CN103536615A - 香蜂草苷和异樱花素的制备方法及其在抗糖尿病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于制药技术领域。本发明公开了香蜂草苷和异樱花素在制备糖尿病药物中的应用和制备方法。香蜂草苷和异樱花素是从风轮菜(Clinopodium.chinense(Benth.)O.Kuntze)全草中分离得到。风轮菜全草干燥粉碎、醇提取、减压回收后得到浓缩的提取物，经碱溶酸沉、乙酸乙酯萃取后得到乙酸乙酯提取物，经大孔树脂、聚酰胺、硅胶、凝胶柱层析和重结晶，得到香蜂草苷和异樱花素。异樱花素和香蜂草苷具有显著地降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖，降低血清总胆固醇含量，改善游离脂肪酸所致的血管内皮细胞胰岛素抵抗和高糖对血管内皮细胞的损伤的作用。可用于制备预防和治疗糖尿病、糖尿病引起的脂代谢紊乱、冠心病、动脉粥样硬化等心脑血管面疾病以及糖尿病周围血管病变。

Description

香蜂草苷和异樱花素的制备方法及其在抗糖尿病药物中的应用

一、技术领域

本发明属于制药技术领域，涉及黄酮类化合物香蜂草苷及其苷元异樱花素的制备方法，并涉及香蜂草苷和异樱花素在制备预防和治疗糖尿病、糖尿病引起的脂代谢紊乱、冠心病、动脉粥样硬化等心脑血管疾病以及糖尿病周围血管病变的药物中的应用。

二、背景技术

糖尿病是由遗传和环境因素相互作用而引起的一组代谢异常综合征，以高血糖为特征，代谢紊乱为表现，与胰岛素分泌密切相关。糖尿病可分为胰岛素依赖型糖尿病(InsulinDependent Diabetes Mellitus，IDDM又称I型)和非胰岛素依赖型糖尿病(Noinsulin DependentDiabetes Mellitus，NIDDM又称II型)，后者约占患者总数的95％-99％。糖尿病目前已成为严重的世界公共卫生问题，发病率急速增长，成为继心脑血管疾病、恶性肿瘤之后第三位严重危害人类健康的慢性疾病。据《2007年版中国2型糖尿病防治指南》的数据表明，2007年全球有2.33亿糖尿病患者，预计到2025年全球将有3.80亿，增长72％，其中亚洲增长尤为迅速达91％。目前资料显示，我国20岁以上成人糖尿病的患病率已达到9.7％，位居世界第一。

糖尿病病人致死、致残率高的主要原因是糖尿病并发症，包括急性和慢性并发症两种。其中慢性并发症包括大血管病变(主要是动脉粥样硬化)和微血管病变，严重影响糖尿病患者生命和生活质量。其中心血管病变是糖尿病的主要死亡原因，约占糖尿病患者的80％。糖尿病的慢性高血糖、胰岛素抵抗和血脂代谢异常通过影响内皮细胞功能，最终导致血管损伤，使之易患动脉硬化和冠心病等心血管疾病。其中，内皮细胞损伤或内皮功能失调是糖尿病血管并发症的始动因素。因此，保护内皮细胞免受有害因素的损伤，维护其正常功能对预防糖尿病慢性血管并发症具有重要的意义。

血管内皮细胞在糖尿病血管并发症的生理病理过程中行使着重要的调节功能。研究证明血管内皮功能障碍是血管并发症的重要发生因素。高血糖可通过多种途径引起血管内皮细胞凋亡，导致血管内皮功能障碍。研究表明，长期的高血糖可能通过以下途径引起血管内皮细胞凋亡：(1)高糖引起的氧化应激和硝化应激；(2)线粒体依赖性和非依赖性凋亡；(3)MAPK介导的细胞凋亡；(4)p53介导的细胞凋亡；(5)高糖通过影响细胞周期进程导致细胞凋亡。高血糖环境诱导内皮细胞凋亡显著增加，最终导致血管内皮细胞受损。

血管内皮细胞是胰岛素的靶器官之一，胰岛素介导的血管舒张主要是通过增加内皮细胞产生和释放一氧化氮(NO)而起作用的。游离脂肪酸(FFA)通过抑制葡萄糖氧化、抑制肌糖原合成、促进糖异生、引起高胰岛素血症以及激活氧化应激过程导致胰岛素抵抗。循环血中游离脂肪酸升高后，内皮细胞胰岛素受体底物(IRS)-1酪氨酸磷酸化水平以及蛋白激酶B(Akt)(Ser473)磷酸化水平明显降低，同时，血清NO水平降低，血管内皮细胞中eNOS mRNA表达亦下降，eNOS活性降低。故认为高FFA血症通过抑制内皮细胞eNOS磷酸化水平及基因表达使内皮源性NO生成减少，从而导致代谢综合征内皮依赖性血管舒张功能受损，引起血管收缩痉挛、血小板被激活、白细胞附壁、平滑肌细胞增生和血管重塑等病理过程，最终导致动脉粥样硬化和冠心病等心血管疾病以及糖尿病周围血管病变。

目前，临床使用的抗糖尿病药物主要有胰岛素、二甲双胍、磺酰脲类、噻唑烷二酮类药物、α-葡糖苷酶抑制剂等。这些药物具有良好的疗效，但仍存在一些局限性。中药治疗糖尿病已经有了几千年的经验积累，且有着自己独特的优势：采用中药治疗糖尿病不仅仅是降低血糖，重在调理人体全面机能，整体恢复血管弹性，增加心、肝、肾、视网膜等组织营养性血流量，特别是中药能够克服化学合成药在降血糖的同时产生的副作用或诱发加重并发症的事实。因此，开发中药及天然药物作为预防和治疗糖尿病的药物具有广阔的发展前景。

近年来众多中外学者从天然药物中提取、分离出多种具有降低血糖作用的化合物，主要有黄酮类、多糖、皂苷、生物碱等，其中关于黄酮类化合物抗糖尿病的研究受到了极大的关注。黄酮类化合物抗糖尿病机制主要表现在以下几个方面：(1)保护胰岛β细胞免受损伤并促进胰岛β细胞再生，研究表明，黄酮类成分可通过抗氧化作用或抗炎作用保护胰岛β细胞免受损伤，促进破坏的胰岛β细胞再生而促进胰岛素的分泌；(2)类胰岛素作用；(3)α-葡萄糖苷酶抑制剂；(4)改善胰岛素抵抗，有些黄酮类物质可通过抗炎，抗氧化，调节脂肪因子，促进外周靶细胞、靶器官对葡萄糖的利用改善胰岛素抵抗。风轮菜为唇形科风轮菜属植物风轮菜(Clinopodium.chinense(Benth.)O.Kuntze)的全草。风轮菜微苦、涩，凉，归肝经。传统药学用于治疗子宫肌瘤出血、牙眼出血、尿血、创伤出血、感冒、中暑、急性胆囊炎、肝炎、肠炎、痢疾、乳腺炎、疔疮肿毒、过敏性皮炎等症状，在民间，风轮菜广泛用于治疗糖尿病。风轮菜含有黄酮类、有机酸类、芳香族类、三萜及其皂苷类、甾体类等多种类型的化学成分，其中黄酮类和三萜皂苷类成分为该属植物的主要活性成分。香蜂草苷是风轮菜黄酮的主要成分之一，属于二氢黄酮苷类。现代药理研究表明，香蜂草苷具有抗氧化，引起神经肿瘤细胞凋亡的作用，也可用于出血症的防治。但是，尚未有香蜂草苷和异樱花素(香蜂草苷的苷元)在降血糖、降血脂、改善游离脂肪酸所致的血管内皮细胞胰岛素抵抗和高糖所致的血管内皮细胞损伤的报道。

三、发明内容

本发明包括了两部分内容，第一部分：异樱花素和香蜂草苷的制备方法；第二部分：异樱花素和香蜂草苷在降血糖、降血脂、改善血管内皮细胞胰岛素抵抗和保护高糖对血管内皮细胞损伤的作用，及其在防治糖尿病、糖尿病引起的脂代谢紊乱、冠心病、动脉粥样硬化等心脑血管方面疾病以及糖尿病周围血管病变的应用。

本发明之所以用碱溶酸沉，乙酸乙酯萃取，再用大孔吸附树脂的方法富集香蜂草苷，是因为传统的乙酸乙酯萃取富集香蜂草苷的效果不理想，总浸膏直接用大孔树脂富集，柱填料用量太大，大大延长了生产时间。之后用聚酰胺柱层析分离得到香蜂草苷，是因为硅胶和凝胶Sephadex LH-20的分离效果不明显，且香蜂草苷属于二氢黄酮类，聚酰胺对它的死吸附量少，目标产物损失少。整个发明中，所用到的柱填料都可再生利用，而且再生方法简单，所用到的洗脱剂为乙醇水溶液，低成本，回收率高。此方法可适用于工业生产。

香蜂草苷和异樱花素的制备方法如下：

(1)将风轮菜全草干燥粉碎；用8-10倍量80％乙醇回流提取，或浸渍提取，提取液减压浓缩；

(2)将浓缩的提取物用1％NaOH水溶液溶解，后用5％HCl调pH为5，再用乙酸乙酯萃取8-10次，得到乙酸乙酯浸膏。

(3)乙酸乙酯提取物进行大孔树脂柱层析，先用30％乙醇除去部分杂质，再用50％乙醇和95％乙醇洗脱。收集50％乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥得到香蜂草苷粗品。

(4)香蜂草苷粗品进行聚酰胺柱层析，收集15％乙醇洗脱液，减压浓缩，重结晶得香蜂草苷。

(5)将步骤(3)中的95％的乙醇洗脱液减压浓缩，干燥，进行硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯(5：1)洗脱，浓缩，干燥得到异樱花素粗品。

(6)异樱花素粗品进行凝胶柱层析，二氯甲烷-甲醇(1：1)为洗脱剂，收集洗脱液，减压浓缩，重结晶得异樱花素。

(7)步骤(3)中大孔树脂可选用CAD-40和D101中任意一种，洗脱剂也可用60％乙醇水。

(8)步骤(5)中也可用石油醚：丙酮(10：1)洗脱。

香蜂草苷，白色粉末(氯仿-甲醇)，C₂₈H₃₄O₁₄，mp209～210℃，溶于氯仿-甲醇、甲醇、DMSO。Molish反应和盐酸镁粉反应均呈阳性，提示该化合物为黄酮苷类化合物。¹HNMR(500MHz，DMSO-d₆，TMS)δ：12.00(1H，s，5-OH)，7.46(2H，d，J＝8.7Hz，H-2'，6’)，6.98(2H，d，J＝8.7Hz，H-3’，5’)，6.13(2H，d，J＝1.1Hz，H-6，8)，5.58(1H，dd，J＝2.8Hz，12.5Hz，H-2)，2.79(1H，dd，J＝3.0Hz，17.0Hz，H-3a)，4.97(1H，d，J＝7.5Hz，G-1)，4.52(1H，s，Rha-1)，3.77(3H，s，4'-OMe)，1.09(3H，d，J＝6.2Hz，Rha-Me)，3.10～4，98为糖区质子信号，H-3e信号(3.10左右)淹没在糖区质子信号中。以上数据与文献报道的香蜂草苷理化性质与光谱数据基本一致，故鉴定为香蜂草苷(Didymin)。其结构如下图所示：

异樱花素，白色针晶(氯仿-甲醇)，C₁₆H₁₄O₅，mp160～163℃，溶于氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、DMSO。紫外灯365nm下显绿色荧光，盐酸镁粉反应呈阳性，浓硫酸-香草醛反应显橙红色。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆，TMS)δ：12.12(1H，s，5-OH)，10.76(1H，s，7-OH)，7.43(2H，d，J＝8.5Hz，H-2'，6’)，6.97(2H，d，J＝8.5Hz，H-3’，5’)，5.89(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，5.88(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，5.51(1H，dd，J＝3.0Hz，12.6Hz，H-2)，3.77(3H，s，4’-OMe)，3.26(1H，dd，J＝12.7Hz，17.0Hz，H-3a)，2.72(1H，dd，J＝3.0Hz，17.0Hz，H-3e)。以上数据与文献报道的异樱花素理化性质与光谱数据基本一致，故鉴定为异樱花素(Isosakuranetin)。其结构如下图所示：

本发明所述香蜂草苷和异樱花素可与常规辅助剂和/或赋型剂混合，制备成各种剂型，用于预防或治疗。针剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂、溶液剂等都为可供选择的药物剂型。胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂、溶液剂等剂型可以用已知的常规方法制备。

胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂等剂型可以含有一种或多种常用赋型剂-填料和增溶剂：如淀粉，微晶纤维等；粘合剂：如羧甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮等；致湿剂：如甘油；崩解剂：如碳酸钙等；吸收剂：如高岭土等；润滑剂：如滑石粉等。

药用赋型剂可以是固体、半固体、液体等各种形态的，配方辅助剂可以是各种类型的。

溶液剂可以含有一般的溶剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂等，如水、乙醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸苄酯等。

2、异樱花素和香蜂草苷降血糖和血脂、改善血管内皮胰岛素抵抗和保护血管内皮细胞活性2.1异樱花素和香蜂草苷降血糖、降血脂作用

随机取出10只小鼠作为正常组，其余小鼠禁食14-16h后，尾静脉注射四氧嘧啶62mg/kg，72h后眼眶后静脉丛取血，分离血清，测血糖，选空腹血糖＞11.5mmol/L的小鼠随机分为6组，分别按10mL/kg体重经口给予香蜂草苷50、100mg/kg，异樱花素50、100mg/kg，二甲双胍180mg/kg以及等体积的0.2％CMC-Na，每日一次，连续给药20天。第10天给药后1.5h(禁食6h)，小鼠眼眶后静脉丛取血，分离血清，以试剂盒方法测定血糖。第20天末次给药后1.5h(禁食6h)，小鼠摘眼球取血，分离血清，以试剂盒方法测定血糖、糖化血清蛋白(GSP)、总胆固醇(TC)含量。

血糖实验结果如图1所示，与正常组比较，模型组四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖极显著升高(P＜0.01)。与模型组比较，异樱花素100mg/kg，香蜂草苷50mg/kg和二甲双胍180mg/kg均可极明显降低第10天糖尿病小鼠血糖(P＜0.01)；香蜂草苷50mg/kg组明显降低第20天糖尿病小鼠的血糖(P＜0.05)，异樱花素100mg/kg，香蜂草苷100mg/kg和二甲双胍180mg/kg组均可极明显降低第20天糖尿病小鼠的血糖(P＜0.01)。

GSP实验结果如图2所示，与正常组相比，四氧嘧啶糖尿病小鼠的血清GSP含量极明显升高(P＜0.01)。与模型组相比，异樱花素100mg/kg和香蜂草苷50，100mg/kg均明显地降低糖尿病小鼠的血清GSP含量(P＜0.05)，二甲双胍180mg/kg组极明显地降低糖尿病小鼠的血清GSP含量(P＜0.01)。

TC实验结果如图3所示，与正常组相比，四氧嘧啶糖尿病小鼠血清TC含量明显升高(P＜0.05)。与模型组相比，异樱花素100mg/kg，香蜂草苷100mg/kg和二甲双胍180mg/kg剂量组均明显地降低糖尿病小鼠的血清TC含量(P＜0.05)。

2.2异樱花素和香蜂草苷对高糖损伤内皮细胞的保护作用

取对数生长期的HUVEC细胞，消化成单细胞悬液，10％FBS的DMEM培养基重悬，接种于96孔细胞培养板(1×10⁴个细胞/孔)，培养24h后更换培养基，将细胞分组，每组3个复孔。正常组为HUVEC细胞的自然培养，模型组为HUVEC与33mmol/L葡萄糖共培养，药物组为异樱花素(3、10、30μM)和香蜂草苷(3、10、30μM)与HUVEC及33mmol/L葡萄糖共培养，培养72h后，加入含0.5％MTT的培养基20μl，37℃孵育4h后，弃培养液，每孔加入150μLDMSO，振荡，待结晶完全溶解后，在酶标仪上于490nm波长处测定OD值。实验重复3次。

结果如图4所示，与正常组相比，模型组的细胞存活率极明显降低(P＜0.01)。与模型组相比，异樱花素3μM组的细胞存活率明显升高(P＜0.05)，异樱花素(10、30μM)，香蜂草苷(10、30μM)的细胞存活率极明显升高(P＜0.01)。可见，异樱花素和香蜂草苷均可以明显改善高糖对内皮细胞的损伤。

2.3异樱花素和香蜂草苷对棕榈酸(Palmitic acid，PA)所致血管内皮细胞NO生成的影响取对数生长期HUVEC消化成单细胞悬液接种于96孔细胞培养板(1×10⁴cell/well)，37℃，5％CO₂条件下培养24h后，更换为无血清DMEM培养基，继续培养24h，弃上清，用磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)洗3次，每孔加入5μM4-Amino，5-aminomethyl-2’，7’difluorescein，diacetate(DAF-FM DA，NO荧光探针)100μl，37℃细胞培养箱内孵育30min，用PBS洗三次，以充分去除未进入细胞内的DAF-FM DA。之后，各孔以PBS代替无血清培养基继续培养，实验分组为：

1)正常组：为HUVEC的自然培养；

2)正常/胰岛素对照组：先为HUVEC的自然培养，之后与胰岛素0.1μM共培养15min；

3)模型组：HUVEC与PA100μM共培养3h；再与胰岛素0.1μM共培养15min；

4)异樱花素组：异樱花素10，30μM与HUVEC共培养30min后，与PA100μM继续培养3h；再与胰岛素0.1μM共培养15min；

5)香蜂草苷组：香蜂草苷10，30μM与HUVEC共培养30min后，与PA100μM继续培养3h；再与胰岛素0.1μM共培养15min；

6)水杨酸钠组：水杨酸钠500μM与HUVEC共培养30min后，与PA100μM继续培养3h；再与胰岛素0.1μM共培养15min。

正常组除外，各组胰岛素处理完毕后，立即于荧光倒置显微镜(Olympus，I×51S8F-3)下观察NO释放情况并摄片。激发光波长495nm，发射光波长515nm。实验重复3次，每次3个复孔。

实验结果如图5所示，与正常组相比，正常/胰岛素组的荧光强度明显增强，表明内皮细胞NO生成明显增多，模型组的荧光强度明显减弱，提示PA损伤内皮细胞，致使NO生成明显减少。与模型组相比，异樱花素(10，30μM)、香蜂草苷(10，30μM)及水杨酸钠(500μM)的荧光强度明显增强，表明各药物组均能明显增加内皮细胞NO生成，提示异樱花素和香蜂草苷及水杨酸均能改善游离脂肪酸所致的胰岛素抵抗和保护血管内皮细胞作用。

本发明所述，异樱花素和香蜂草苷具有降血糖，降血脂，改善游离脂肪酸所致的血管内皮细胞胰岛素抵抗和高糖对血管内皮细胞的损伤的作用，可用于制备预防和治疗糖尿病、糖尿病引起的脂代谢紊乱、冠心病、动脉粥样硬化等心脑血管疾病以及糖尿病周围血管病变。

四、附图说明

图1异樱花素和香蜂草苷对四氧嘧啶糖尿病小鼠空腹血糖的影响

随机取出10只小鼠作为正常组，其余小鼠禁食14-16h后，尾静脉注射四氧嘧啶62mg/kg，72h后眼眶后静脉丛取血，测血糖，选空腹血糖＞11.5mmol/L的小鼠随机分为6组，分别为模型组，香蜂草苷50、100mg/kg，异樱花素50、100mg/kg，二甲双胍180mg/kg组。每日一次灌胃给药，连续给药20天。第10天给药后1.5h(禁食6h)，小鼠眼眶后静脉丛取血，以试剂盒方法测定血清空腹血糖。第20天末次给药后1.5h(禁食6h)，小鼠摘眼球取血，分离血清，以试剂盒方法测定血糖，结果以

表示。^##P＜0.01vs正常组；^*P＜0.05，^**P＜0.01vs模型组(Student's-t test).

图2异樱花素和香蜂草苷对四氧嘧啶糖尿病小鼠血清GSP的影响

随机取出10只小鼠作为正常组，其余小鼠禁食14-16h后，尾静脉注射四氧嘧啶62mg/kg，72h后眼眶后静脉丛取血，测血糖，选空腹血糖＞11.5mmol/L的小鼠随机分为6组，分别为模型组，香蜂草苷50、100mg/kg，异樱花素50、100mg/kg，二甲双胍180mg/kg组。每日一次灌胃给药，连续给药20天。第20天末次给药后1.5h(禁食6h)，小鼠摘眼球取血，分离血清，以试剂盒方法测定血清GSP，结果以表示。^##P＜0.01vs正常组；^*P＜0.05，^**P＜0.01vs模型组(Student's-t test).

图3异樱花素和香蜂草苷对四氧嘧啶糖尿病小鼠血清TC的影响

随机取出10只小鼠作为正常组，其余小鼠禁食14-16h后，尾静脉注射四氧嘧啶62mg/kg，72h后眼眶后静脉丛取血，测血糖，选空腹血糖＞11.5mmol/L的小鼠随机分为6组，分别为模型组，香蜂草苷50、100mg/kg，异樱花素50、100mg/kg，二甲双胍180mg/kg组。每日一次灌胃给药，连续给药20天。第20天末次给药后1.5h(禁食6h)，小鼠摘眼球取血，分离血清，以试剂盒方法测定血清TC，结果以表示。^#P＜0.05vs正常组；^*P＜0.05vs模型组(Student's-t test).

图4异樱花素和香蜂草苷对高糖损伤内皮细胞的保护作用

HUVEC单细胞悬液(1×10⁴个/孔)接种于96孔细胞培养板，培养24h后更换培养基，将细胞分组：正常组为HUVEC的自然培养，模型组为HUVEC与33mmol/L葡萄糖共培养，药物组为异樱花素(3、10、30μM)和香蜂草苷(3、10、30μM)与HUVEC及33mmol/L葡萄糖共培养，培养72h后，加入含0.5％MTT的培养基20μl，再培养4h后，弃培养液，加入150μl DMSO，振荡，待结晶完全溶解后，测定OD值。图中数据为3次实验的平均值，每次实验为3复孔。结果以

表示。^##P＜0.01vs正常组；^*P＜0.05，^**P＜0.01vs模型组(Student's-t test).

图5异樱花素和香蜂草苷对PA所致内皮细胞NO生成的影响

对数生长期HUVEC消化成单细胞悬液(1×10⁴个/孔)接种于96孔细胞培养板，培养24h后更换为无血清RPMI1640培养基，继续培养24h，弃上清，用PBS洗3次，每孔加入5μMDAF-FM DA100μl，37℃孵育20min，用PBS洗三次，之后，各孔以PBS代替无血清培养基继续培养，将实验分组为：正常组为HUVEC的自然培养，正常/胰岛素对照组为HUVEC的自然培养后与胰岛素0.1μM共培养15min，模型组为HUVEC与100μM PA共培养3h，之后与胰岛素0.1μM共培养15min，药物组为异樱花素10，30μM、香蜂草苷10，30μM以及水杨酸钠500μM分别与HUVEC共培养30min，之后与PA100μM共培养3h，再与胰岛素0.1μM共培养15min。正常组除外，各组胰岛素处理完毕后，立即于荧光倒置显微镜下观察NO生成情况并摄片。激发光波长495nm，发射光波长515nm。

五、具体实施方式

下面结合实例对本发明进行详细描述。但是，本发明不局限于所给出的这些实例。

实施例1：香蜂草苷和异樱花素的制备

取12kg干燥风轮菜全草，剪碎，加10倍量的80％的乙醇溶液浸泡过夜后，回流提取3次，过滤，得到提取液，减压浓缩得浸膏。再用5倍量1％NaOH水溶液溶解，加热半小时，放置冷却后，再用5％HCl调pH至5，再用2倍量的乙酸乙酯萃取8次，浓缩，得到乙酸乙酯浸膏。再用适量20％乙醇溶解，进行CAD-40大孔树脂柱层析，先用30％乙醇洗脱4-5BV(柱体积)，再用50％乙醇洗脱7-8BV，最后用95％乙醇洗脱。收集50％和95％乙醇洗脱液，其50％乙醇的洗脱液减压浓缩，干燥得到香蜂草苷粗品。香蜂草苷粗品用乙醇水溶解，进行聚酰胺柱层析，收集15％乙醇洗脱液，减压浓缩，重结晶，得到香蜂草苷，得率为1.6％。

上述的95％乙醇洗脱液减压浓缩，干燥，进行硅胶柱层析。收集石油醚-乙酸乙酯(5：1)洗脱液，减压浓缩干燥得到异樱花素粗品。将粗品用二氯甲烷-甲醇(1：1)溶解，进行凝胶Sephadex LH-20柱层析，用二氯甲烷-甲醇(1：1)作为洗脱液，硅胶TLC追踪，合并含有异樱花素的流分，减压浓缩，重结晶得异樱花素，得率为0.5％。

实施例2：香蜂草苷和异樱花素的制备

取12kg干燥风轮菜全草，剪碎，加8倍量的75％的乙醇溶液浸泡过夜后，回流提取3次，过滤，得到提取液，减压浓缩。再用5倍量1％NaOH溶液溶解，加热半小时，放置冷却后，再用5％HCl调pH至5，再用2倍量的乙酸乙酯萃取10次，得到乙酸乙酯浸膏。再用适量30％乙醇溶解，进行D101大孔树脂柱层析，先用30％乙醇洗脱4-5BV(柱体积)，再用60％乙醇洗脱7-8BV，最后用95％乙醇洗脱。收集60％，95％乙醇洗脱液。60％乙醇的洗脱液减压浓缩，干燥得到香蜂草苷粗品。粗品用乙醇水溶解，进行聚酰胺柱层析，收集15％乙醇洗脱液，减压浓缩，重结晶，得香蜂草苷，得率为1.5％。

95％乙醇洗脱液减压浓缩，进行硅胶柱层析。收集石油醚-丙酮(10：1)洗脱液，浓缩，干燥得到异樱花素粗品。将粗品用二氯甲烷-甲醇(1：1)溶解，进行凝胶Sephadex LH-20柱层析，用二氯甲烷-甲醇(1：1)作为洗脱液，硅胶TLC追踪，合并含有异樱花素的流分，减压浓缩，重结晶得异樱花素，得率为0.55％。

实施例3：制备片剂

取香蜂草苷5g，微晶纤维素24.6g，硬脂酸镁0.4g，研磨混合10-30分钟，至均匀，将混匀的药粉用单冲压片机压成直径6mm，重300mg的片剂，每片含香蜂草苷50mg。

取异樱花素5g，微晶纤维素24.6g，硬脂酸镁0.4g，研磨混合10-30分钟，至均匀，将混匀的药粉用单冲压片机压成直径6mm，重300mg的片剂，每片含异樱花素50mg。

实施例4：制备胶囊剂

取香蜂草苷5g，微晶纤维素25g，研磨混合10-30分钟，至均匀，将混匀的药粉灌装于1号胶囊中，制100粒，每粒含香蜂草苷50mg。

取异樱花素5g，微晶纤维素25g，研磨混合10-30分钟，至均匀，将混匀的药粉灌装于1号胶囊中，制100粒，每粒含异樱花素50mg。

Claims (5)

1.香蜂草苷和异樱花素在制备预防和治疗糖尿病、糖尿病引起的脂代谢紊乱、冠心病、动脉粥样硬化等心脑血管疾病以及糖尿病周围血管病变的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用中香蜂草苷和异樱花素通过降低血糖、降血脂，改善游离脂肪酸所致的胰岛素抵抗和高糖所致的血管内皮细胞损伤来发挥作用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于其中的香蜂草苷和异樱花素的制备方法是：

(1)将风轮菜全草干燥粉碎；用8-10倍量80％乙醇回流提取，或浸渍提取，提取液减压浓缩；

(2)将浓缩的提取物用1％NaOH溶解，后用5％HCl调pH为5，再用乙酸乙酯萃取8-10次，得到乙酸乙酯浸膏；

(3)乙酸乙酯提取物进行大孔树脂柱层析，先用30％乙醇除去部分杂质，再用50％、95％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥得到香蜂草苷粗品；

(4)香蜂草苷粗品进行聚酰胺柱层析，收集15％乙醇洗脱液，减压浓缩，重结晶得香蜂草苷；

(5)将步骤(3)中的95％的乙醇洗脱液减压浓缩，干燥，进行硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯(5：1)洗脱，浓缩，干燥得到异樱花素粗品；

(6)异樱花素粗品进行凝胶柱层析，二氯甲烷-甲醇(1：1)为洗脱剂，收集洗脱液，减压浓缩，重结晶得异樱花素；

(7)步骤(3)中大孔树脂可选用CAD-40和D101中任意一种，洗脱剂也可用60％乙醇水；

(8)步骤(5)中也可用石油醚：丙酮(10：1)洗脱。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述香蜂草苷、异樱花素与一种或多种辅助剂和/或赋形剂混合制成药学上可以接受的剂型。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于剂型为针剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂或溶液剂。

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