CN109053851B - 一种含冬青素a的提取物及其提取方法 - Google Patents
一种含冬青素a的提取物及其提取方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及天然药物的提取技术领域,尤其是涉及一种含冬青素A的提取物及其提取方法。提取方法包括如下步骤:以乙醇溶液为溶剂,对海南冬青叶回流提取,收集提取液浓缩,得到浓缩液,调节浓缩液pH至2‑3;以大孔吸附树脂为填料,依次采用10‑30%乙醇溶液、70‑90%乙醇溶液对浓缩液进行洗脱;对70‑90%乙醇溶液洗脱得到的洗脱液回收浓缩得到清膏,加硅胶拌匀,减压干燥,得到拌样粉;将拌样粉上硅胶柱,进行超临界洗脱;收集洗脱液,结晶、干燥,得到含冬青素A的提取物。本发明对冬青素A的提取,纯度可达70%以上,总三萜含量95%以上,兼顾降低了杂质的含量,解决了现有技术中工艺繁琐、纯度低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物的提取技术领域,尤其是涉及一种含冬青素A的提取物及其提取方法。
背景技术
中药或天然药物以其独到的疗效在防治恶性肿瘤方面显示出巨大潜力,海南冬青(Ilex hainanensis Merr.)系广西壮族、瑶族民间使用历史悠久的中草药,主要分布于广东、广西、海南、贵州、云南等地,收载于《广西中药材标准》、《广西壮药质量标准》、国家《药典》附录,具有清热解毒、平肝潜阳、活血化瘀等功效。民间通常作茶饮。
海南冬青叶中主要包括黄酮类、咖啡酰奎宁酸类、三萜酸类、三萜皂苷类、挥发油和有机酸等成分。其中,经研究发现,冬青素A(Ilexgenin A,IA)作为一种五环类三萜类化合物,对肝癌细胞株HepG2细胞等增殖具有抑制作用,具有较好的抗肿瘤应用前景。
但是作为潜在药物开发,冬青素A的分离制备存在着工艺繁琐、纯度低的现状。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种含冬青素A的提取物的提取方法,所述方法通过树脂-超临界分离色谱耦合技术,在短周期内即可完成冬青素A的提取,且纯度可以达到70%以上,并且,同时兼顾降低了杂质的含量,解决了现有技术中存在的冬青素A的分离制备工艺繁琐、纯度低的问题。
本发明的第二目的在于提供一种含冬青素A的提取物,所述提取物中,冬青素A的纯度可达到70%以上,并且总三萜类成分含量高于95%,且其中现有技术中难以分离的乌索酸的含量低,如后续需进一步提纯,降低后续对冬青素A进一步提纯的难度。
为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
一种含冬青素A的提取物的提取方法,包括如下步骤:
(a)以乙醇溶液为溶剂,对海南冬青叶回流提取,收集提取液浓缩,得到浓缩液,调节浓缩液pH至2-3;
(b)以大孔吸附树脂为填料,依次采用10-30%乙醇溶液、70-90%乙醇溶液对所述浓缩液进行洗脱;
(c)对所述70-90%乙醇溶液洗脱得到的洗脱液回收浓缩得到清膏,加硅胶拌匀,减压干燥,得到拌样粉;
(d)将拌样粉上硅胶柱,进行超临界洗脱,流动相为超临界CO2和乙醇溶液;收集洗脱液,结晶、干燥,得到所述含冬青素A的提取物。
本发明所述的提取方法,选用的原料海南冬青叶是纯天然植物,以乙醇溶液作为溶剂进行提取,能够充分提取出海南冬青叶中的冬青素A,同时避免其它不必要杂质的溶出;同时,根据乙醇溶液提取得到的提取液中的成分,采用大孔吸附树脂进行吸附、分离纯化,利用冬青素A与树脂的吸附作用及冬青素A自身分子量的大小,采用特定比例的洗脱剂,除杂并纯化冬青素A。大孔树脂通过物理吸附,有选择性的吸附冬青素A。通过大孔吸附树脂的洗脱分离后,除去浓缩液中的强极性产物,将洗脱液加硅胶拌样得拌样粉,再上硅胶柱,经超临界CO2-乙醇洗脱,利用冬青素A和其它相对较弱极性的成分在超临界CO2-乙醇中不同的溶解度和硅胶不同的吸附作用,分别洗脱出来,进一步分离纯化。
并且,整个提取步骤中,无乙醇外的有机溶剂,不引入有毒物质,避免了有毒性的有机溶剂的残留,提高绿色性,并且降低成本。
优选的,所述步骤(a)中,所述乙醇溶液为30-80%的乙醇水溶液,优选为40-70%的乙醇水溶液,进一步优选为50-60%的乙醇水溶液。
提取的溶剂对提取物成分具有重要意义,采用上述溶剂对海南冬青叶进行提取,能够提高对海南冬青叶中冬青素A的溶出率,并且兼顾降低除三萜类外的其它成分的溶出率,提高海南冬青叶中冬青素A及三萜类的溶出率,降低结构较相近的乌索酸的溶出率。
以海南冬青干燥叶为基准,本发明对冬青素A的提取率在20g/kg以上,并且,得到的粗提物中,冬青素A的纯度在70%以上。
优选的,所述步骤(a)中,于70-80℃下回流提取。
优选的,所述步骤(a)中,回流提取的料液比为1﹕(4-8),优选为1﹕6。
步骤(a)中,回流提取的溶剂、温度和料液比对提取液中的杂质含量及目标物质的提取率均有影响。采用上述提取条件,能够降低提取液中的杂质含量,提高冬青素A的提取率。并且,为了降低后续如进一步分离的难度,降低了提取液中与冬青素A结构相近的乌索酸的含量。
优选的,所述步骤(a)中,回流提取的方式为:回流提取1-3次,每次回流提取1-3h;更优选的,回流提取2次,每次2h。
优选的,所述步骤(b)中,每个梯度洗脱所用的流动相的体积为大孔吸附树脂的3-5倍,优选为3.5-4.5倍。
优选的,所述步骤(b)中,大孔吸附树脂包括D101大孔吸附树脂、AB-8大孔吸附树脂、HPD-100大孔吸附树脂中的一种或多种。
本发明采用非极性或弱极性的吸附树脂,先采用相对强的极性溶剂洗脱,能够促进非极性或弱极性的物质在树脂上的吸附,而降低强极性的物质的吸附,从而先除去强极性的杂质,再采用极性相对较弱的溶剂洗脱,将冬青素A解吸附,收集得到。
优选的,所述(b)中,以大孔吸附树脂为填料,依次采用10-30%乙醇溶液、40-60%乙醇溶液、70-90%乙醇溶液对所述浓缩液进行洗脱。
采用上述变化洗脱剂对浓缩液进行洗脱,进一步除去杂质,提高纯度。
优选的,所述步骤(c)中,采用100-200目硅胶与清膏混合均匀,减压干燥、粉碎进行超临界色谱提纯。
优选的,硅胶与清膏的混合比例为(1-2)﹕1。
优选的,粉碎得到拌样粉,按照拌样粉与硅胶比例为1﹕(1.5-2.5)将拌样粉上硅胶柱。更优选的,拌样粉与硅胶的比例为1﹕2。
以硅胶作为固定相,将含冬青素A的干燥物充分分散。
当饱含目标物冬青素的二氧化碳流体进入分离器中时,受压力下降或温度变化的影响,二氧化碳流体与提取物迅速分离,大大提高了分离的效率,保证了提取物的纯度。
优选的,所述步骤(d)中,所述流动相中乙醇溶液为体积分数为85-100%的乙醇水溶液,优选为95%。。
优选的,所述流动相中,乙醇溶液的用量为超临界CO2量的20-40%。
优选的,所述超临界洗脱的条件为:压力为30-40MPa,温度为25-40℃。更优选的,所述洗脱的时间为1-2h。
优选的,所述超临界洗脱的条件为:压力为38MPa,温度为30℃。
超临界分离的条件,如温度和压力,对分离的效果具有重要意义。配合前序步骤中洗脱收集的物质,采用上述温度和压力下的分离条件,能够充分分离冬青素A,提高冬青素A的纯度,进一步将其中的乌索酸等难以后续分离除去的杂质去除。
优选的,所述步骤(d)中,收集洗脱液,浓缩后,于≤10℃的条件下结晶。更优选的,于2-6℃的条件下结晶。
在低于10℃的条件下结晶,提高冬青素A的纯度,避免温度过高,冬青素A的结晶率低,也避免温度过低,杂质随冬青素A结晶析出,降低纯度。
本发明还提供了一种采用所述含冬青素A的提取物的提取方法得到的含冬青素A的提取物。
优选的,所述提取物中,冬青素A的质量分数>70%。
优选的,所述提取物中,总三萜类的质量分数>95%。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)本发明所述的提取方法,协同树脂吸附以及超临界硅胶柱色谱,采用超临界CO2-乙醇洗脱,在较短的周期内即可完成冬青素A的分离纯化,并且所述提取方法中,对海南冬青叶中的冬青素A的提取收率高,可达20g/kg以上;
(2)本发明所述的提取方法,前后步骤相互匹配,并采用特定的洗脱剂、超临界分离条件等,使得得到的提取物中,冬青素A的纯度>70%,且总三萜类成分>95%;
(3)本发明所述的提取方法,在提高冬青素A纯度以及总三萜类成分的同时,降低其中乌索酸等杂质的含量,如在后续需要进一步提纯,降低了分离难度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的提取物的高效液相色谱图,具体数据见表1。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,但是本领域技术人员将会理解,下列所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例,仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明中表示乙醇水溶液中浓度的均为体积分数。
实施例1
本实施例所述的提取方法,包括如下步骤:
(1)将海南冬青叶粉碎过60目筛,加入55%的乙醇水溶液中,按料液比为1﹕6在70-80℃加热回流,重复提取2次,每次提取2h,过滤,合并滤液,减压浓缩至无乙醇气味,得到浓缩液。
(2)加入稀盐酸调节浓缩液的pH为3,以HPD-100大孔吸附树脂为填料,将浓缩液上样,依次用20%乙醇水溶液、80%乙醇水溶液洗脱,每个梯度洗脱4倍柱体积,收集80%乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液。
(3)将步骤(2)中收集的洗脱液回收得到清膏,加1倍量硅胶拌匀,减压干燥,粉碎得到拌样粉。
(4)将拌样粉上200-300目硅胶柱(拌样粉﹕硅胶=1﹕2),进行超临界CO2-乙醇液洗脱,采用洗脱压力为38MPa、温度为30℃的条件,流动相为超临界CO2和乙醇溶液,比例为乙醇溶液为超临界CO2的30%,乙醇溶液为体积分数为95%的乙醇水溶液;在上述条件下进行洗脱2h,收集洗脱液,减压回收乙醇,采用乙醇洗出减压的浓缩液,置于6℃的低温环境中结晶,过滤,干燥,得到白色粉末提取物。
实施例2
本实施例参考实施例1的提取方法,区别仅在于,步骤(1)中提取采用的溶剂为60%的乙醇水溶液。
实施例3
本实施例参考实施例1的提取方法,区别仅在于,步骤(1)中提取采用的溶剂为50%的乙醇水溶液。
实施例4
本实施例参考实施例1的提取方法,区别仅在于,步骤(1)中提取采用的溶剂为40%的乙醇水溶液。
实施例5
本实施例参考实施例1的提取方法,区别仅在于,步骤(1)中提取采用的溶剂为70%的乙醇水溶液。
实施例6
本实施例所述的提取方法,包括如下步骤:
(1)将海南冬青叶粉碎过60目筛,加入55%的乙醇水溶液中,按料液比为1﹕6在70-80℃加热回流,重复提取2次,每次提取2h,过滤,合并滤液,减压浓缩至无乙醇气味,得到浓缩液。
(2)加入稀盐酸调节浓缩液的pH为3,以HPD-100大孔吸附树脂为填料,将浓缩液上样,依次用20%乙醇水溶液、50%乙醇水溶液、80%乙醇水溶液洗脱,每个梯度洗脱4倍柱体积,收集80%乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液。
(3)将步骤(2)中收集的洗脱液回收得到清膏,加1倍量硅胶拌匀,减压干燥,粉碎得到拌样粉。
(4)将拌样粉上200-300目硅胶柱(拌样粉﹕硅胶=1﹕2),进行超临界CO2-乙醇液洗脱,采用洗脱压力为38MPa、温度为30℃的条件,流动相为超临界CO2和乙醇溶液,比例为乙醇溶液为超临界CO2的30%,乙醇溶液为体积分数为95%的乙醇水溶液;在上述条件下进行洗脱2h,收集洗脱液,减压回收乙醇,采用乙醇洗出减压的浓缩液,置于6℃的低温环境中结晶,过滤,干燥,得到白色粉末提取物。
实施例7
本实施例所述的提取方法,包括如下步骤:
(1)将海南冬青叶粉碎过60目筛,加入55%的乙醇水溶液中,按料液比为1﹕6在70-80℃加热回流,重复提取2次,每次提取2h,过滤,合并滤液,减压浓缩至无乙醇气味,得到浓缩液。
(2)加入稀盐酸调节浓缩液的pH为3,以HPD-100大孔吸附树脂为填料,将浓缩液上样,依次用20%乙醇水溶液、80%乙醇水溶液洗脱,每个梯度洗脱4倍柱体积,收集80%乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液。
(3)将步骤(2)中收集的洗脱液回收得到清膏,加2倍量硅胶拌匀,减压干燥,粉碎得到拌样粉。
(4)将拌样粉上200-300目硅胶柱(拌样粉﹕硅胶=1﹕2),进行超临界CO2-乙醇液洗脱,采用洗脱压力为38MPa、温度为30℃的条件,流动相为超临界CO2和乙醇溶液,比例为乙醇溶液为超临界CO2的40%,乙醇溶液为体积分数为95%的乙醇水溶液;在上述条件下进行洗脱1h,收集洗脱液,减压回收乙醇,采用乙醇洗出减压的浓缩液,置于6℃的低温环境中结晶,过滤,干燥,得到白色粉末提取物。
实施例8
本实施例所述的提取方法,包括如下步骤:
(1)将海南冬青叶粉碎过60目筛,加入55%的乙醇水溶液中,按料液比为1﹕6在70-80℃加热回流,重复提取2次,每次提取2h,过滤,合并滤液,减压浓缩至无乙醇气味,得到浓缩液。
(2)加入稀盐酸调节浓缩液的pH为3,以HPD-100大孔吸附树脂为填料,将浓缩液上样,依次用20%乙醇水溶液、50%乙醇水溶液、80%乙醇水溶液洗脱,每个梯度洗脱4倍柱体积,收集80%乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液。
(3)将步骤(2)中收集的洗脱液回收得到清膏,加1倍量硅胶拌匀,减压干燥,粉碎得到拌样粉。
(4)将拌样粉上200-300目硅胶柱(拌样粉﹕硅胶=1﹕2),进行超临界CO2-乙醇液洗脱,采用洗脱压力为38MPa、温度为30℃的条件,流动相为超临界CO2和乙醇溶液,比例为乙醇溶液为超临界CO2的40%,乙醇溶液为体积分数为95%的乙醇水溶液;在上述条件下进行洗脱2h,收集洗脱液,减压回收乙醇,采用乙醇洗出减压的浓缩液,置于6℃的低温环境中结晶,过滤,干燥,得到白色粉末提取物。
实施例9
本实施例参考实施例1的提取方法,区别仅在于,步骤(4)中洗脱条件为:压力为30MPa,温度为40℃。
实施例10
本实施例参考实施例1的提取方法,区别仅在于,步骤(4)中洗脱条件为:压力为40MPa,温度为25℃。
实施例11
本实施例参考实施例1的提取方法,区别仅在于,步骤(4)中洗脱条件为:压力为20MPa,温度为40℃。
实施例12
本实施例参考实施例1的提取方法,区别仅在于,步骤(4)中置于10℃的低温环境中结晶。
比较例1
比较例1参考实施例1的提取方法,区别在于,不包括步骤(d),通过有机溶剂石油醚进行萃取,收集下层液体,干燥。
实验例1
为了对比说明本发明各实施例和比较例所述的提取方法,对各实施例和比较例提取得到的含冬青素A的提取物进行高效液相色谱表征,具体HPLC条件为:
Kormasil C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-0.1%甲酸水(60﹕40);流速:1mL/min;柱温:25℃;检测波长:210nm;进样量:20μL。
请参阅图1,其是本发明实施例制备得到的提取物的HPLC图谱,具体数据见表1。
表1图1HPLC图谱对应的数据
各实施例得到的提取物的冬青素A的含量、总三萜类成分的含量以及乌索酸的含量(其它杂质未在表中显示)如表2所示。
表2不同处理得到的提取物中含量测试结果
编号 | 冬青素A/% | 总三萜类/% | 乌索酸/% |
实施例1 | 86.2 | 98.4 | 0.4 |
实施例2 | 84.6 | 97.5 | 0.6 |
实施例3 | 83.7 | 94.2 | 0.5 |
实施例4 | 82.4 | 91.3 | 0.7 |
实施例5 | 83.1 | 96.8 | 0.7 |
实施例6 | 88.4 | 98.9 | 0.2 |
实施例7 | 88.1 | 98.5 | 0.1 |
实施例8 | 89.5 | 99.3 | 0.04 |
实施例9 | 84.3 | 97.1 | 0.8 |
实施例10 | 84.6 | 96.7 | 0.6 |
实施例11 | 78.2 | 90.3 | 1.2 |
实施例12 | 84.4 | 98.2 | 0.9 |
比较例1 | 56.7 | 79.3 | 5.4 |
实验例2
为了对比说明本发明各实施例和比较例的提取方法对海南冬青叶中冬青素A的提取收率,对各实施例和比较例提取得到的含冬青素A的提取物的提取收率进行测试,测试结果见表3。
表3不同提取方法对海南冬青叶中冬青素A的提取收率
编号 | 提取收率(g/kg) |
实施例1 | 25.2 |
实施例2 | 23.6 |
实施例3 | 22.4 |
实施例4 | 21.3 |
实施例5 | 21.8 |
实施例6 | 27.5 |
实施例7 | 27.1 |
实施例8 | 29.2 |
实施例9 | 22.9 |
实施例10 | 23.6 |
实施例11 | 20.2 |
实施例12 | 23.9 |
比较例1 | 15.3 |
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (23)
1.一种含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,包括如下步骤:
(a)以乙醇溶液为溶剂,对海南冬青叶回流提取,收集提取液浓缩,得到浓缩液,调节浓缩液pH至2-3;
(b)以大孔吸附树脂为填料,依次采用10-30%乙醇溶液、70-90%乙醇溶液对所述浓缩液进行洗脱;
(c)对所述70-90%乙醇溶液洗脱得到的洗脱液回收浓缩得到清膏,加硅胶拌匀,减压干燥,得到拌样粉;
(d)将拌样粉上硅胶柱,进行超临界洗脱,流动相为超临界CO2和乙醇溶液;收集洗脱液,结晶、干燥,得到所述含冬青素A的提取物。
2.根据权利要求1所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,所述步骤(a)中,所述乙醇溶液为30-80%的乙醇水溶液。
3.根据权利要求2所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,所述步骤(a)中,所述乙醇溶液为40-70%的乙醇水溶液。
4.根据权利要求3所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,所述步骤(a)中,所述乙醇溶液为50-60%的乙醇水溶液。
5.根据权利要求1所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,所述步骤(a)中,于70-80℃下回流提取。
6.根据权利要求5所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,所述步骤(a)中,回流提取的料液比为1﹕(4-8)。
7.根据权利要求5所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,所述步骤(a)中,回流提取的方式为:回流提取1-3次,每次回流提取1-3h。
8.根据权利要求1所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,所述步骤(b)中,每个梯度洗脱所用的流动相的体积为大孔吸附树脂的3-5倍。
9.根据权利要求8所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,所述步骤(b)中,大孔吸附树脂包括D101大孔吸附树脂、AB-8大孔吸附树脂、HPD-100大孔吸附树脂中的一种或多种。
10.根据权利要求1所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,所述步骤(c)中,采用100-200目硅胶与清膏混合均匀,减压干燥、粉碎进行超临界洗脱。
11.根据权利要求10所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,硅胶与清膏的混合比例为(1-2)﹕1。
12.根据权利要求10所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,粉碎得到拌样粉,按照拌样粉与硅胶比例为1﹕(1.5-2.5)将拌样粉上硅胶柱。
13.根据权利要求12所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,拌样粉与硅胶的比例为1﹕2。
14.根据权利要求1所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,所述步骤(d)中,所述流动相中,乙醇溶液为体积分数为85-100%的乙醇溶液。
15.根据权利要求14所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,所述步骤(d)中,所述流动相中,乙醇溶液为体积分数为90-100%的乙醇溶液。
16.根据权利要求15所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,所述步骤(d)中,所述流动相中,乙醇溶液为体积分数为95%的乙醇溶液。
17.根据权利要求14所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,所述流动相中,乙醇溶液的用量为超临界CO2量的20-40%。
18.根据权利要求1-17任一项所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,所述超临界洗脱的条件为:压力为30-40MPa,温度为25-40℃。
19.根据权利要求18所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,所述超临界洗脱的时间为1-2h。
20.根据权利要求18所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,所述超临界洗脱的条件为:压力为38MPa,温度为30℃。
21.根据权利要求1所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,所述步骤(d)中,收集洗脱液,浓缩后,于≤10℃的条件下结晶。
22.根据权利要求21所述的含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,于2-6℃的条件下结晶。
23.一种含冬青素A的提取物的提取方法,其特征在于,包括如下步骤:
(a)以乙醇溶液为溶剂,对海南冬青叶回流提取,收集提取液浓缩,得到浓缩液,调节浓缩液pH至2-3;
(b)以大孔吸附树脂为填料,依次采用10-30%乙醇溶液、40-60%乙醇溶液、70-90%乙醇溶液对所述浓缩液进行洗脱;
(c)对所述70-90%乙醇溶液洗脱得到的洗脱液回收浓缩得到清膏,加硅胶拌匀,减压干燥,得到拌样粉;
(d)将拌样粉上硅胶柱,进行超临界洗脱,流动相为超临界CO2和乙醇溶液;收集洗脱液,结晶、干燥,得到所述含冬青素A的提取物。
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