CN101543505A

CN101543505A - 一种预防和治疗阿尔茨海默氏症的药物及其制备方法

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Publication number: CN101543505A
Application number: CN200910138163A
Authority: CN
Inventors: 詹华强; 董婷霞
Original assignee: Hong Kong University of Science and Technology HKUST
Current assignee: Hong Kong University of Science and Technology HKUST
Priority date: 2009-04-29
Filing date: 2009-04-29
Publication date: 2009-09-30
Also published as: CN102365089B; CN102365089A; WO2010124623A1

Abstract

本发明公开了一种预防和治疗阿尔茨海默氏症的药物，其有效成分为从原料药三七中提取的槲皮素－3－O－β－D－吡喃木糖基(1→2)－β－D－吡喃半乳糖苷。本发明的药物的有效成分RNFG，具有雌激素活性、抗氧化活性、抑制Aβ聚集和毒性的神经保护作用，可以减少东莨菪碱引起的记忆损伤，可以用来制备能够预防和治疗AD的药物和保健品，提取用原料药材常见，获取容易。

Description

一种预防和治疗阿尔茨海默氏症的药物及其制备方法

技术领域

本发明属于医药和保健技术领域，尤其是涉及用于预防和治疗阿尔茨海默氏症的药物及其制备方法。

背景技术

阿尔茨海默氏症(AD)，是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，痴呆是其最突出的精神症状。由于该病的病因及发病机制尚未明了，普遍认同和活性氧的增多，淀粉样蛋白沉积对于神经细胞的损伤有关。临床上，目前仍缺乏特效的病因治疗方法，预防及早期发现AD就更为重要。而在中晚期，则是以护理为主。许多药物在改善AD患者的记忆能力、认知功能及延缓衰老等方面具有良好的作用，例如：1、乙酰胆碱酯(AChE)抑制剂，这也是美国FDA认证的最广泛和最有效的一类药物；2、改善脑血液循环和脑细胞代谢的药物；3、钙离子拮抗；4、非甾体抗炎药物；5、自由基消除剂和抗氧化剂；6、激素类药物等。近年来，研究认为使用雌激素可以缓解患有AD妇女的症状，并可能延缓或防止患者病情的发展。雌激素的这方面作用与其抗氧化、减少淀粉样蛋白沉积对细胞的损伤、促进神经元的修复、防止神经细胞死亡等有关。雌激素对更年期综合症和AD的综合治疗，将二者紧密结合，为治疗老年性疾病带来了新的启示。与上述情况相似，虽然雌激素能有效地延缓和防止AD的发生，但是大量合成雌激素有诱发癌症(乳腺癌)的可能。因此，服用雌激素时，必须经常检查体内激素水平，以防过多的雌激素诱发癌症，这为雌激素应用于AD带来了很大的局限。

黄酮类化合物，又称植物激素，被认为中药的重要活性成分之一，广泛存在于食物，植物中，长期应用于临床治疗和食疗。黄酮类化合物在化学结构上与雌激素相似，与雌激素受体结合，激活雌激素传导通路，产生雌激素效应。经过多年的体外体内研究，黄酮类成分至今未发现有明显的副作用，并且越来越多应用于临床作为雌激素替代品的首选。此外，黄酮类化合物是自然界中抗氧化作用最强的天然产物之一，具有很强的抑制活性氧，清除自由基的神经保护作用。因此，经过科学方法筛选出的既有效又无副作用的植物激素黄酮类成分用于防治AD，开发成具有治疗作用药物或者保健食品，将是今后几年的研究目标和热点。并越来越受到人们的关注。

著名中药三七(Panax notoginseng)，又称田七、人参三七、金不换，为五加科植物三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)的干燥根，性温，味甘、微苦，传统上用于止血活血，散瘀止血，消肿定痛，治疗各种内、外出血，胸腹刺痛，跌扑肿痛。三七的临床建议剂量为5-10克。虽然三七制品的使用量十分巨大但却很少报道有副作用，是相对安全的中药之一。现代药理学研究发现三七具有抗心律失常、抗心肌损伤、抗动脉粥样硬化、抗休克、降血压、耐缺氧的作用。对中枢神经系统具有脑损伤保护、改善脑梗塞症状、耐缺氧、改善记忆、镇静和镇痛作用。此外，三七还具有抗炎、免疫调节、抗氧化、延缓衰老、抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、减少血脂和胆固醇等作用。虽然上述的特点普遍已知，三七对于在神经系统的应用在中医中药阐述很少，只作为一些治疗偏头痛和机体损伤的中药方剂。三七的主要化学成分有皂苷、黄酮、挥发油、氨基酸、多糖、淀粉、蛋白质等。皂苷是三七最主要有效活性成分，占含量的12％，可以抑制血小板凝集，抗血栓和抗凝血，增加脑血流量，提高机体耐缺氧，抗肿瘤，研究系统详细。作为三七的第二大有效活性成分，黄酮对于降压、增加冠脉流量、抗病毒有一定的作用，但是未见其活性成分的分离鉴定和药理作用报道，特别是与雌激素和神经保护作用相关的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于预防和治疗阿尔茨海默氏症的药物和保健食品及其制备方法，该药物的有效成分具有雌激素活性、抗氧化活性、抑制Aβ聚集和毒性的神经保护作用，可以减少东莨菪碱引起的记忆损伤，可以用来制备能够预防和治疗AD的药物和保健品。

本发明的目的是通过以下具体技术方案完成的，一种预防和治疗阿尔茨海默氏症的药物，其有效成分为从原料药三七中提取的槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷。

作为一种优化方案，该药物还包含辅料，可制成临床接受的片剂、口服液、针剂、胶囊剂。

本发明的一种预防和治疗阿尔茨海默氏症的药物和保健品的制备方法，取三七原药材粉碎，过200目筛，用70％乙醇提取，浓缩，经过聚酰胺柱，依次以水、30％乙醇和50％乙醇洗脱，30％乙醇洗脱部分溶于甲醇，作为粗黄酮部分，粗黄酮进一步经过葡聚糖LH-20柱层析，由甲醇洗脱，洗脱部分再经过RP-C18柱分离，以甲醇-水梯度(30％，35％，40％.45％，50％)洗脱，30％和35％洗脱部分经过TLC检测，得到槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷。

槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷在预防和治疗阿尔茨海默氏症的保健品中的应用。

本发明的药物和保健品的有效成分为槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷，具有雌激素活性、抗氧化活性、抑制Aβ聚集和毒性的神经保护作用，可以减少东莨菪碱引起的记忆损伤，可以用来制备能够预防和治疗AD的药物和保健品，提取用原料药材常见，获取容易。

附图说明

附图1为本发明有效成分RNFG的化学结构；

附图2为本发明有效成分RNFG和药材的HPLC谱图；

附图3为本发明有效成分RNFG的雌激素活性示意图；

附图4为本发明有效成分RNFG抑制活性氧生成的抗氧化作用效果对比图；

附图5为本发明有效成分RNPG抑制Aβ聚集的神经保护作用效果对比图；

附图6为本发明有效成分RNPG抑制Aβ细胞毒性的神经保护作用效果对比图；

附图7为本发明有效成分RNPG抑制Aβ诱导的神经细胞凋亡效果对比图；

附图8为本发明有效成分RNPG抑制Aβ诱导的钙离子内流效果对比图；

附图9为本发明有效成分RNPG和结构类似神经保护作用的效果对比图；

附图10为本发明有效成分RNPG对于东莨菪碱致大鼠记忆损伤的改善作用效果对比图。

具体实施方式

本发明的目的是要开发和利用至今为止用途尚不大广泛，研究很少的三七黄酮类成分。通过对三七黄酮类化学成分进行深入细致研究，首次分离、鉴定了三七根中的主要黄酮类化合物RNFG，进一步发明了RNFG具有雌激素活性、抗氧化活性、抑制Aβ聚集和毒性的神经保护作用，并且阐述了其神经保护机理是抑制Aβ引起的钙离子内流和细胞凋亡。在动物模型中，RNFG可以减少东莨菪碱引起的记忆损伤，进一步明确了其神经保护作用，可以用来制备能够预防和治疗AD的药物和保健品。为进一步充分说明本发明的有益效果，现通过以下实验例来说明。

实施例1：RNFG的分离鉴定

三七收集于云南省文山，自然晾干，经过生药鉴定，样本凭证保存于香港科技大学生物学系。美国人参、韩国人参购买于香港市场。

原药材三七1公斤粉碎，过200目筛，70％乙醇提取(2次，每次3升)。乙醇溶液真空浓缩，浓缩物用500毫升水加热溶解，离心15min，取上清液，经聚酰胺柱，依次以水、30％乙醇和50％乙醇洗脱，30％乙醇洗脱部分溶于100毫升甲醇，作为粗黄酮部分。粗黄酮进一步经过葡聚糖LH-20柱层析，由甲醇洗脱。再经过RP-C18柱分离，以甲醇-水(30％，35％，40％.45％，50％)梯度洗脱，30％和35％洗脱部分经过TLC检测，得到单体黄酮化合物，即本发明药物的有效成分槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(RNFG)其结构见附图1。

RNFG为首次从三七中分离得到，纯度大于98％，约占总黄酮含量的60％，是三七中总黄酮中含量最大的化合物。经过水解，经过HPTLC分析，结果显示糖的存在，并且有Rf值差异。具体结构鉴定如下：

RNFG为黄色粉末，熔点173-175℃，紫外灯下显示黄色荧光。易溶于甲醇、乙醇和水，难溶于氯仿、乙酸乙酯。HCl-Mg反应阳性，AlCl₃反应阳性，Molish反应阳性，显示此化合物可能为黄酮苷类。¹H NMR(DMSO-d6)数据显示(表1)δ 6.1(1H，s)与δ 6.3(1H，s)两个单度芳香氢信号，分别归属于H-6和H-8，δ 6.8(1H，d，J＝8.5Hz)，δ7.51(1H，d，J＝2.0Hz，)，δ7.70(1H，dd，J＝8.5，2.0Hz)分别归属于H-5’，H-2’，H-6’，¹³C NMR(DMSO-d₆)谱(表1)给出26个碳信号，δ 59-81ppm给出9个C信号，其中δ 59.9ppm为CH₂信号，δ 98.3ppm与δ 104.5ppm两个糖的端基碳信号，提示化合物含六碳糖和五碳糖。苷元有15个碳，δ ppm177.0为典型的黄酮羰基碳信号，δ ppm164.0，161.1，156.3，154.9，148.9，145.0，132.8，120.9，103.1皆为季碳信号，分别归属为C-7，C-5，C-2，C-9，C-4’，C-3’，C-3，C-1’，C-10信号，δppm122.1，115.5，115.1，99.1，93.6皆为CH信号，分别归属为C-6’，C-5’，C-2’，C-6，C-8信号。RNFG水解后沉淀经过HPTLC鉴定，其Rf值与槲皮素Rf值一致，糖部分经HPTLC与PC鉴定，其Rf值与半乳糖和木糖一致。由此黄酮母核结构为槲皮素。因为C-2向低场位移，说明槲皮素C-3位成苷。因为端基糖质子信号的偶合常数均为J＝7.0Hz，证明半乳糖和木糖皆为β-D构型。半乳糖的C-2’’的位移值由71左右向低场移动到79.7，HMBC谱图中，C-1”(δ 104.5)与H-2”(δ 3.74)有远程相关，所以证明糖的连接顺序为半乳糖(2→1)木糖。ESI-MS中给出619(M+Na)⁺的峰，证明分子量为596，符合C₂₆H₂₈O₁₆的分子式，另外碎片469(M+Na-xy1-H₂O)，进一步证明木糖(xy1)处于糖链的外侧。综上所述，RNFG为槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷。

表1RNFG的¹³C NMR与¹H NMR数据值(δ ppm，DMSO-d6)

经过紫外光248nm检测(Beckman DUR 650)，HPLC检测纯度大于98％。HPLC系统(Waters(Milford，MA)600pump，717auto-sampler and UV/VISPhotodiode Array 2996 Detector)，C18反向柱(Nova-Pak HR C18(6μm，7.8X300mm))，流动向乙腈-水-甲酸(12：88：0.1)，流速1ml/min，最大吸光强度348nm，保留时间18min。分离到的化合物经过鉴定，对比波谱数据(紫外、红外、核磁、质谱)，分子式为C₂₆H₂₈O₁₆，被命名为槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(RNFG)。经过水解，样品30毫克在10％盐酸的50％乙醇(5毫升)回流5个小时，反应溶液由水稀释，并且用硝酸银中和。中和过的水层过滤，然后经过HPTLC分析，结果显示糖的存在，并且有Rf值差异，经过与标准品比较，确定为木糖和半乳糖。RNFG为首次从三七中分离得到，纯度大于98％，是黄酮中含量最大的化合物，约占总黄酮含量的60％。从1公斤三七药材中，约有0.68±0.05g(n＝5)的RNFG可以获得。参见附图2，与韩国人参(Panax ginseng C.A.Meyer)和美国人参(Panax quinquefollius L.)的化学成分比较，RNFG是三七中的特有成分。

实验例2：RNFG的雌激素活性的验证

1.细胞培养条件

MCF-7(含有ERE基因)或者MCF-7细胞培养在MEM培养基，含10％胎牛血清、青酶素100U/ml、庆大酶素100ug/ml、1mM氨基酸和0.1mM丙酮酸钠，培养箱温度37℃，含5％ CO₂空气和饱和湿度。实验之前3天将培养基改变为无酚红MEMα培养基，含2％活性炭/葡聚糖处理的胎牛血清，其它条件同上。

2.雌激素水平测定

(1)雌激素反应元-萤光素酶活性测定(ERE-luciferase)

将MCF-7细胞(含有ERE基因)种在24孔板上，每孔细胞密度约5 x 10⁴个细胞，过夜让细胞贴壁，从第二天开始加药RNFG(1-100μM)，每24小时加药一次，每次加药之前更换培养液。加药二次后取细胞溶解液，样品进行萤光素酶活性测定(Fluostar Optima，BMG Labtechnology)，实验资料以三次实验的平均值，每次平行做三个孔。对照结果参见附图3，RNFG可以增加雌激素反应元表达的雌激素活性，并呈剂量依赖性，雌二醇(E2)为阳性对照。

(2)雌激素受体磷酸化水平测定(丝氨酸S118，P-ERα)

将MCF-7细胞种在24孔板上，每孔细胞密度约5 x 10⁴个细胞，过夜让细胞贴壁，第二天给药前3个小时，培养基改变为无胎牛血清无酚红MEMα培养基，加药后不同时间收集细胞溶解液，进行Western Blot测定，实验资料以三次实验的平均值。对照结果参见附图3，RNFG通过促进雌激素受体磷酸化(P-ERα)，促进雌激素转录而实现其雌激素活性，并呈时间依赖性，雌二醇(E2)为阳性对照。

实验例3：RNFG的神经保护作用

1.细胞培养条件

PC12细胞培养在DMEM培养基，含6％胎牛血清、含6％马血清、青酶素100U/ml、庆大酶素100ug/ml，培养箱温度37℃，含7.5％CO₂空气和一定的湿度。原代培养的皮层神经细胞通过解剖大鼠胚胎(18天)的大脑皮层获得，大脑皮层细胞培养在neural basal培养基，含B27和0.5mM的GlutaMAX大于两周，培养箱温度37℃，含5％CO₂空气和饱和湿度。

2.活性氧(ROS)测定

PC-12细胞种在96孔板上，每孔细胞密度约5 x 10⁴个细胞，过夜让细胞贴壁，第二天开始加药物RNFG(1-100μM)，加药之前更换培养液。加药后24小时，加入DCFH-DA进行荧光标记1小时37℃，再加入H₂O₂(400μM)1小时，进行荧光测定。实验资料以三次实验的平均值，每次平行做三个孔。对照结果参见附图4，RNFG可以在神经细胞PC12中抑制H₂O₂诱导的ROS的增加，并呈剂量依赖性，VitC为阳性对照。

3.β淀粉样蛋白(Aβ)聚集测定

将Aβ(1-40)10μM与药物RNFG(1-100μM)溶解于水中，37℃温育4天。利用荧光试剂ThT(5μM)测定Aβ的聚集程度(SPECTRA

GEMINI XS)。对照结果参见附图5，10μM Aβ(1-40)，37℃温育4天可以发生聚集。RNFG可以抑制Aβ的聚集，并呈剂量依赖性，刚果红为阳性对照。

4.Aβ细胞毒性测定

PC-12和脑皮层细胞种在96孔板上，每孔细胞密度约5 x 10³和3 x 10⁴个，加药之前更换培养液，加药后48和72小时加入Aβ(0-100μM)，24小时后取样，样品进行MTT测定和培养基LDH含量测定。每孔加0.1mg MTT，37℃培养1小时，每孔加150ul DMSO溶解形成的呋喃结晶，在570nm用Opsys MicroplateReader(Thermo Labsystems，MA，USA)测定光密度。收集培养基离心后的上层，加入LDH反应试剂(Roche，Mannheim，Germany)，室温20分钟，测定光密度。实验资料以三次实验的平均值，每次平行做三个孔。对照结果参见附图6，PC12细胞和脑皮层细胞中，10-100μMAβ可以通过减少神经细胞的生长力和增加LDH的释放，具有神经毒性。RNFG可以抑制Aβ在神经细胞PC12和脑皮层细胞的毒性，并呈剂量依赖性，NGF为阳性对照。

实验例4：RNFG的神经保护机理

1.细胞凋亡：

DNA降解和内源性核酸内切酶(Caspase-3)的活化是细胞凋亡的重要生化指标。培养2周左右的大鼠脑皮层神经细胞经过RNFG(100μM)给药24个小时，加入Aβ(10μM)24小时后，溶解细胞，离心，收集上清液，提取DNA，经过琼脂糖凝胶电泳。对照结果参见附图7，RNFG可以减少Aβ引起的神经细胞DNA降解，星形孢菌素(Staurosporin)为DNA降解阳性对照。另一方面，给药后的神经脑皮层细胞溶解液，进行Western blot测定。对照结果参见附图7，RNFG可以减少Aβ引起的神经细胞Caspase-3活化，并呈时间依赖性，星形孢菌素(Staurosporin)为Caspase-3活化的阳性对照。

2.细胞内钙离子流动测定

钙离子的内流是神经细胞凋亡的上游信号。培养2周左右的大鼠大脑皮层神经细胞和PC12细胞经过RNFG(100μM)给药24个小时，加入Fluo-4-AM荧光标记，加入Aβ(10μM)，实时测定钙离子的流动FlexStation II(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)。对照结果参见附图8，RNFG可以减少Aβ引起的神经细胞钙离子内流。

3.三七黄酮RNFG神经保护作用的构效关系

选取与RNFG化学结构相似的化合物槲皮素(RNFG的黄酮醇母核)和芦丁(与RNFG取代位相同的二糖黄酮醇苷，糖链组成不同)，在神经细胞中测定对Aβ聚集和细胞毒性。对照结果参见附图9，槲皮素和芦丁不具有抑制Aβ聚集和Aβ引起毒性的作用，NGF为阳性对照。

实验例5：RNFG的抗痴呆作用

Sprague-Dawley大鼠(雌性，体重240g±20g)，进行被动回避实验。实验中，大鼠放入亮室10秒，之后进入暗室，接受电刺激(0.6mA)3秒，老鼠保持记忆，学会躲避。RNFG、水和阳性对照他克林(Tacrine)腹膜内注射大鼠，45min后，腹腔注射东莨菪碱48小时，造成痴呆模型。进行记忆保持能力测试，测定步入潜伏期(老鼠从亮室进入暗室的时间)。对照结果参见附图10，RNFG增加了步入潜伏期，改善东莨菪碱对大鼠造成的记忆损伤，并呈剂量依赖性。

实施例1：

将RNFG和三七黄酮提取物(RNFG重量含量>50％)与辅料混合，辅料的用量为1-10％，过筛后，可按照口服制剂的常规工艺制成口服制剂，如：胶囊、片剂、口服液等，作为防治和预防老年痴呆病的药物和保健品。辅料可以为：淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙二醇、硬脂酸镁、微粉硅胶。

实施例2：

将RNFG与辅料混合，辅料的用量为1-10％，过筛后，可按照口服制剂的常规工艺制成口服制剂，如：胶囊、片剂、口服液等，作为防治和预防老年痴呆病的药物和保健品。辅料可以为：淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙二醇、硬脂酸镁、微粉硅胶。

实施例3：

取三七黄酮提取物浸膏，喷雾制粒，干燥，整粒，即得本发明所述的口服颗粒剂，作为防治和预防老年痴呆病的药物和保健品。

实施例4

用少量生理盐水溶解RNFG，加入吐温80适量，研磨均匀，再加生理盐水后脱色，装于盐水瓶中，密封，沸水加热灭菌，调节pH至5，抽滤至溶液澄明，即得注射液。

实施例5：

将RNFG与辅料混合，辅料的用量为5-20％，用注射用水溶解，调节pH至6-7，脱色，抽滤，至溶液澄明，再用微孔滤膜精滤，冷冻干燥，即得粉针剂。辅料可以为：乳糖、葡萄糖、甘氨酸、甘露醇、聚乙二醇。

Claims

1、一种预防和治疗阿尔茨海默氏症的药物，其特征在于：其有效成分为从原料药三七中提取的槲皮素-3-0-β-D-吡喃木糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷RNFG。

2、根据权利要求1所述的一种预防和治疗阿尔茨海默氏症的药物，其特征在于：该药物还包含辅料，制成临床接受的片剂、口服液、针剂、胶囊剂。

3、一种制备如权利要求1所述的预防和治疗阿尔茨海默氏症的药物的方法，其特征在于：取三七原药材粉碎，过200目筛，用70％乙醇提取，浓缩，经过聚酰胺柱，依次以水、30％乙醇和50％乙醇洗脱，30％乙醇洗脱部分溶于甲醇，作为粗黄酮部分进一步经过葡聚糖LH-20柱层析，由甲醇洗脱，洗脱部分再经过RP-C18柱分离，以30％、35％、40％、45％、50％的甲醇-水梯度洗脱，经过TLC检测，得到槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷RNFG。

4、从原料药三七中提取的槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷RNFG在预防和治疗阿尔茨海默氏症的保健品中的应用。