CN106317148B - 一种从蛹虫草中提取虫草素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从蛹虫草中提取虫草素的方法，其主要步骤为：石油醚脱脂，高浓度乙醇提取，乙酸乙酯萃取，D1400树脂两次纯化，就可以获得≥95%纯度虫草素。本发明具有操作简便、虫草素提取率高、纯度高的优点，适合工业化生产，为虫草素的有效利用创造了条件，为虫草素的进一步开发、有效利用打下了基础。
Description
技术领域
本发明属于药用活性成分的提取技术领域，具体涉及一种从蛹虫草子实体中提取虫草素的方法。
背景技术
虫草素结构式为3’-脱氧腺苷，它是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素，溶于水、甲醇和热乙醇，不溶于苯、丁醚和氯仿，紫外最大吸收波长259nm。虫草素具有抗肿瘤、抗炎症、抗病毒、神经保护等药理作用，还对降低胆固醇、降血糖、酒精肝中毒具有辅助治疗作用；1997年美国开始虫草素的一期临床试验，治疗急性前B和前T淋巴细胞白血症患者；虫草素还表现出极强的抗真菌和抗HIV-I型病毒活性。
目前获取虫草素的获取主要通过条途径：一是从蛹虫草子实体中提取；二是通过液体发酵，从发酵液中提取。蛹虫草中虫草素的含量从1‰-8‰不等，提取效率不高，因此虫草素生产成本极高，价格昂贵，随着虫草素药理作用的深入研究，虫草素的国际需求日益增加。
目前虫草素的提取技术大多依靠浸提和液相制备等技术，专利CN102746355A以超低温粉碎、超声波水提、大孔树脂富集、反向高效液相色谱纯化得到高纯度的虫草素，反向高效液相色谱每次处理样量少，且纯化后必须处理由于流动相引入盐，操作方法复杂，回收率低。
专利CN102936271A采用微波光波辅助提取，等量活性炭脱色、大孔树脂富集，高效液相色谱3次纯化等技术获得高浓度虫草素，等量活性炭处理导致大量虫草素的丢失，高效液相色谱纯化处理量小，不易规模生产。CN104072559A采用超声水提，732阳离子树脂处理、反渗透浓缩、717阴离子树脂处理、再次反渗透浓缩、多次重结晶获得高浓度虫草素，此方法操作复杂，提取中引入盐分，反渗透浓缩体积比低，多次结晶丢失率高，虫草素结晶技术由于结晶溶剂的问题一直是处于瓶颈状态，晶体生长速度慢且出晶量少。
虫草素在蛹虫草中的含量低，选择合适富集方法是提取虫草素的关键，处理步骤不能多于5步，太过繁琐会大大降低回收率，目前的制备型仪器单次处理量小，不适合规模生产。因此一种采用低成本材料、工艺简单、适合规模化放大的虫草素提取方法是非常符合市场需求的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提取率高、成本低、操作步骤简单、可实现工业化规模生产的从蛹虫草子实体中提取虫草素的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种从蛹虫草中提取虫草素的方法，包括以下步骤：
（1）粉碎脱脂：将蛹虫草子实体烘干，粉碎，加石油醚脱酯，滤去石油醚，风干粉末，得到虫草粉末；
（2）乙醇浸提：脱脂后的虫草粉末用乙醇浸提，过滤，浓缩，用水洗涤至少两次，收集滤液，即虫草素粗提液；
（3）萃取：在虫草素粗提液中加入乙酸乙酯萃取，减压蒸馏至干；
（4）纯化：少量水溶解步骤（3）所得物，过滤除杂，用大孔树脂D1400层析，收集虫草素峰面积超过90%的样品浓缩干燥得高纯度虫草素。
优选的，所述步骤（1）中，烘干温度 60-65℃，粉碎粒度10-30目，石油醚用量：2倍体积的蛹虫草粉末。
优选的，所述步骤（2）中，提取溶剂为80%（v/v）的乙醇，液料比为：80%乙醇：虫草粉末 = 15-20: 1 (ml/g)；
若为浸提：浸提温度30℃，每次浸提时间2h；
若为超声辅助提取：超声频率20-30KHz，输出功率：100-250W;
提取液浓缩后加水定容体积为5～6倍的步骤（1）中的虫草粉末质量，充分摇匀过滤，再加等体积的水得虫草素粗液，待萃取。
优选的，所述步骤（3）中虫草素粗液调pH为12，样液与乙酸乙酯体积比为1:2.5（ml/ml），摇匀时间为30min，静置时间80min；萃取次数≥5。
优选的，所述步骤（4）中，所述层析过程为：（a）初次过柱，大孔树脂D1400的初次上样量为树脂饱和吸附量的20%-25%，洗脱速度为3BV/h样，洗液为50%的乙醇，分别检测各个接样管中虫草素含量，收集HPLC检测报告中虫草素峰面积百分比大于85%的接样管，浓缩后做第二次过柱；小于85%且含有虫草素的收集液浓缩后可与初次过柱上样液混合再次利用；（b）第二次过柱时，上样量不超过树脂饱和吸附量的50%，洗脱速度为3BV/h，洗脱时分段接样，分别检测各个接样管中虫草素含量；收集HPLC检测虫草素峰面积大于90%的接样管，浓缩冷冻干燥或真空干燥得高纯度虫草素，小于95%且含有虫草素的收集液在浓缩后可与初次过柱上样液混合再次利用。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
本发明采用石油醚脱脂，高浓度乙醇提取，乙酸乙酯萃取，D1400柱两次层析得到纯度为95%的虫草素，具有操作简便、虫草素提取率高、纯度高的优点，适合工业化生产，为虫草素的有效利用创造了条件。
附图说明
图1是层析装置模式图；
图2是不同温度不同乙醇浓度下虫草素的提取效果比较；
图3是不同温度不同乙醇浓度下腺苷的提取效果比较；
图4是层析中上样液的高效液相图谱；
图5是淋洗液的高效液相图谱；
图6是第一次收集液的高效液相图谱；
图7是第二次收集液的高效液相图谱。
1、恒流泵，2、紫外检测器。
具体实施方式
下面结合具体实施方式和实施例对本发明的进一步说明，而非对本发明的限制。
参见附图1-附图7，
本发明包括下述步骤：
（1）粉碎脱脂：将干燥好蛹虫草子实体原料粉碎后，加入2倍于粉末体积的石油醚，脱脂48h，过滤风干。由于在后续步骤中高浓度乙醇、乙酸乙酯对脂质的溶解度高，且大孔D1400也为非极性树脂，对脂质的吸附性强，容易引入脂质杂质，因此在本发明中首先采用虫草素不溶的石油醚脱脂，为后续步骤打下良好的基础。作为优选，烘干温度 60-65℃，粉碎粒度10-30目，石油醚用量：2倍体积的蛹虫草粉末。
（2）乙醇浸提：脱脂后的虫草粉末用80%的乙醇浸提或超声辅助提取至少两次，合并提取液，过滤浓缩至小体积，再加水至一定体积，过滤，再加一定水待萃取。结合图2和图3-7所示，80%乙醇提取有多方面的优点：首先是80%的高浓度乙醇中对多糖和蛋白的溶解度很低，无需在对提取液除多糖和蛋白；然后是80%的乙醇对虫草素的提取率较高，同时对虫草素类似物腺苷的溶解度却很低，降低了腺苷对后续分离中的干扰。最后因为80%乙醇醇提取液粘度低，常压下过滤速度快，等量水的虫草素浸提液过滤花费时间为乙醇浸提液的5倍。提取液浓缩后先加一定量的水溶解再过滤是为了除去易溶于高浓度乙醇但在水中溶解度低的杂质；采用超声辅助提取对提取收率的影响不显著，但可缩短处理时间。作为优选，80%乙醇：虫草粉末 = 15-20: 1 (ml/g)，浸提温度30℃，浸提时间2h，或超声辅助80%乙醇提取：超声频率20-30KHz，输出功率：100-250W；提取液浓缩后加水定容体积为5~6倍的步骤（1）中的虫草粉末质量，充分摇匀过滤，再加等体积的水得虫草素粗液，待萃取。
（3）萃取：如上粗体液用乙酸乙酯萃取，减压蒸馏，回收乙酸乙酯。乙酸乙酯萃取后，杂质显著减少，虫草素的浓度较上一步增加10倍左右，色素大量被去除，同时乙酸乙酯的萃取使得盐分显著降低，萃取过程在常温下即可进行。 萃取优化条件：上述步骤（2）中调虫草素粗液pH为12，虫草素粗液与乙酸乙酯体积比为1:2.5（ml/ml），摇匀时间30min，静置时间80min；为保证回收率，萃取过程保证在5次以上。
（4）纯化：层析装置如图1所示。将所得液体加入少量水，过4.5um滤膜，上样大孔树脂D1400，先蒸馏水淋洗平衡后，再用15%-20%甲醇洗脱，分时分段接样，HPLC检测，收集虫草素峰面积超过85%的接样管，浓缩至小体积，再次过D1400柱，蒸馏水淋洗，15%-20%甲醇洗脱，分时分段接样，HPLC检测，收集虫草素峰面积超过90%的样品浓缩干燥得高纯度虫草素。经过一次D1400树脂的纯化后，虫草素浓度再次提高10倍，纯度达到80%，经过第二次D1400树脂纯化后，虫草素的浓度达到95%，干燥后为白色粉末。D1400树脂对虫草素不仅有高的吸附量，可用于虫草素分离纯化，同时还能进一步除去色素，无需活性炭的脱色处理。本发明中大孔树D1400在洗脱中并未实现虫草素和其类似物腺苷的完全分离，液相检测报告显示，在不同时间收集的样品中存在三个峰，分别为腺苷、虫草素、未知物，腺苷先被洗脱出来，后为虫草素和微量的未知物，腺苷和虫草素存在小部分的混合区，不对其收集，只收集腺苷含量极低的样品。采用这样的收集方法可以达到提高虫草素纯度的效果，二次过柱层析更加提高了虫草素的纯度，且色素基本消失（图4-7分别为上样液，淋洗液，第一次收集液，第二次收集液的液相图）。
作为优选，步骤4中柱层析上样量为20%-25%的树脂饱和吸附量（3.2mg/ml左右），淋洗和洗脱流速3BV/h；第一次过柱洗脱时，接样开始时间为254nm检测器显示值大于0.4，每次接样体积0.5BV换接样管继续接样，当紫外显示器数值达到最大并开始下降时，此后洗脱无须再换接样管，大体积接样管直接收集，停止接样时间为254nm检测器显示值小于0.4，分别检测各个接样管中虫草素含量，收集HPLC检测报告中虫草素峰面积百分比大于85%的接样管，浓缩做第二次过柱，小于85%且含有虫草素的收集液可与原上样液混合再次利用；第二次过柱上样量不超过树脂饱和吸附量的50%，每次接样0.5BV后换接样管，开始接样时间和停止接样时间与第一次过柱相同，分别检测各个接样管中虫草素含量，收集HPLC检测报告中虫草素峰面积百分比大于90%的接样管，少数不足90%的样液可回收浓缩后与第一次过柱样液混合再次利用。
下面我们通过具体的实施例来说明。
实施例1
称取34g干燥好的人工培育蛹虫草，经测定，虫草素含量为1.7mg/g，粉碎后加入两倍体积的石油醚，封口磁力搅拌两天，过滤，虫草粉末风干。加入600ml 80%的乙醇浸提2小时，过滤，重复两次，合并滤液，上旋转蒸发仪，减压蒸馏至体积为100ml左右，无醇味，加水至200ml，摇匀，过滤。再加水至300ml左右，调pH为12，加750ml的乙酸乙酯与粗提液混合，磁力搅拌30min，静置80min，取上清液，萃取5次，减压蒸馏上清液回收乙酸乙酯，加少量水溶解后，过0.45um膜，所用柱体积30ml，根据实验室实际情况分两批过柱，上样后先用蒸馏水淋洗，再用20%的甲醇洗脱，紫外检测器显示为0.4是开始接样，每小管每次接15ml，流速3BV/h，从检测器数值达到最高开始下降时，到数值下降到0.4左右，全部收集到一管中，HPLC检测每小管中虫草素的含量，虫草素峰面积大于85%的合并到大管中，其余虫草素峰面积不大于85%且含有虫草素的样品浓缩后与第二批混合后上样。两批收集好的洗脱液，减压蒸馏，至3-5ml，第二次上样，柱体积30ml，蒸馏水淋洗，20%甲醇洗脱，流速3BV/h，每次接样15ml，紫外检测器显示为0.4是开始接样，数值下降到0.4时停止接样。HPLC分别检测各个接样管中虫草素的含量，虫草素峰面积大于90%的做收集，浓缩冷冻干燥后得95%虫草素21.85mg。
实施例2
称取150g干燥好的人工培育蛹虫草，虫草素含量为1.7mg/g，粉碎后加入两倍体积的石油醚，封口磁力搅拌两天，过滤，虫草粉末风干。加入3L 80%的乙醇浸提2小时，过滤，重复两次，合并滤液，上旋转蒸发仪，减压蒸馏至体积为400ml左右，无醇味，加水至800ml，摇匀，过滤。再加水至1.5L左右，NaOH调pH为12，根据实验室实际情况萃取过程分两批进行，2.5倍体积的乙酸乙酯与粗提液混合，磁力搅拌30min，静置80min，取上清液，萃取5次，减压蒸馏上清液回收乙酸乙酯，加少量水溶解后，过0.45um膜，所用柱体积100ml，根据实验室实际情况分三批过柱，上样后先用蒸馏水淋洗，再用20%的甲醇洗脱，紫外检测器显示为0.4是开始接样，每小管每次接50ml，流速3BV/h，从检测器数值达到最高开始下降时，到数值下降到0.4左右，全部收集到一管中，HPLC检测每小管中虫草素的含量，虫草素峰面积大于85%的合并到大管中，其余浓缩后与第二批混合后上样，第二批检测虫草素峰面积未达到85%的样品浓缩后与第三批混合后上样，三批收集好的洗脱液，减压蒸馏至小体积，第二次上样，分两批进行，柱体积80ml，蒸馏水淋洗，20%甲醇洗脱，流速3BV/h，每次接样40ml，紫外检测器显示为0.4是开始接样，数值下降到0.4时停止接样。HPLC分别检测各个接样管中虫草素的含量，虫草素峰面积大于90%的做收集，浓缩冷冻干燥后得94.5%虫草素95.2mg。
上文中用一般性说明、具体实施方式及实验对本发明做了详尽的描述，但在本发明的基础上，可对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种从蛹虫草中提取虫草素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）粉碎脱脂：将蛹虫草子实体烘干，粉碎，加石油醚脱酯，滤去石油醚，干燥，得到虫草粉末；
（2）乙醇浸提：脱脂后的虫草粉末用乙醇浸提，过滤，浓缩，浓缩液用水洗涤至少两次，收集滤液，即虫草素粗提液；
（3）萃取：向虫草素粗提液中加入乙酸乙酯，萃取，取有机相减压蒸馏至干；
（4）纯化：步骤（3）所得物加水至恰好溶解，过滤除杂，D1400树脂层析，将层析液浓缩干燥得高纯度虫草素；
所述步骤（2）中，所述乙醇的体积分数为80%；所述乙醇的体积与虫草粉末的质量之比为15-20: 1；浸提温度30℃，浸提时间2h；
所述步骤（4）中，所述层析过程为：（a）初次过柱，初次上样量为树脂饱和吸附量的20%-25%，洗脱速度为3BV/h，洗液为50%的乙醇，分别检测各个接样管中虫草素含量，收集HPLC检测报告中虫草素峰面积百分比大于85%的接样管，浓缩后做第二次过柱；小于85%且含有虫草素的收集液浓缩后可与初次过柱上样液混合再次利用；（b）第二次过柱时，上样量不超过树脂饱和吸附量的50%，洗脱速度为3BV/h，洗脱时分段接样，分别检测各个接样管中虫草素含量；收集HPLC检测虫草素峰面积大于90%的接样管，浓缩冷冻干燥或真空干燥得高纯度虫草素，小于95%且含有虫草素的收集液在浓缩后可与初次过柱上样液混合再次利用。
2.根据权利要求书1所述的提取虫草素的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，烘干温度为 60-65℃，粉碎粒度为10-30目，石油醚用量为蛹虫草粉末体积的2倍。
3.根据权利要求书1所述的提取虫草素的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，其还包括在乙醇浸提过程中采用超声辅助提取，其中超声频率为20-30KHz，输出功率为100-250W。
4.根据权利要求书1所述的提取虫草素的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述浓缩液用水洗涤的步骤为：向浓缩液中加入水，加水量为烘干后的蛹虫草子实体质量的5～6倍，充分摇匀过滤，再向滤液中加等体积的水得虫草素粗液。
5.根据权利要求书1所述的提取虫草素的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，萃取条件为：虫草素粗液的pH为12，虫草素粗液与乙酸乙酯的体积比为1:2.5，摇匀时间为30min，静置时间80min；萃取次数≥5。
6.根据权利要求书1所述的提取虫草素的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，取虫草素峰面积超过90%的层析液，浓缩干燥得高纯度虫草素。
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