CN107188910B - 一种人参二醇皂苷及人参二醇型皂苷单体的制备方法 - Google Patents

一种人参二醇皂苷及人参二醇型皂苷单体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人参二醇皂苷及人参二醇型皂苷单体的制备方法，该方法以三七、人参或西洋参为原料，原料经低级醇提取浓缩，硅藻土过滤；然后用50‑70μm孔径大孔树脂选择性吸附人参三醇皂苷，收集流出液干燥得人参二醇皂苷粗品；将人参二醇皂苷粗品经甲醇、乙醇、甲醇水或乙醇水溶解，加入乙腈或乙酸乙酯沉淀，收集沉淀溶解，将人参二醇皂苷水溶液湿法上色谱树脂柱，先用乙醇溶液解析三醇杂质后，采用不同浓度的乙醇或甲醇溶液解析获得人参二醇皂苷或人参二醇型皂苷单体，本发明方法克服现有技术收率低、生产成本高、纯度低、生产周期长等弊端，获得高纯度的人参二醇皂苷或者二醇型皂苷单体，且方法简单易操作，成本低，适于工业化生产，环保无污染。

Description

一种人参二醇皂苷及人参二醇型皂苷单体的制备方法
技术领域
本发明涉及一种人参二醇皂苷及人参二醇型皂苷单体的制备方法。
背景技术
三七、人参、西洋参是我国名贵中药材，主要成分为人参皂苷，目前为止，已从三七的不同部位（根、茎叶、花蕾、种子等）分离得到70余种单体皂苷，这些单体皂苷成分按其结构特点可分为达玛烷型的20（S）-原人参二醇（panaxadiol Saponin, PDS）和20（S）-原人参三醇anaxtriol Saponin, PTS)两种类型。三七、人参、西洋参中的原人参二醇型皂苷主要由人参皂苷Rb1和Rd组成，原人参三醇型皂苷主要由人参皂苷Re、Rg1，三七则还包括三七皂苷R1组份。
人参二醇型皂苷药理作用如下：1、改善脑血循环、保护脑组织：扩张血管降低脑血管阻力，增加颈内动脉血流量。改善脑缺血引起的脑能量耗竭，脑梗塞引起的功能和行为障碍；2、降低血粘度和抑制血栓形成：抑制ADP、AA、PAF和凝血酶诱导的人体血小板聚集；3、对中枢神经系统的作用：对中枢神经有抑制作用，表现出镇静、安定和改善睡眠作用；Rb1有显著的镇静作用，通过减少突触体谷氨酸的量对中枢起到抑制作用；4、抗炎作用：对角叉菜胶、磷酸组胺引起的关节肿有抑制作用，对二甲苯引起的毛细血管通透性增加有显著抑制作用。
在专利文献报道中三七、人参、西洋参根类药材中人参二醇皂苷及其单体的分离主要通过大孔树脂吸附获得总皂苷，总皂苷再经硅胶柱或凝胶柱分离纯化得高纯度人参二醇皂苷和人参二醇皂苷单体Rb1、Rd；这些报道中，吸附树脂采用的大多为大孔径低选择性的广普苯乙烯非极性大孔吸附树脂，该类树脂脱糖功能教强，然而就算采用梯度洗脱分离二醇、三醇皂苷效果也较差，二醇皂苷中经常夹带三醇皂苷，达不到较好的分离效果；人参二醇单体分离制备主要是通过正相硅胶柱层析法或反相C-18硅胶柱层析法得到Rb1以及Rd单体。硅胶柱层析法有机溶剂使用量较大，死吸附强，所得单体收率、含量均较低，采用C-18硅胶柱层能很大程度解决硅胶柱层析缺点，然这类型填料每公斤上万元，填料成本太高；总之，现有人参二醇皂苷以及单体提取分离存在选择性差、分离纯度低，成本高，收率低、不适于工业化生产的缺点。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种针对性强、分离效果好、收率高，纯度高的人参二醇皂苷的制备方法。
本发明人参二醇皂苷的制备方法如下：
（1）以三七、西洋参或人参为原料，粉碎后采用质量百分比浓度60-80%的乙醇溶液冷浸提取，过滤后滤渣再提取2次，合并提取液，减压浓缩回收有机溶剂，浓缩液用纯净水稀释后硅藻土过滤，收集滤液；
（2）将步骤（1）滤液过50-70μm孔径大孔吸附树脂柱吸附人参三醇皂苷，收集上柱流出液，浓缩干燥得人参二醇皂苷粗品；粗品中主要含有人参二醇皂苷、多糖、氨基酸等；
（3）向步骤（2）人参二醇皂苷粗品中加入其质量3-4倍的质量百分比浓度95-100%的甲醇或95-100%乙醇溶液溶解，过滤去除不溶物，在过滤后溶液中添加其质量4-5倍乙酸乙酯或乙腈，搅拌混匀后静置2-4小时，收集沉淀，将沉淀用其质量4-5倍的纯净水溶解，减压浓缩去除有机溶剂，备用；
（4）将步骤（3）人参二醇皂苷水溶液湿法上色谱树脂柱，上样完后静置半小时，然后用质量百分比浓度40-45%的乙醇溶液解析杂质，TLC鉴别到无人参三醇类杂质停止解析，更换质量百分比浓度60-70%的乙醇溶液或甲醇溶液解析，收集解析液即得人参二醇皂苷溶液；
（5）将步骤（4）人参二醇皂苷溶液进行低温减压浓缩回收有机溶剂，得人参二醇皂苷流浸膏，冷冻干燥得人参二醇皂苷。
本发明另一目的是提供人参二醇型皂苷单体的制备方法，具体如下：
（1）以三七、西洋参或人参为原料，粉碎后采用质量百分比浓度60-80%的乙醇溶液冷浸提取，过滤后滤渣再提取2次，合并提取液，减压浓缩回收有机溶剂，浓缩液用纯净水稀释后硅藻土过滤，收集滤液；
（2）将步骤（1）滤液过50-70μm孔径大孔吸附树脂柱吸附人参三醇皂苷，收集上柱流出液，浓缩干燥得人参二醇皂苷粗品；
（3）向步骤（2）人参二醇皂苷粗品中加入其质量3-4倍的质量百分比浓度95-100%的甲醇或95-100%乙醇溶液溶解，过滤去除不溶物，该不溶物主要为多糖类杂质，在过滤后溶液中添加其质量4-5倍乙酸乙酯或乙腈，搅拌混匀后静置2-4小时，收集沉淀，将沉淀用其质量4-5倍的纯净水溶解，减压浓缩去除有机溶剂，备用；
（4）将步骤（3）人参二醇皂苷水溶液湿法上色谱树脂柱，上样完后静置半小时，然后用质量百分比浓度40-45%的乙醇溶液解析杂质，TLC鉴别到无人参三醇类杂质停止解析，更换质量百分比浓度50-55%乙醇溶液或甲醇溶液解析，收集解析液，解析液为人参皂苷Rb1单体解析液，Rb1洗脱完后，更换质量百分比浓度60-65%的乙醇溶液或甲醇溶液洗脱，收集洗脱液为人参皂苷Rd单体解析液；
（5）将步骤（4）所得人参皂苷Rb1单体解析液、人参皂苷Rd单体解析液分别进行低温减压浓缩回收有机溶剂，得人参皂苷Rb1浓缩液和人参皂苷Rd浓缩液，将Rb1浓缩液进行丙酮水或丙酮甲醇重结晶，取结晶体冷冻干燥得人参皂苷Rb1粉末；将人参皂苷Rd浓缩液进行真空减压干燥得人参皂苷Rd粉末。
上述人参二醇皂苷及其单体制备中，所述步骤（1）中第一次提取添加生药质量7-8倍的乙醇溶液，第二次提取添加生药质量5-6倍的乙醇溶液，第三次提取添加生药质量3-4倍的乙醇溶液，每次提取时间12h；浓缩液用纯净水稀释到4-5倍生药量。
所述步骤（2）中50-70μm孔径大孔吸附树脂型号为ZGCAD45、IIZ-803或D4006，大孔吸附树脂用量为生药量的1.5-2倍，上柱流速为2.5-3柱体积/h。
所述色谱树脂为R型树脂Chroma-R204或PRP树脂（型号512A、512B、512C、0831），树脂用量为步骤（3）沉淀质量的6-7倍。
本发明采用孔径合理的大孔吸附树脂粗分人参皂苷二醇事半功倍，人参皂苷二醇分子量大于三醇皂苷，选用均粒的50-70μm孔径非极性苯乙烯大孔吸附树脂则具有较好分离功能，这类树脂能较好的吸附小分子量的人参三醇皂苷，人参二醇皂苷分子量较大不易吸附，上柱时易顺水流出；人参二醇皂苷和人参三醇皂苷由于化学结构差异导致人参二醇皂苷在一定比例的乙腈水、乙腈甲醇、乙腈乙醇、乙酸乙酯甲醇或乙酸乙酯乙醇溶液中不能溶解，而三醇皂苷则溶解，应用该方法可以可进一步纯化人参二醇皂苷；本发明采用的色谱树脂填料价格较低，通常200-400元/公斤，且具有一定C-18色谱柱分离功能，其上柱量大、吸附量大、分离度高；使用低级醇可以获得高纯度的人参二醇皂苷，HPLC测定人参二醇皂苷含量大于95%；还可以洗脱分离开单体Rb1、Rd，得到高纯的单体化合物，Rd单体含量大于98%，单体Rb1含量大于90%，填料可反复使用，从某种程度上来说该方法能使植物单体分离走向低成本工业化大规模生产。
通过本发明方法的实施可克服现有技术收率低、生产成本高、纯度低、生产周期长等弊端，获得高纯度的人参二醇皂苷或者二醇型皂苷单体，且本发明方法简单易操作，成本低，适于工业化生产，环保无污染。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容。
实施例1：本人参二醇皂苷的制备方法如下：
（1）以西洋参为原料粉碎至60目后，在原料中添加生药质量7倍质量百分比浓度60%的乙醇溶液在室温下冷浸提取12h，过滤后在滤渣添加生药质量5倍质量百分比浓度60%的乙醇溶液提取12h，过滤后在滤渣添加生药质量3倍质量百分比浓度60%的乙醇溶液提取12h；合并3次提取液60℃减压浓缩回收溶剂，浓缩液用纯净水稀释到5倍生药量后硅藻土过滤，收集滤液；
（2）将步骤（1）滤液过50-60μm孔径大孔吸附树脂（ZGCAD45）柱吸附人参三醇皂苷，收集上柱流出液，浓缩干燥得人参二醇皂苷粗品，其中大孔吸附树脂用量为生药量的1.5倍，上柱流速为2.5柱体积/h；
（3）向步骤（2）人参二醇皂苷粗品中加入其质量3倍的质量百分比浓度95%的甲醇溶液溶解，过滤去除不溶物，在过滤后溶液中添加其质量4倍乙酸乙酯，搅拌混匀后静置2小时，收集沉淀，将沉淀用其质量4倍的纯净水溶解，60℃减压浓缩去除有机溶剂，备用；
（4）将步骤（3）人参二醇皂苷水溶液湿法上色谱树脂柱（R型树脂Chroma-R204，400目），色谱树脂用量为步骤（3）沉淀质量的6倍，上样完后静置半小时，然后用质量百分比浓度45%的乙醇溶液解析杂质，TLC鉴别到无人参三醇类杂质停止解析，更换质量百分比浓度70%的乙醇溶液解析，收集解析液即得人参二醇皂苷溶液；
（5）将步骤（4）人参二醇皂苷溶液进行60℃减压浓缩回收有机溶剂，得人参二醇皂苷流浸膏，冷冻干燥得人参二醇皂苷，收率92%，人参二醇皂苷纯度98%（以Rb1、Rd计）。
实施例2：本人参二醇皂苷的制备方法如下：
（1）以人参为原料粉碎至60目后，在原料中添加生药质量8倍质量百分比浓度70%的乙醇溶液在室温下冷浸提取12h，过滤后在滤渣添加生药质量6倍质量百分比浓度70%的乙醇溶液提取12h，过滤后在滤渣添加生药质量4倍质量百分比浓度70%的乙醇溶液提取12h；合并3次提取液60℃减压浓缩回收溶剂，浓缩液用纯净水稀释到4倍生药量后硅藻土过滤，收集滤液；
（2）将步骤（1）滤液过50-65μm孔径大孔吸附树脂（IIZ-803）柱吸附人参三醇皂苷，收集上柱流出液，浓缩干燥得人参二醇皂苷粗品，其中大孔吸附树脂用量为生药量的2倍，上柱流速为3柱体积/h；
（3）向步骤（2）人参二醇皂苷粗品中加入其质量4倍的质量百分比浓度100%的乙醇溶解，过滤去除不溶物，在过滤后溶液中添加其质量5倍乙腈，搅拌混匀后静置3小时，收集沉淀，将沉淀用其质量5倍的纯净水溶解，60℃减压浓缩去除有机溶剂，备用；
（4）将步骤（3）人参二醇皂苷水溶液湿法上色谱树脂柱（PRP-512B、400目），色谱树脂用量为步骤（3）沉淀质量的7倍，上样完后静置半小时，然后用质量百分比浓度43%的乙醇溶液解析杂质，TLC鉴别到无人参三醇类杂质停止解析，更换质量百分比浓度65%的甲醇溶液解析，收集解析液即得人参二醇皂苷溶液；
（5）将步骤（4）人参二醇皂苷溶液进行60℃减压浓缩回收有机溶剂，得人参二醇皂苷流浸膏，冷冻干燥得人参二醇皂苷，收率95%，人参二醇皂苷纯度95%（以Rb1、Rd计）。
实施例3：人参二醇型皂苷单体的制备方法如下：
（1）以三七为原料粉碎至60目后，在原料中添加生药质量7.5倍质量百分比浓度75%的乙醇溶液在室温下冷浸提取12h，过滤后在滤渣添加生药质量5.5倍质量百分比浓度75%的乙醇溶液提取12h，过滤后在滤渣添加生药质量3.5倍质量百分比浓度75%的乙醇溶液提取12h；合并3次提取液减压浓缩回收溶剂，浓缩液用纯净水稀释到5倍生药量后硅藻土过滤，收集滤液；
（2）将步骤（1）滤液过65-70μm孔径大孔吸附树脂（D4006）柱吸附人参三醇皂苷，收集上柱流出液，浓缩干燥得人参二醇皂苷粗品；其中大孔吸附树脂用量为生药量的1.8倍，上柱流速为2.6柱体积/h；
（3）向步骤（2）人参二醇皂苷粗品中加入其质量3倍的质量百分比浓度100%的甲醇溶解，过滤去除不溶物，在过滤后溶液中添加其质量5倍乙腈，搅拌混匀后静置4小时，收集沉淀，将沉淀用其质量4倍的纯净水溶解，60℃减压浓缩去除有机溶剂，备用；
（4）将步骤（3）人参二醇皂苷水溶液湿法上色谱树脂柱（PRP-0831、600目），色谱树脂用量为步骤（3）沉淀质量的7倍，上样完后静置半小时，然后用质量百分比浓度40%的乙醇溶液解析杂质，TLC鉴别到无人参三醇类杂质停止解析，更换质量百分比浓度50%乙醇溶液解析，收集解析液，解析液为人参皂苷Rb1单体解析液，Rb1洗脱完后，更换质量百分比浓度60%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液为人参皂苷Rd单体解析液；
（5）将步骤（4）所得人参皂苷Rb1单体解析液、人参皂苷Rd单体解析液分别进行60℃低温减压浓缩回收有机溶剂，得人参皂苷Rb1浓缩液和人参皂苷Rd浓缩液，将Rb1浓缩液进行丙酮水（丙酮:水体积比=5:1）重结晶，取结晶体冷冻干燥得人参皂苷Rb1粉末，收率91%%，纯度92%；将人参皂苷Rd浓缩液进行真空减压干燥得人参皂苷Rd粉末，收率95%，纯度98%。
实施例4：人参二醇型皂苷单体的制备方法如下：
（1）以人参为原料粉碎至60目后，在原料中添加生药质量7倍质量百分比浓度80%的乙醇溶液在室温下冷浸提取12h，过滤后在滤渣添加生药质量5倍质量百分比浓度80%的乙醇溶液提取12h，过滤后在滤渣添加生药质量3倍质量百分比浓度80%的乙醇溶液提取12h；合并3次提取液减压浓缩回收溶剂，浓缩液用纯净水稀释到5倍生药量后硅藻土过滤，收集滤液；
（2）将步骤（1）滤液过50-60μm孔径均粒大孔吸附树脂（ZGCAD45）柱吸附人参三醇皂苷，收集上柱流出液，浓缩干燥得人参二醇皂苷粗品；其中大孔吸附树脂用量为生药量的2倍，上柱流速为2.5柱体积/h；
（3）向步骤（2）人参二醇皂苷粗品中加入其质量4倍的质量百分比浓度95%的乙醇溶液溶解，过滤去除不溶物，在过滤后溶液中添加其质量4倍乙腈，搅拌混匀后静置2小时，收集沉淀，将沉淀用其质量4倍的纯净水溶解，60℃减压浓缩去除有机溶剂，备用；
（4）将步骤（3）人参二醇皂苷水溶液湿法上色谱树脂柱（PRP512A、400目），色谱树脂用量为步骤（3）沉淀质量的6倍，上样完后静置半小时，然后用质量百分比浓度45%的乙醇溶液解析杂质，TLC鉴别到无人参三醇类杂质停止解析，更换质量百分比浓度55%甲醇溶液解析，收集解析液，解析液为人参皂苷Rb1单体解析液，Rb1洗脱完后，更换质量百分比浓度65%的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液为人参皂苷Rd单体解析液；
（5）将步骤（4）所得人参皂苷Rb1单体解析液、人参皂苷Rd单体解析液分别进行60℃低温减压浓缩回收有机溶剂，得人参皂苷Rb1浓缩液和人参皂苷Rd浓缩液，将Rb1浓缩液进行丙酮甲醇（丙酮:甲醇体积比=4:1）重结晶，取结晶体冷冻干燥得人参皂苷Rb1粉末，收率90%，纯度91%；将人参皂苷Rd浓缩液进行真空减压干燥得人参皂苷Rd粉末，收率95%，纯度98%。

Claims (4)

1.一种人参二醇皂苷的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）以三七、西洋参或人参为原料，粉碎后采用质量百分比浓度60-80%的乙醇溶液冷浸提取，过滤后滤渣再提取2次，合并提取液，减压浓缩回收有机溶剂，浓缩液用纯净水稀释后硅藻土过滤，收集滤液；
（2）将步骤（1）滤液过50-70μm孔径大孔吸附树脂柱吸附人参三醇皂苷，收集上柱流出液，浓缩干燥得人参二醇皂苷粗品；
（3）向步骤（2）人参二醇皂苷粗品中加入其质量3-4倍的质量百分比浓度95-100%的甲醇或95-100%乙醇溶液溶解，过滤去除不溶物，在过滤后溶液中添加其质量4-5倍乙酸乙酯或乙腈，搅拌混匀后静置2-4小时，收集沉淀，将沉淀用其质量4-5倍的纯净水溶解，减压浓缩去除有机溶剂，备用；
（4）将步骤（3）人参二醇皂苷水溶液湿法上色谱树脂柱，上样完后静置半小时，然后用质量百分比浓度40-45%的乙醇溶液解析杂质，TLC鉴别到无人参三醇类杂质停止解析，更换质量百分比浓度60-70%的乙醇溶液或甲醇溶液解析，收集解析液即得人参二醇皂苷溶液；
（5）将步骤（4）人参二醇皂苷溶液进行低温减压浓缩回收有机溶剂，得人参二醇皂苷流浸膏，冷冻干燥得人参二醇皂苷；
所述步骤（2）中50-70μm孔径大孔吸附树脂型号为ZGCAD45、IIZ-803或D4006，大孔吸附树脂用量为生药量的1.5-2倍，上柱流速为2.5-3柱体积/h；
所述色谱树脂为R型树脂Chroma-R204或PRP树脂，树脂用量为步骤（3）沉淀质量的6-7倍。
2.根据权利要求1所述人参二醇皂苷的制备方法，其特征在于：步骤（1）中第一次提取添加生药质量7-8倍的乙醇溶液，第二次提取添加生药质量5-6倍的乙醇溶液，第三次提取添加生药质量3-4倍的乙醇溶液，每次提取时间12h；浓缩液用纯净水稀释到4-5倍生药量。
3.一种人参二醇型皂苷单体的制备方法，其特征在于：
（1）以三七、西洋参或人参为原料，粉碎后采用质量百分比浓度60-80%的乙醇溶液冷浸提取，过滤后滤渣再提取2次，合并提取液，减压浓缩回收有机溶剂，浓缩液用纯净水稀释后硅藻土过滤，收集滤液；
（2）将步骤（1）滤液过50-70μm孔径大孔吸附树脂柱吸附人参三醇皂苷，收集上柱流出液，浓缩干燥得人参二醇皂苷粗品；
（3）向步骤（2）人参二醇皂苷粗品中加入其质量3-4倍的质量百分比浓度95-100%的甲醇或95-100%乙醇溶液溶解，过滤去除不溶物，在过滤后溶液中添加其质量4-5倍乙酸乙酯或乙腈，搅拌混匀后静置2-4小时，收集沉淀，将沉淀用其质量4-5倍的纯净水溶解，减压浓缩去除有机溶剂，备用；
（4）将步骤（3）人参二醇皂苷水溶液湿法上色谱树脂柱，上样完后静置半小时，然后用质量百分比浓度40-45%的乙醇溶液解析杂质，TLC鉴别到无人参三醇类杂质停止解析，更换质量百分比浓度50-55%乙醇溶液或甲醇溶液解析，收集解析液，解析液为人参皂苷Rb1单体解析液，Rb1洗脱完后，更换质量百分比浓度60-65%的乙醇溶液或甲醇溶液洗脱，收集洗脱液为人参皂苷Rd单体解析液；
（5）将步骤（4）所得人参皂苷Rb1单体解析液、人参皂苷Rd单体解析液分别进行低温减压浓缩回收有机溶剂，得人参皂苷Rb1浓缩液和人参皂苷Rd浓缩液，将Rb1浓缩液进行丙酮水或丙酮甲醇重结晶，取结晶体冷冻干燥得人参皂苷Rb1粉末；将人参皂苷Rd浓缩液进行真空减压干燥得人参皂苷Rd粉末；
所述步骤（2）中50-70μm孔径大孔吸附树脂型号为ZGCAD45、IIZ-803或D4006，大孔吸附树脂用量为生药量的1.5-2倍，上柱流速为2.5-3柱体积/h；
色谱树脂为R型树脂Chroma-R204或PRP树脂，树脂用量为步骤（3）沉淀质量的6-7倍。
4.根据权利要求3所述的人参二醇型皂苷单体的制备方法，其特征在于：步骤（1）中第一次提取添加生药质量7-8倍的乙醇溶液，第二次提取添加生药质量5-6倍的乙醇溶液，第三次提取添加生药质量3-4倍的乙醇溶液，每次提取时间12h；浓缩液用纯净水稀释到4-5倍生药量。
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