CN112209983B - 一种从桦褐孔菌中提取分离栓菌酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从桦褐孔菌中提取分离纯化栓菌酸的方法。本发明基于50％异丙醇柱层析提取，乙酸乙酯萃取和C18修饰硅胶柱层析等分离制备栓菌酸，具有用时短，低毒性，高提取率以及高纯度等诸多优势，采用本发明提取分离方法得到的栓菌酸呈白色蓬松片晶状，纯度可达90％以上。

Description

一种从桦褐孔菌中提取分离栓菌酸的方法

技术领域

本发明涉及生物提取技术领域，具体涉及一种从桦褐孔菌中提取分离纯化栓菌酸的方法。

背景技术

桦褐孔菌(Inonotus obliquus)属于真菌门、担子菌亚门、多孔菌科，主要分布在北半球气温较低的地区。在我国也主要分布在黑龙江、吉林(主要分布于长白山)等地。很早以前，人们就发现桦褐孔菌有着特殊的活性。人们用桦褐孔菌泡茶、煎煮慢慢地发现该真菌能够防治胃癌、肝癌、肠癌等多种癌症。栓菌酸(inotodiol)是桦褐孔菌特有的甾醇，体外实验发现栓菌酸不仅能抑制癌细胞的生长还能有效杀伤癌细胞。动物实验表明栓菌酸在体内有显著的促进抗肿瘤机制的发生的作用。有研究发现从桦褐孔菌中分离得到的栓菌酸可以通过抑制真核细胞拓扑异构酶I从而组织细胞DNA复制诱导细胞的凋亡蛋白酶激活来发挥抗恶性细胞增值的作用。体外实验研究发现栓菌酸抑制真核生物拓扑异构酶I的IC50为5μM，表明栓菌酸为一种潜在的临床抗肿瘤药物。

目前，桦褐孔菌中甾醇化合物的提取方法主要为索氏提取法、有机溶剂浸提法、超声或微波辅助提取法等。栓菌酸的分离方法主要有硅胶柱层析反复分离法，高速逆流色谱分离法，高效液相色谱法。普通硅胶柱层析法，产品纯度高，但存在洗脱溶剂毒性强，过程繁琐，用时较长以及产量低等特点。高速逆流色谱法作为一种高效、方便方法被用于科研实验室分离药用植物、药用真菌的有效成分，但该法消耗有机溶剂多，难以放大规模进行工业化分离，使用有局限性。

有鉴于此，提出本发明。

发明内容

本发明的首要目的是寻求一种高提取率、高纯度的提取分离纯化栓菌酸的方法，进而达到用时短，低毒性，高提取率和高纯度等效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种提取分离纯化栓菌酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1、将桦褐孔菌子实体粉碎，加入异丙醇水溶液中，浸泡后加入层析柱中，采用异丙醇水溶液洗脱，得到粗提取液；

S2、将提取液减压回收异丙醇，乙酸乙酯萃取合并，减压回收乙酸乙酯得干粉；

S3、干粉装入有C18修饰硅胶填充的层析柱，采用梯度醇溶液洗脱，收集100％醇溶液洗脱时的主要洗脱峰。

S4、100％醇溶液洗脱峰减压回收醇溶液后，浓缩液冷冻干燥得栓菌酸冻干粉。

在一些实施方式中，所述S1中异丙醇水溶液浓度为50-70％，优选的为50％。

在一些实施方式中，所述S1为：将桦褐孔菌子实体粉碎，按1kg:1～5L的料液比加入到50-70％的异丙醇水溶液中浸泡，浸泡0.4-0.6h后加入层析柱中，采用50-70％的异丙醇水溶液洗脱1个柱体积BV，得到粗提取液。

在一些实施方式中，S1种将桦褐孔菌子实体粉碎，按1kg:1L的料液比加入到50％的异丙醇水溶液中浸泡，浸泡0.5h后加入层析柱中，采用50％的异丙醇水溶液洗脱1个柱体积，所述洗脱流速为1BV/h(即1个柱体积/小时),总洗脱时间为1h，得到粗提取液。

在一些实施方式中，S1中所述层析柱的柱直径：柱床高度＝1:5。

在一些实施方式中，所述S2为：将提取液50-55℃减压回收异丙醇(优选的50℃减压回收)，浓缩为提取液体积的1/2后加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，每次30min，合并上层乙酸乙酯相，55-60℃(优选60℃)减压回收乙酸乙酯得干粉。

在一些实施方式中，S3中干粉按5％柱填料质量装入层析柱中。

在一些实施方式中，S3中所述C18修饰硅胶为球形，粒径为20-45μm，所述层析柱的柱直径与柱床高度比为1:10～1:30，优选的为1:10。

在一些实施方式中，S3中所述醇溶液为乙醇或甲醇溶液，优选为乙醇。

在一些实施方式中，S3中所述采用梯度醇溶液洗脱为醇溶液以5BV/h的流速梯度洗脱1h。

在一些实施方式中，所述S4为100％醇溶液洗脱峰在60℃减压回收醇溶液后，浓缩液-80℃冷冻干燥得栓菌酸冻干粉。

示例性的，如下为本发明的一个具体的实施方式：

一种提取分离纯化栓菌酸的方法，所述方法包括以下步骤：

S1、将桦褐孔菌子实体粉碎后加入50％异丙醇(料液比为1kg:1L)，浸泡0.5h后加入层析柱中(柱直径：柱床高度＝1:5)，采用50％异丙醇以1BV/h流速洗脱1BV，得到提取液(1BV为1个柱体积)；

S2、将提取液50℃减压回收异丙醇，当浓缩为提取液体积的1/2后，加入等体积的乙酸乙酯，萃取3次，每次30min，合并上层乙酸乙酯相，60℃减压回收乙酸乙酯得浓缩液；

S3、干粉装入上样柱中(上样量为5％柱填料质量)，上样柱连接C18修饰硅胶(球形，粒径为20-45μm)填充的层析柱(柱直径：柱床高度＝1:10)。采用以下梯度乙醇(或甲醇)溶液以5BV/h的流速洗脱1h，收集100％乙醇(或甲醇)洗脱时的主要洗脱峰。

表1C18修饰硅胶层析柱分离栓菌酸的乙醇(或甲醇)洗脱梯度

时间(min)	水的比例(％)	乙醇的比例(％)
			0	50	50
12	50	50
			72	0	100
108	0	100
			120	50	50

S4、100％乙醇(或甲醇)洗脱峰在60℃减压回收乙醇(或甲醇)后，浓缩液-80℃冷冻干燥得栓菌酸冻干粉。

本发明的提取分离纯化栓菌酸的方法相对于现有技术，至少具有以下有益效果：

1)本发明的提取分离纯化栓菌酸的方法，通过以异丙醇为提取溶剂，将桦褐孔菌粉碎后加入异丙醇进行预浸泡，随后装入层析柱中进行提取得到提取液，经浓缩后通过乙酸乙酯萃取得到栓菌酸粗体物，粗提物再通过C18修饰的硅胶柱层析分离可得高纯度栓菌酸。相比传统的有机溶剂提取-硅胶柱层析分离，本发明的提取方法桦褐孔菌的提取率和纯度均可达90％以上；

2)通过本发明优化的提取分离纯化栓菌酸的方法，提取得到的栓菌酸呈蓬松晶状，产品新能优；

3)本发明优化的提取分离纯化栓菌酸的方法，通过柱层析提取，相比常规提取法有效减少了提取溶剂的消耗。

4)本发明采用C18修饰的硅胶柱层析分离栓菌酸，相比传统硅胶柱层析分离，有效缩短了分离时间(1h内完成分离)，提高了桦褐孔菌的纯度和得率，可应用于大规模生产，适于产业应用。

5)本发明洗脱溶剂采用乙醇或甲醇，有效避免了氯仿、乙酸乙酯等高毒性、高挥发性有机试剂的使用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1不同提取溶剂对栓菌酸及多酚提取率的影响；

图2不同浓度异丙醇对栓菌酸提取率的影响；

图3不同萃取溶剂中栓菌酸HPLC检测：A为粗提物；B为石油醚萃取物；C为乙酸乙酯萃取物；D为正丁醇萃取物；

图4不同溶剂萃取物中栓菌酸纯度；

图5普通硅胶柱层析与C18修饰硅胶柱层析分离栓菌酸：A普通硅胶柱层析；B C18修饰硅胶柱层析；

图6为提取分离纯化栓菌酸的流程图；

图7为柱层析提取栓菌酸检测图；

图8为桦褐孔菌50％异丙醇提取物HPLC图；

图9为乙酸乙酯萃取相的HPLC检测图；

图10为C18修饰硅胶柱层析纯化的栓菌酸的HPLC检测图；

图11为栓菌酸MS检测图；

图12为栓菌酸NMR检测图；

图13为栓菌酸冻干粉。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。

除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。

如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。

在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。

本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。

此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。

本发明实施例中具体采用的试剂耗材均可来自商购。

实验例本发明提取分离流程的优化

1.提取溶剂对栓菌酸提取率的影响

分别称取S1中粉碎后的桦褐孔菌粉4份，每份660g，分别加入660mL的甲醇、乙醇异丙醇和丙酮，浸泡0.5h后分别装入60.6mm×374mm(直径×高度)的层析柱中，以

1.08L/h的流速用对应溶剂洗脱1h，收集洗脱液1.08L，HPLC检测不同提取液中栓菌酸的浓度，利用福林酚比色法计算不同提取液中多酚的浓度。重复实验3次。

其中，栓菌酸提取率(％)＝[栓菌酸浓度(mg/mL)×洗脱液体积(mL)×100]/桦褐孔菌粉质量(g)；多酚提取率(％)＝[多酚浓度(mg/mL)(以没食子酸计)×洗脱液体积(mL)×100]/桦褐孔菌粉质量(g)。

从图1中可见，采用异丙醇对桦褐孔菌粉提取后，栓菌酸提取率显著高于采用甲醇、乙醇、丙酮作为提取溶剂，达到了1.36mg/g。同时采用异丙醇作为提取溶剂，副产物多酚的提取率显著低于采用甲醇、乙醇、丙酮作为提取溶剂，仅为1.0mg/g，减少了多酚对后续栓菌酸纯化的干扰。综上所述，异丙醇作为提取溶剂提取桦褐孔菌粉，具有较高的栓菌酸提取率和较低的杂质干扰。

2.异丙醇浓度对栓菌酸提取率的影响

分别称取S1中粉碎后的桦褐孔菌粉11份，每份660g，分别加入660mL 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100％异丙醇水溶液，浸泡0.5h后分别装入60.6mm×374mm(直径×高度)的层析柱中，以1.08L/h的流速用对应浓度的异丙醇洗脱1h，收集洗脱液1.08L，HPLC检测不同提取液中栓菌酸的浓度。重复实验3次。栓菌酸提取率(％)＝[栓菌酸浓度(mg/mL)×洗脱液体积(mL)×100]/桦褐孔菌粉质量(g)。

从图2可见，采用50％异丙醇水溶液对桦褐孔菌粉提取后，栓菌酸提取率显著高于采用其它浓度的异丙醇溶液，达到了2.16mg/g，70％异丙醇效果次之，而采用水(0％异丙醇)提取时，栓菌酸提取率最低仅为0.48mg/g。综上所述，采用50％异丙醇水溶液作为提取溶剂提取桦褐孔菌粉，具有最高的栓菌酸提取率。

3.不同溶剂萃取对栓菌酸纯度的影响

称取S1中粉碎后的桦褐孔菌分660g，加入660mL的50％异丙醇，浸泡0.5h后装入60.6mm×374mm(直径×高度)的层析柱中，以1.08L/h的流速用50％异丙醇洗脱1h，收集洗脱液1.08L，将提取液于50℃下减压浓缩为洗脱液体积的1/2，即540mL，分别取180mL浓缩液装入3只500mL分液漏斗中，向3只漏斗中分别加入等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，剧烈震荡混匀5分钟后，静置25分钟使溶剂分层，收集上层溶剂。重复萃取3次，合并萃取液，旋蒸回收萃取溶剂后，用少量甲醇溶解萃取物上HPLC检测。

萃取物中栓菌酸纯度(％)＝[栓菌酸浓度(mg/mL)×萃取物甲醇溶液体积(mL)]×100/萃取物质量(mg)

由图3可见，相比其它萃取溶剂，乙酸乙酯可有效富集粗提液中的栓菌酸组分。正丁醇萃取效果最差，经HPLC检测未发现明显的栓菌酸色谱峰。石油醚可有效富集除栓菌酸外的其它甾醇组分，但对栓菌酸的富集效果较差。

由图4可见，粗提物经乙酸乙酯萃取后，栓菌酸纯度由9.2％上升到13.72％。粗提物经乙酸乙酯萃取可显著提高栓菌酸纯度，为后续分离工作奠定基础。

4.不同分离柱对栓菌酸纯度的影响

取200mg乙酸乙酯萃取物干法上样装入普通硅胶(球形，粒径为45-75μm)填充的层析柱(柱直径×柱床高度＝36.6mm×366mm)。按表2所示的梯度以氯仿：甲醇混合溶液1BV/h的流速洗脱5h，收集各主要洗脱峰上HPLC检测。

表2普通硅胶层析柱分离栓菌酸的氯仿：甲醇洗脱梯度

时间(min)	氯仿的比例(％)	甲醇的比例(％)
			0	100	0
180	0	100
			240	0	100
300	50	50

再取200mg乙酸乙酯萃取物干法上样装入C18修饰硅胶(球形，粒径为20-45μm)填充的层析柱(柱直径×柱床高度＝36.6mm×366mm)。按表1所示的梯度配制梯度乙醇溶液以1BV/h的流速洗脱层析柱2h，收集各主要洗脱峰上HPLC检测。

从图5可见，采用常规普通硅胶柱层析分离乙酸乙酯萃取物时，洗脱耗时达300分钟，色谱峰分离度较低，且峰型较杂。洗脱溶剂大量采用有生物毒性的氯仿。采用C18修饰硅胶柱层析分离乙酸乙酯萃取物时，耗时大为缩短，仅需120分钟，且色谱峰分离度较高，出现明显的栓菌酸洗脱峰。可见C18修饰硅胶配合甲醇或无毒性梯度洗脱效果优势明显。

基于上述实验并结合前期其他优化实验，确立本发明最优的提取分离纯化栓菌酸的流程图，如图6所示。接下来，基于图6的基础流程对实际桦褐孔菌粉进行分离纯化，以验证本发明方法体系的有效性和实用性。

实施例1

S1、将干燥至恒重的桦褐孔菌粉粉碎成粒度为40目的粗粉备用。称取S1中粉碎后的桦褐孔菌分660g，加入660mL的50％异丙醇，浸泡0.5h后装入60.6mm×374mm(直径×高度)的层析柱中，以1.08L/h的流速用50％异丙醇洗脱1h，收集洗脱液1.08L，将提取液于50℃下减压浓缩为洗脱液体积的1/2，即540mL；HPLC检测该步提取结果。

S2、加入540mL的乙酸乙酯萃取30分钟，收集上层乙酸乙酯相。萃取三次，每次30分钟。合并三次乙酸乙酯相共计1.62L，60℃减压回收乙酸乙酯得干粉6.69g；HPLC检测该步提取结果。

S3、干粉装入上样柱中，上样柱连接C18修饰硅胶(球形，粒径为20-45μm)填充的层析柱(柱直径×柱床高度＝36.6mm×366mm)。按表1所示的梯度以乙醇溶液5BV/h的流速洗脱1h，收集100％乙醇洗脱时的主要洗脱峰，体积为624mL；HPLC检测该步提取结果。

S4、100％乙醇洗脱峰在60℃减压回收乙醇后，浓缩液-80℃冷冻干燥得栓菌酸冻干粉1035.4mg。

结果表明：

图7为实施例1提取栓菌酸的检测图，图中有210nm和254nm下的两种检测结果。210nm和254nm均为萜类化合物常用的检测波长。从图7可见桦褐孔菌三萜类化合物在20-42min的范围内被有效洗脱，说明本发明柱层析提取可以有效的提高桦褐孔菌三萜类化合物的提取率。

图8为实施例1中经50％异丙醇柱层析提取栓菌酸的HPLC检测图(HPLC条件为：LC-20AT高效液相色谱仪，InertSustain C18柱(3.0×100mm,3μm),检测温度为室温，流速为1ml/min；流动相A相为超纯水，B相为乙腈；洗脱梯度为0-5min,30％B；5-25min,50％B；25-35min,90％B；35-40min,90％B；40-45min,30％B；45-50min,30％B)，从图8可见HPLC图谱中有5个明显的洗脱峰，其中峰高最高的为栓菌酸。

图9为实施例1的提取方法得到的栓菌酸乙酸乙酯萃取物的HPLC的谱图(HPLC条件为：LC-20AT高效液相色谱仪，InertSustain C18柱(3.0×100mm,3μm),检测温度为室温，流速为1ml/min；流动相A相为超纯水，B相为乙腈；洗脱梯度为0-5min,30％B；5-25min,50％B；25-35min,90％B；35-40min,90％B；40-45min,30％B；45-50min,30％B)，从图4可见有5个明显的洗脱峰，其中峰高最高的为栓菌酸，对比图8发现经过乙酸乙酯萃取后实现了栓菌酸的有效富集。

图10为实施例1的提取方法得到的精制栓菌酸的HPLC的谱图(HPLC条件为：LC-20AT高效液相色谱仪，InertSustain C18柱(3.0×100mm,3μm),检测温度为室温，流速为1ml/min；流动相A相为超纯水，B相为乙腈；洗脱梯度为0-5min,30％B；5-25min,50％B；25-35min,90％B；35-40min,90％B；40-45min,30％B；45-50min,30％B)，图中只剩3个明显的洗脱峰，其中主要峰为栓菌酸，另2个洗脱峰为残留的杂质，栓菌酸纯度达到90％。

图11为栓菌酸的MS鉴定图。将C18修饰硅胶柱层析分离得到的栓菌酸洗脱峰旋干后取一部分溶于色谱甲醇后通过SHIMADZU LC-MS 8050液质联用仪进行检测。由图11可以看出分子离子的最高峰为439.4。栓菌酸的分子量为456。质谱中的最高峰可能为栓菌酸加氢在脱掉一分子水的分子量，即(M+H-H2O)。该质谱图中的另外一个特征峰为409.35，该分子量可能为栓菌酸加氢后脱掉两分子水的分子量，即(M+H-2H2O)。

图12为栓菌酸的NMR鉴定图。将C18修饰硅胶柱层析分离得到的栓菌酸洗脱峰旋干后取一10mg溶于DMSO-D6后通过BRUKER AVANCE III核磁共振仪进行¹³C谱分析。由图12可以看栓菌酸的碳原子的化学位移为13C NMR(DMSO-D6,600MHz):δ18.34(C-18),19.43(C-27),20.77(C-6),26.01(C-30),26.94(C-26),28.05(C-23),28.58(C-22),28.88(C-16),30.48(C-28),32.69(C-12),37.06(C-1),39.01(C-10),47.05(C-13),49.47(C-20),50.55(C-17),77.25(C-3),124.32(C-24),131.57(C-25),133.87(C-9),134.79(C-8),177.42(C-21)。

图13为最终获得的栓菌酸冻干粉，从图13中可知实施例1提取得到的栓菌酸样品白色蓬松针晶状，HPLC检测其纯度达90％以上。

实施例2

S1、将干燥至恒重的桦褐孔菌粉粉碎成粒度为40目的粗粉备用。称取S1中粉碎后的桦褐孔菌粉1320g，加入1320mL的50％异丙醇，浸泡0.6h后装入两支60.6mm×374mm(直径×高度)的层析柱串联组装的柱子中，以2.16L/h的流速用50％异丙醇洗脱1h，收集洗脱液2.16L，将提取液于50℃下减压浓缩为洗脱液体积的1/2，即1080mL。

S2、加入1080mL的乙酸乙酯萃取30分钟，收集上层乙酸乙酯相。萃取三次，每次30分钟。合并三次乙酸乙酯相共计3.24，60℃减压回收乙酸乙酯得干粉13.5g。

S3、干粉装入上样柱中，上样柱连接C18修饰硅胶(球形，粒径为20-45μm)填充的层析柱(柱直径×柱床高度＝36.6mm×366mm)。按表1所示的梯度以甲醇溶液5BV/h的流速洗脱1h，收集100％甲醇洗脱时的洗脱峰。

S4、100％甲醇洗脱峰在60℃减压回收甲醇后，浓缩液-80℃冷冻干燥得栓菌酸冻干粉2.5g。

实施例3

S1、将干燥至恒重的桦褐孔菌粉粉碎成粒度为40目的粗粉备用。称取S1中粉碎后的桦褐孔菌粉300g，加入300mL的70％异丙醇，浸泡0.5h后装入60.6mm×374mm(直径×高度)的层析柱中，以1.08L/h的流速用70％异丙醇洗脱0.5h，收集洗脱液540mL，将提取液于55℃下减压浓缩去除异丙醇，得浓缩液160mL；HPLC检测该步提取结果。

S2、加入160mL的乙酸乙酯萃取40分钟，收集上层乙酸乙酯相。萃取三次，每次30分钟。合并三次乙酸乙酯相共计480mL，58℃减压回收乙酸乙酯得干粉3.02g；HPLC检测该步提取结果。

S3、干粉装入上样柱中，上样柱连接C18修饰硅胶(球形，粒径为20-45μm)填充的层析柱(柱直径×柱床高度＝36.6mm×366mm)。按表1所示的梯度以甲醇溶液5BV/h的流速洗脱1h，收集100％甲醇洗脱时的主要洗脱峰，体积为624mL；HPLC检测该步提取结果。

S4、100％乙醇洗脱峰在60℃减压回收乙醇后，浓缩液-80℃冷冻干燥得栓菌酸冻干粉535.4mg。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种提取分离纯化栓菌酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1、粉碎桦褐孔菌子实体，加入异丙醇水溶液中，浸泡后加入层析柱中，异丙醇水溶液洗脱，得粗提取液， 所述异丙醇水溶液浓度均为50-70%；

S2、提取液减压回收异丙醇，乙酸乙酯萃取合并，减压回收得干粉；

S3、干粉装入有 C18 修饰硅胶填充层析柱，采用梯度醇溶液洗脱，收集100％醇溶液洗脱时的主要洗脱峰；

S4、减压回收醇溶液后，浓缩液冷冻干燥得栓菌酸冻干粉。

2.权利要求 1 所述的提取分离纯化栓菌酸的方法，其特征在于，所述 S1 为：将桦褐孔菌子实体粉碎，按 1kg:1～5L 料液比的加入到异丙醇水溶液中浸泡，浸泡0.4-0.6h 后加入层析柱中，采用异丙醇水溶液洗脱 1 个柱体积，得到粗提取液；所述洗脱的流速为1BV/h，总洗脱时间为 1h。

3.权利要求 1-2 任一所述的提取分离纯化栓菌酸的方法，其特征在于，S1 中所述层析柱的柱直径：柱床高度=1:5。

4.权利要求 1-2任一所述的提取分离纯化栓菌酸的方法，其特征在于，所述 S2 为：将提取液 50-55℃减压回收异丙醇，加入等体积乙酸乙酯萃取合并，减压回收乙酸乙酯得干粉。

5.权利要求4所述的提取分离纯化栓菌酸的方法，其特征在于，当减压浓缩为提取液体积 1/2 后加入等体积的乙酸乙酯萃取 3 次，每次30min，合并上层乙酸乙酯相，55-60℃减压回收乙酸乙酯得干粉。

6.权利要求 1-2任一所述的提取分离纯化栓菌酸的方法，其特征在于，S3 中干粉按5%柱填料质量装入层析柱中。

7.权利要求 4所述的提取分离纯化栓菌酸的方法，其特征在于，S3 中所述 C18修饰硅胶为球形，粒径为 20-45µm，所述层析柱的柱直径与柱床高度比为 1:10～1:30。

8.权利要求7所述的提取分离纯化栓菌酸的方法，其特征在于，S3 中所述醇溶液为甲醇或乙醇溶液。

9.权利要求7所述的提取分离纯化栓菌酸的方法，其特征在于，S3 中所述采用梯度醇溶液洗脱为醇溶液以 5BV/h 的流速梯度洗脱 2h，收集 100%醇溶液洗脱时的主洗脱峰，所述具体洗脱梯度如下：

。

10.权利要求1所述的提取分离纯化栓菌酸的方法，其特征在于，所述S4 为 100%醇溶液洗脱峰在 60℃减压回收醇溶液后，浓缩液-80℃冷冻干燥得栓菌酸冻干粉。

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