干燥直至水分全部去除，收集干燥粉末，即为精制人参总皂苷粉末；

步骤3：取5g精制干燥粉用纯化水溶解，配置浓度100mg/mL，将WorkBeads 100TREN离子交换色谱柱(柱体积20mL)连接到层析系统上，设计流速12mL/min(360cm/h)，将样品通过系统泵过平衡好的色谱柱，上样完毕后，纯水淋洗色谱柱，采用1M NaOH和0.1MHCl洗脱结合到色谱柱上的杂质。收集柱穿出液和淋洗液进行HPLC分析，即为高纯度人参总皂苷组分，将该馏分冷冻后放入冻干机中，抽真空干燥直至水分全部去除，收集冻干粉末，即为人参总皂苷纯品粉末，称重分析计算总皂苷含量约为40.06％，收率约为92.04％。

上述各实施例中，HPLC分析条件如下：

(1)色谱柱填料：Unitary C18(5μm，4.6*150mm)；

(2)流动相A：水；流动相B：乙腈；

(3)流速：1mL/min；

(4)梯度条件：0min～20min 20％B相，20min～45min从20～46％B相，45min～55min从46％～55％B相，55min～60min 55％B相；

(5)柱温：25℃；

(6)检测波长：203nm；

(7)进样体积：10L。

经上述各实施例中的制备方法精制，步骤2、3中获得的精制人参总皂苷粉相比于步骤1中获得的粗提干燥粉色泽均匀，质地细腻；人参精制粉和最终纯品粉末加纯化水后迅速溶解，且其溶液澄清透亮，余味清爽，口感均衡，而粗提干燥粉溶解速度缓慢且溶液浑浊，药味厚重、苦涩，难以下咽。

如图2、3、4所示，各步骤中的HPLC分析结果表明，纯化前后样品的分析谱图中目标峰没有显著变化，根据总体积、积分峰面积及重量计算得知，纯化后人参总皂苷精制物和纯品中主要成分的含量没有明显下降，总皂苷类物质收率达95％以上，总皂苷含量可达40％以上。各实施例结果与现有技术对比如表1所示。上述实验结果表明了，采用本发明中人参总皂苷精制物及纯品的纯化方法制备，获得的人参总皂苷具有高收率和高纯度的优势。

表1本发明实施例和现有技术制备方法得到的总皂苷含量和收率比较

制备方法	总皂苷含量(％)	皂苷总收率(％)
			实施例1	42.54	95.65
实施例2	39.75	90.88
			实施例3	40.06	92.04
传统技术	10～30	50～80

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非用于限定本发明的保护范围，故凡依照本发明专利范围所做的等效变化或修饰，均属于本发明专利权利要求范围内。

Claims (7)

1.一种人参总皂苷的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

a) 将人参筛去杂质、洗净、软化、切片、干燥后，加20%~80%的乙醇进行浸泡5h~15h，然后煎煮0.5h~12h，滤取药液；药渣再依上述方法煎煮2~3次，滤取药液，并与上述药液合并进行浓缩，即得人参粗提物溶液；将所述人参粗提物溶液浓缩、干燥，即得人参粗提物干粉；

b) 将所述人参粗提物溶液进行膜过滤，收集膜透过液，采用高效液相色谱将膜透过液进行纯化，得精制液，将其浓缩、干燥，即得精制人参总皂苷粉末；

c) 将所述精制人参总皂苷粉末用纯化水溶解，采用离子交换色谱对其进行脱色除杂，收集脱色除杂后的液体，将其浓缩、干燥，即得人参总皂苷纯品粉末。

2.根据权利要求1所述的一种人参总皂苷的纯化方法，其特征在于，所述步骤b)中的膜可以是中空纤维膜、卷式膜、管式膜或板框式膜，所述膜孔径为0.22μm~0.65μm或500 KD ~1000KD。

3.根据权利要求1所述的一种人参总皂苷的纯化方法，其特征在于，所述步骤b)中采用高效液相色谱仪将膜透过液进行纯化包括：采用平衡缓冲液冲洗所述高效液相色谱仪中的色谱柱，将所述膜透过液通过所述色谱柱纯化，通过有机溶剂淋洗杂质、洗脱目标物，其中色谱上样和洗脱流速为140 cm/h~350cm/h。

4.根据权利要求3所述的一种人参总皂苷的纯化方法，其特征在于，所述色谱柱采用C18反相色谱柱，所述有机溶剂为甲醇、乙醇或乙腈，所述洗脱目标物的有机溶剂浓度为30%~90%。

5.根据权利要求1所述的一种人参总皂苷的纯化方法，其特征在于，所述步骤c)中采用离子交换色谱仪进行脱色除杂包括：上样完毕后，采用纯水淋洗所述离子交换色谱仪中的色谱柱，采用1M NaOH和0.1M HCl洗脱结合到色谱柱上的杂质，其中色谱上样和洗脱流速为150 cm/h ~500cm/h。

6.根据权利要求5所述的一种人参总皂苷的纯化方法，其特征在于，所述色谱柱为离子交换色谱柱。

7.根据权利要求1所述的一种人参总皂苷的纯化方法，其特征在于，所述步骤a)、b)、c)中的浓缩方式可以为常压蒸发、减压蒸发、薄膜蒸发、多效蒸发；所述步骤a)、b)、c)中的干燥方式可以为减压干燥、冷冻干燥、红外线干燥、喷雾干燥。

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