CN102872168A - 一种山绿茶中所含总三萜及冬青素a的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

一种提取富集山绿茶总三萜和单体冬青素A的方法，其特征是提取的步骤为：原料山绿茶用50％-95％乙醇回流提取，提取液浓缩离心后得上清液和沉淀部分，沉淀部分以30％-40％乙醇混悬，再以石油醚萃取，下层溶液减压浓缩干燥后得总三萜；此外，将上述乙醇提取液减压回收蒸干，以水溶解，加酸水解，有机溶剂萃取，回收至干，上硅胶柱，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收洗脱溶剂，得到冬青素A。本发明的提取富集方法，得到的产品总三萜含量超过50％，单体冬青素A纯度高，同时本方法重复性和稳定性好，原料有效成分转移率高，成本低，操作简便，适用于工业化生产。同时，本发明还涉及山绿茶总三萜和冬青素A在治疗心血管疾病方面，特别是动脉粥样硬化方面的应用，具有潜在的开发价值。

Description

一种山绿茶中所含总三萜及冬青素A的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种中药有效部位及单体的提取富集工艺及其应用，特别是涉及山绿茶总三萜和冬青素A单体提取富集方法及其心血管活性，属于中药技术领域。

背景技术

心血管疾病是临床常见病症，今年来随着经济的快速发展、生活水平的不断提高，特别是饮食结构和生活习性的改变，使得心血管疾病在全世界的发生率和死亡率不断提高。动脉粥样硬化是动脉硬化的一种，表现为大、中动脉内膜出现含胆固醇、类脂肪等的黄色物质，多由脂肪代谢紊乱、神经血管功能失调引起。由动脉粥样硬化导致的心脑血管疾病已经成为现代社会中最重要的致死和致残的原因。目前，他汀类是临床上降脂治疗的首选药物，关于中药用于抗动脉粥样硬化药效评价的报道较少，也尚无单体成分开发的这类药物上市。

山绿茶为冬青科冬青属植物海南冬青Ilex hainanensis Merr.的干燥叶。具有清热解毒，消肿止痛，活血通脉的功效。用于降血压，降血脂，降胆固醇，冠心病，脑血管意外所致的偏瘫，风热感冒，肺热咳嗽，喉头水肿，扁桃体炎，痢疾等症，为广西少数民族民间草药，使用历史悠久，已收载于《广西中药材标准》(1990年版)。

植物化学研究表明，山绿茶的主要化学成分为三萜类、黄酮类等成分。现已分离得到的单体化合物主要有冬青素A、熊果酸、齐墩果酸、α-香树脂素、β-香树脂素、冬青皂苷A1等。同时，三萜和冬青素A也是山绿茶主要的生物活性成分，冬青素A的结构式如图1所示。

药理研究表明，山绿茶具有显著的降血压和降血脂的作用，且未见明显毒副反应。三萜类是山绿茶的主要活性部位，具有显著的抗菌、抗炎以及肝脏保护作用。而冬青素A是山绿茶中主要的三萜类化合物，在山绿茶中的含量可以达到5％以上，也具有明显的抗菌作用，且对肝癌诱导的肝功能损伤具有明显的保护作用。目前尚无山绿茶总三萜和冬青素A用于治疗动脉粥样硬化的研究报道。

本发明提供了山绿茶总三萜和冬青素A的提取富集方法，并经过药理实验验证了山绿茶总三萜和冬青素A的抗动脉粥样硬化作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种从山绿茶中得到有效成分提取物，即山绿茶总三萜和有效成分单体，即冬青素A的方法以及山绿茶有效成分提取物和单体在治疗心血管疾病方面的应用，具体是在治疗动脉粥样硬化方面的应用。

本发明以如下技术方案解决上述技术问题：

1、提取富集有效成分提取物，即山绿茶总三萜的方法有以下步骤：

原料山绿茶用70％-95％乙醇回流提取，提取液浓缩离心后得上清液和沉淀部分；沉淀部分以30％-40％乙醇混悬，再以石油醚萃取，下层溶液减压浓缩干燥后得总三萜。

提取富集总三萜的最优化技术方案为：

a.取原料山绿茶，加山绿茶12倍量(v/w)、浓度为90％的乙醇溶液浸泡过夜，加热回流提取2次，每次2h；

b.合并提取液，浓缩得稠浸膏，以4000r/min离心10min，分离得到上清液和沉淀部分；

c.将沉淀部分以30％-40％乙醇混悬，再以石油醚(3：1，v/v)萃取2次脱色，下层溶液减压浓缩后得浸膏，自然晾干，粉碎，过60目筛，得山绿茶总三萜。

2、提取富集山绿茶有效成分单体，即冬青素A的方法有以下步骤：

原料山绿茶用70％-95％乙醇回流提取，提取液减压回收蒸干，以水溶解；加入5％的氢氧化钾水解，有机溶剂萃取，有机溶剂层回收至干，上硅胶柱，石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮和氯仿-甲醇等梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收洗脱溶剂，得到冬青素A单体。

提取富集山绿茶冬青素A单体的最优化技术方案为：

a.取原料山绿茶，加山绿茶12倍量(v/w)、浓度为90％的乙醇溶液浸泡过夜，加热回流提取2次，每次2h，合并提取液，减压回收蒸干，以水溶解；

b.加入10％盐酸，加热回流3h，加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层回收至干；

c.取浸膏上硅胶柱，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收洗脱溶剂，得到冬青素A单体。

周园等报道了毛冬青中冬青素A的制备方法，本方法与之相比，其优势在于：

由于山绿茶中除了含有冬青素A外，还含有大量的皂苷类化合物，如冬青皂苷A1，6‘-O-乙酰冬青皂苷A1等，其中冬青皂苷A1在药材中的含量达到3-4％，而这些皂苷类化合物都是以冬青素A为苷元的。本方法通过加入酸或碱，进行水解，使这些皂苷类化合物都水解转化为冬青素A，进而极大地提高了冬青素A单体的得率(见具体实施例11)，并且该步骤的增加并不增加本方法的成本。

本发明提取富集山绿茶有效成分提取物及有效成分单体的方法，在提取过程中有选择性的富集活性成分，去除大量杂质，得到的产品采用UV法测定的总三萜含量大于50％，HPLC法测定冬青素A纯度达到95％，同时，本方法的重复性和稳定性好，从而保证了疗效的稳定；原料有效成分转移率高，成本低，操作简便，适用于工业化生产。

本发明还提供了山绿茶有效成分提取物及有效成分单体在治疗心血管疾病，尤其是在治疗动脉粥样硬化方面的应用。

具体实施方式

实施例1

a.取原料山绿茶5kg，加25L70％的甲醇溶液浸泡过夜，加热回流提取1次，每次1.5h；

b.合并提取液，浓缩得稠浸膏，以4000r/min离心10min，分离得到上清液和沉淀部分；

c.将沉淀部分以30％-40％乙醇混悬，再以石油醚(5：1，v/v)萃取3次脱色，下层溶液减压浓缩后得浸膏，自然晾干，粉碎，过60目筛，得山绿茶总三萜537g，含量为50.8％。

实施例2

a.取原料山绿茶5kg，加35L75％的乙醇溶液浸泡过夜，加热回流提取1次，每次3h；

b.合并提取液，浓缩得稠浸膏，以4000r/min离心10min，分离得到上清液和沉淀部分；

c.将沉淀部分以30％-40％乙醇混悬，再以石油醚(3：1，v/v)萃取2次脱色，下层溶液减压浓缩后得浸膏，自然晾干，粉碎，过60目筛，得山绿茶总三萜546g，含量为53.6％。

实施例3

a.取原料山绿茶5kg，加50L85％的乙醇溶液浸泡过夜，加热回流提取2次，每次2.5h；

b.合并提取液，浓缩得稠浸膏，以4000r/min离心10min，分离得到上清液和沉淀部分；

c.将沉淀部分以30％-40％乙醇混悬，再以二氯甲烷(6：1，v/v)萃取3次脱色，下层溶液减压浓缩后得浸膏，自然晾干，粉碎，过60目筛，得山绿茶总三萜562g，含量为54.7％。

实施例4

a.取原料山绿茶5kg，加55L90％的甲醇溶液浸泡过夜，加热回流提取3次，每次0.5h；

b.合并提取液，浓缩得稠浸膏，以4000r/min离心10min，分离得到上清液和沉淀部分；

c.将沉淀部分以30％-40％乙醇混悬，再以石油醚(4：1，v/v)萃取2次脱色，下层溶液减压浓缩后得浸膏，自然晾干，粉碎，过60目筛，得山绿茶总三萜570g，含量为50.2％。

实施例5

a.取原料山绿茶5kg，加60L95％的乙醇溶液浸泡过夜，加热回流提取2次，每次2h；

b.合并提取液，浓缩得稠浸膏，以4000r/min离心10min，分离得到上清液和沉淀部分；

c.将沉淀部分以30％-40％乙醇混悬，再以氯仿(3：1，v/v)萃取2次脱色，上层溶液减压浓缩后得浸膏，自然晾干，粉碎，过60目筛，得山绿茶总三萜580g，含量为51.6％。

实施例6

a.取原料山绿茶5kg，加25L70％的甲醇溶液浸泡过夜，加热回流提取1次，每次1.5h，合并提取液，减压回收蒸干，以水溶解；

b.加入1％盐酸，加热回流4h，加入石油醚萃取，石油醚层回收至干；

c.取浸膏上硅胶柱，氯仿-甲醇梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收洗脱溶剂，得到冬青素A单体120g，纯度为90％。

实施例7

a.取原料山绿茶5kg，加35L75％的乙醇溶液浸泡过夜，加热回流提取3次，每次3h，合并提取液，减压回收蒸干，以水溶解；

b.加入5％硫酸，加热回流3h，加入氯仿萃取，氯仿层回收至干；

c.取浸膏上硅胶柱，氯仿-甲醇梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收洗脱溶剂，得到冬青素A单体147g，纯度为92％。

实施例8

a.取原料山绿茶5kg，加50L85％的乙醇溶液浸泡过夜，加热回流提取2次，每次0.5h，合并提取液，减压回收蒸干，以水溶解；

b.加入10％盐酸，加热回流2h，加入二氯甲烷萃取，氯仿层回收至干；

c.取浸膏上硅胶柱，石油醚-丙酮梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收洗脱溶剂，得到冬青素A单体102g，纯度为91％。

实施例9

a.取原料山绿茶5kg，加60L90％的乙醇溶液浸泡过夜，加热回流提取1次，每次2h，合并提取液，减压回收蒸干，以水溶解；

b.加入1％氢氧化钠，加热回流2.5h，加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层回收至干；

c.取浸膏上硅胶柱，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收洗脱溶剂，得到冬青素A单体153g，纯度为93％。

实施例10

a.取原料山绿茶5kg，加40L90％的甲醇溶液浸泡过夜，加热回流提取3次，每次2.5h，合并提取液，减压回收蒸干，以水溶解；

b.加入10％氢氧化钾，加热回流3h，加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层回收至干；

c.取浸膏上硅胶柱，石油醚-丙酮梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收洗脱溶剂，得到冬青素A单体123g，纯度为91％。

实施例11

对已报道方法及本发明中方法进行对比实验：

本发明中方法：

a.取原料山绿茶5kg，加60L90％的乙醇溶液浸泡过夜，加热回流提取1次，每次2h，合并提取液，减压回收蒸干，以水溶解；

b.加入5％氢氧化钾，加热回流2.5h，加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层回收至干；

c.取浸膏上硅胶柱，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收洗脱溶剂，得到冬青素A单体160g，纯度为92％。

已报道方法：

a.取原料山绿茶5kg，加60L甲醇溶液浸泡过夜，加热回流提取1次，每次2h，合并提取液，减压回收蒸干，以水溶解；

b.加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层回收至干；

c.取浸膏上硅胶柱，氯仿-甲醇梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收洗脱溶剂，得到冬青素A单体77.5g，纯度为90％。

实施例12

总三萜及冬青素A抗动脉粥样硬化的药理实验：

载脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠30只，雌雄各半，体重20g-30g，由南京大学模式动物中心提供。实验动物按3只一笼分笼饲养，饲养室内温度控制在22±2℃，相对湿度50±5％，明暗各12小时，自由饮水、进食。小鼠经1周适应性饲养之后随机分为正常组、动脉粥样硬化模型组、山绿茶总三萜组(triterpenoids-enriched extract，TEE)、冬青素A组(IlexgeninA，IA)和阳性对照组(辛伐他汀组，Simvastatin)，每组6只，雌雄各3只。正常对照组小鼠给以普通饲料，其余四组小鼠给以高脂饲料(78.85％普通饲料+21％脂肪+0.15％胆固醇)，其中三个给药组高脂饲料中分别含有TEE(200mg/kg)、IA(10mg/kg)和辛伐他汀(4mg/kg)。小鼠喂养12周后，眼眶静脉取血进行各药理学指标的检测，并分离胸主动脉进行H&E染色观察各组小鼠主动脉瓣形态学变化。

实验结果显示，在血脂方面，与正常对照组比较，模型组总胆固醇(TC)、甘油三酯(TGs)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)显著升高(P＜0.01)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)没有显著变化；辛伐他汀能显著降低血清TC、TGs、LDL-C(P＜0.01)，但对HDL-C水平没有显著影响；TEE组血脂水平没有显著变化，而经过IA治疗的ApoE基因敲除小鼠与模型组比较，TGs水平显著下降(P＜0.01)，且此作用与辛伐他汀治疗组无显著区别。(表1)。

表1 山绿茶总三萜和冬青素A对动脉粥样硬化小鼠血清中药理学指标的影响

结果以平均值±SEM表示；

^##P＜0.01，与正常对照组相比；^**P＜0.01，与模型组相比；^ΔΔP＜0.01，与辛伐他汀组相比。

主动脉瓣切片H&E染色形态学检测结果显示，模型组动脉粥样硬化斑块严重，可见血管内膜出现纤维帽以及脂质核心，脂质核心伴随巨噬细胞浸润。斑块面积与管腔比值为18.42％±2.63％，与正常组相比P＜0.01。给药组均显著降低了这一比值，其中总三萜组为12.56％±1.37％；冬青素A治疗组为10.36％±2.51％；辛伐他汀治疗组为9.94％±3.41％，与模型组比较P值均小于0.05，各给药组间无显著差异(图2)。

结果表明，山绿茶总三萜和冬青素A具有不同程度的抗动脉粥样硬化作用，其中冬青素A抗动脉粥样硬化作用尤为显著，具有重要的潜在产业化开发价值。

附图说明

图1冬青素A结构图

图2各组小鼠胸主动脉瓣横切面斑块面积与管腔比值。Model，模型组；TTE，山绿茶总三萜组；IA，冬青素A组；Simvastatin，辛伐他汀组。结果以平均值±SEM表示。*P＜0.05，与模型组相比。

Claims (10)

1.一种山绿茶有效成分提取物，其特征是：提取物中包括的主要活性成分是三萜类成分，总三萜的含量为50-70％。

2.一种山绿茶有效成分单体，其特征是：冬青素A单体的含量在90％以上。

3.一种制备权利1和2所述的山绿茶有效成分提取物及单体的方法，其特征是经过以下提取方法获得：

原料山绿茶用70％-95％低级醇回流提取，提取液浓缩，离心后得上清液和沉淀部分；沉淀部分以30％-40％低级醇混悬，再以低极性有机溶剂萃取除去色素，下层溶液减压浓缩干燥后得山绿茶有效成分提取物，即山绿茶总三萜；

低级醇提取液浓缩后，加入1％-10％的酸或碱液，加热回流，加入低极性有机溶剂萃取，有机溶剂萃取物经硅胶柱层析，有机溶剂梯度洗脱，得到山绿茶有效成分单体，即冬青素A单体。

4.根据权利要求3所述的山绿茶有效成分提取物及单体的制备方法，其特征是所述的提取液优选5-12倍量的浓度为85％-95％的乙醇水溶液。

5.根据权利要求3所述的山绿茶有效成分提取物的方法，其特征是所述的萃取液可以是石油醚、乙醚、氯仿、环己烷或二氯甲烷。

6.根据权利要求3所述的山绿茶中有效成分单体的方法，其特征是所述的酸或碱液可以是盐酸、硫酸、磷酸、甲酸或氢氧化钠、氢氧化钾；其浓度为2％-10％的酸或碱液。

7.根据权利要求3所述的山绿茶中有效成分单体的方法，其特征是所述的萃取液可以是石油醚、氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯。

8.根据权利要求3所述的山绿茶中有效成分单体的方法，其特征是硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮和氯仿-甲醇等梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收洗脱溶剂，得到冬青素A单体。

9.一种权利要求1和2中所述的山绿茶有效成分提取物和单体在治疗心血管疾病方面的用途。

10.根据权利要求9所述的山绿茶有效成分提取物和单体在治疗心血管疾病方面的用途，其特征是所述的心血管疾病为动脉粥样硬化。

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