CN107556358B - 促凝血蛹虫草有效成分及其提取分离方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种促凝血蛹虫草有效成分及其提取分离方法、应用。本发明采用特殊的方法从蛹虫草乙酸乙酯部位中分离得到五个化合物（分别为麦角甾醇、腺苷、虫草素、麦角甾醇过氧化物、甘露醇），并对这五个化合物的体外促凝血效果进行考察，结果表明：化合物1~5均具有良好的促凝血效果，因此，它们可以单独或组合用于制备促凝血药物。

Description

促凝血蛹虫草有效成分及其提取分离方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种促凝血蛹虫草有效成分及其提取分离方法、应用。

背景技术

蛹虫草 (Cordyceps militaris (L.er.Fr.) Link)，是虫草菌寄生在鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫蛹体及幼虫形成的虫菌复合体，为麦角菌科虫草属真菌，又称北冬虫夏草、北虫草。

蛹虫草主要活性成分是核苷类，此外还含有多糖、脂肪酸、甾醇、维生素及微量元素等多种化学成分。研究发现，蛹虫草具有延缓衰老、抗疲劳、降血糖、抗肿瘤、抗炎、保肝、抗菌等药理作用。此外，蛹虫草作为传统药食同源中药材，不仅有显著的药用价值，而且具有丰富的营养价值，现已成为食品、饮料、保健酒等加工原材料。

凝血的实质是呈水溶性的纤维蛋白原转变为水中不溶解的固态纤维蛋白的过程，是在内源性或（和）外源性凝血途径下产生凝血酶原激活物，在凝血因子的作用下产生凝血酶，最后在凝血酶的作用下使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。PT主要反映的是外源性凝血途径中凝血因子I、II、V、VII、X的活性；APTT主要反映内源性凝血系统状况，与VIII、X、XI、XII等内源性凝血因子活性有关；TT值是主要反映纤维蛋白原转变为纤维蛋白程度的重要指标；FIB主要反映纤维蛋白原的含量。

发明内容

本发明目的在于提供一种从蛹虫草中提取分离得到具有促凝血作用的蛹虫草有效成分，同时提供了该蛹虫草有效成分的提取分离方法及应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种促凝血蛹虫草有效成分的提取分离方法，其包括以下步骤：

1）以干燥、粉粹过的蛹虫草为原料，先用二氯甲烷室温浸提，二氯甲烷浸提结束后过滤，回收滤渣，然后用70±10%乙醇室温浸提，乙醇浸提结束后过滤、浓缩得乙醇总浸膏；将乙醇总浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位及正丁醇部位；

2）乙酸乙酯部位用80~100目硅胶拌样后，进行200~300目硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇 (体积比100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16、100:32、0:100) 进行梯度洗脱，以硅胶薄层色谱检测合并，得到8个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分1-8；

组分2经硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯 (体积比40:1、30:1、20:1、10:1、1:1)进行梯度洗脱，再经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，得到化合物1和化合物2；

组分3经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇 (体积比40:1) 进行洗脱，再经SephadexLH-20凝胶柱色谱纯化 (石油醚-二氯甲烷-甲醇体积比9:9:2洗脱)，得到化合物3；

组分4经硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，得到化合物4；

组分5经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-乙酸乙酯 (体积比20:1、10:1、1:1) 进行梯度洗脱，再经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化（二氯甲烷-甲醇体积比1:1），得到化合物5；

所述促凝血蛹虫草有效成分为化合物1、2、3、4和5中的一种或两种以上的混合物。

本发明还提供了利用上述提取分离方法得到的促凝血蛹虫草有效成分。

本发明还公开了上述的促凝血蛹虫草有效成分在制备促凝血药物方面的应用。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明采用特殊的提取分离方法从蛹虫草乙酸乙酯部位中分离得到五个化合物，并对五个化合物的体外促凝血效果进行考察，结果表明，化合物1~5均具有良好的促凝血效果，因此，它们可以单独或组合用于制备促凝血剂。

附图说明

图1为凝血机制图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例1

蛹虫草购买自河南省濮阳市尚濮虫草有限公司，为麦角菌科虫草属真菌蛹虫草(Cordyceps militaris)。

本文中的乙醇浓度均为体积浓度。

促凝血蛹虫草有效成分的提取分离方法，其包括以下步骤：

1）以干燥、粉粹过的1920 g蛹虫草为原料，用原料重量的15-18倍量的二氯甲烷室温浸提 (浸提3次，每次3d)，二氯甲烷浸提结束后过滤，回收滤渣，然后用原料重量的15-18倍量的70%乙醇室温浸提 (浸提3次，每次3d)，乙醇浸提结束后合并乙醇浸提液，过滤、浓缩，得260 g乙醇总浸膏。将乙醇总浸膏分散于50 mL水中形成分散液，依次用石油醚 (约分散液的1倍体积)、乙酸乙酯 (约分散液的1倍体积) 和正丁醇 (约分散液的1倍体积) 萃取，各萃取3次，回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位及正丁醇部位；

2）乙酸乙酯部位用80~100目硅胶拌样后，进行200~300目硅胶柱色谱，经二氯甲烷-甲醇 (体积比100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16、100:32、0:100) 梯度洗脱，以硅胶薄层色谱检测合并，得8个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分1-8；

组分2经硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯 (体积比40:1、30:1、20:1、10:1、1:1)进行梯度洗脱，再经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化 (石油醚-二氯甲烷-甲醇体积比9:9:2洗脱)，得到化合物1和化合物2；

组分3经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇 (体积比40:1) 进行洗脱，再经SephadexLH-20凝胶柱色谱纯化 (石油醚-二氯甲烷-甲醇体积比9:9:2洗脱)，得到化合物3；

组分4经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇 (体积比30:1:1) 进行洗脱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化 (二氯甲烷-甲醇体积比1:1)，得到化合物4；

组分5经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-乙酸乙酯 (体积比20:1、10:1、1:1) 进行梯度洗脱，再经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化 (二氯甲烷-甲醇体积比1:1)，得到化合物5；

所述促凝血蛹虫草有效成分为化合物1、2、3、4和5中的一种或两种以上的混合物。

化合物1、2、3、4、5依次是麦角甾醇、腺苷、虫草素、麦角甾醇过氧化物、甘露醇，其结构及图谱鉴定结果分别如下所示：

。

麦角甾醇（化合物1）: 白色粉末，C₂₈H₄₄O， EI-MS m/z: 396[M]⁺。¹H-NMR(CDCl₃,400 MHz) δ: 0.67(3H, s, H-18), 0.80 (3H, d, J=6.6Hz, H-27), 0.84 (3H, d, J=6.8Hz, H-26), 0.92 (3H, d, J=6.4Hz, H-28), 0.94 (3H, s, H-19), 1.00 (3H, d, J=6.6Hz, H-21), 3.52 (1H, m, H-3), 5.13 (1H, dd, H-22), 5.20 (1H, dd, H-23),5.35 (1H, dd, H-8), 5.60 (1H, dd, H-6). ¹³C-NMR(CDCl₃, 100 MHz): 38.94 (C-1),31.88 (C-2), 70.98 (C-3), 40.09 (C-4), 140.37 (C-5), 119.26 (C-6), 116.38 (C-7), 141.05 (C-8), 46.97 (C-9), 36.69 (C-10), 21.89 (C-11), 38.89 (C-12),42.49 (C-13), 54.96 (C-14), 23.47 (C-15), 28.41 (C-16), 56.26 (C-17), 12.15(C-18), 17.56 (C-19), 40.32 (C-20), 21.22 (C-21), 136.15 (C-22), 132.06 (C-23), 42.34 (C-24), 33.32 (C-25), 19.97 (C-26), 18.95 (C-27), 19.27 (C-28)。

腺苷（化合物2）：白色粉末，C₁₀H₁₃N₅O₄，EI-MS m/z: 268[M＋H]⁺。¹H-NMR(CDCl₃,400 MHz) δ: 3.16 (1H, dd, Ha-5′), 3.53 (1H, dd, Hb-5′), 3.77 (1H, dd, H-4′),3.96 (1H, m, H-3′), 4.62 (1H, dd, H-2′), 5.28 (1H, s, 3′-OH), 5.47 (1H, dd,5′-OH), 5.63 (1H, d, J=6.1Hz, 2′-OH), 5.83 (1H, d, J=6.6Hz, H-1′), 7.19 (2H,brs, -NH₂), 8.36 (1H, s, H-2), 8.47 (1H, s, H-8). ¹³C-NMR(CDCl₃, 100 MHz):151.75 (C-2), 149.16 (C-4), 119.02 (C-5), 156.13 (C-6), 138.76 (C-8), 89.23(C-1′), 72.00 (C-2′), 71.05 (C-3′), 85.38 (C-4′), 62.06 (C-5′)。

虫草素（化合物3）: 白色粉末，C₁₀H₁₃N₅O₃，EI-MS m/z: 251[M]⁺。¹H-NMR(CDCl₃,400 MHz) δ: 1.87 (1H, dd, Ha-3′), 2.21 (1H, dd, Hb-3′), 3.50 (1H, dd, Ha-5′),3.67 (1H, dd, Hb-5′), 4.57 (1H, m, H-4′), 4.84 (1H, m, H-2′), 4.98 (1H, t,5′-OH), 5.68 (1H, d, J=4.4Hz, 2′-OH), 5.94 (1H, d, J=2.2Hz, H-1′), 7.20 (2H,brs, -NH₂), 8.22 (1H, s, H-2), 8.40 (1H, s, H-8). ¹³C-NMR(CDCl₃, 100 MHz):151.87 (C-2), 148.06 (C-4), 119.33 (C-5), 156.22 (C-6), 139.04 (C-8), 90.91(C-1′), 74.86 (C-2′), 33.95 (C-3′), 81.07 (C-4′), 62.32 (C-5′)。

麦角甾醇过氧化物（化合物4）: 白色粉末，C₂₈H₄₄O₃，EI-MS m/z: 428[M]⁺。¹H-NMR(CDCl₃, 400 MHz) δ: 0.80 (3H, s, H-18), 0.82 (3H, d, J=6.7Hz, H-26), 0.84(3H, d, J=6.9Hz, H-27), 0.90 (3H, s, H-19), 0.95 (3H, d, J=6.8Hz, H-28), 1.00(3H, d, J=6.6Hz, H-21), 3.88 (1H, m, H-3), 5.06 (1H, dd, H-22), 5.18 (1H, dd,H-23), 6.32 (1H, d, J=8.5Hz, H-6), 6.65 (1H, d, J=8.3Hz, H-7). ¹³C-NMR(CDCl₃,100 MHz): 36.04 (C-1), 30.25 (C-2), 65.86 (C-3), 34.92 (C-4), 81.73 (C-5),135.05 (C-6), 134.78 (C-7), 79.16 (C-8), 49.92 (C-9), 36.60 (C-10), 20.79 (C-11), 38.87 (C-12), 44.19 (C-13), 52.06 (C-14), 24.47 (C-15), 28.11 (C-16),56.13 (C-17), 19.15 (C-18), 17.23 (C-19), 40.25 (C-20), 21.20 (C-21), 132.25(C-22), 131.36 (C-23), 42.54 (C-24), 32.32 (C-25), 19.77 (C-26), 18.95 (C-27), 18.23 (C-28)。

甘露醇（化合物5）: 白色结晶，C₆H₁₄O₆，EI-MS m/z: 182[M]⁺。¹H-NMR(CDCl₃, 400MHz) δ: 3.21 (2H, dd, H-2, H-5), 3.54 (2H, dd, H-1a, H-6a), 3.57 (2H, d, J=8.6Hz, H-3, H-4), 3.75 (2H, dd, H-1b, H-6b). ¹³C-NMR(CDCl₃, 100 MHz)：70.88 (C-1, C-6), 68.34 (C-2, C-5), 62.79 (C-3, C-4)。

化合物1、2、3、4、5的促凝血效果实验：

方法：家兔体外血浆凝血四项检测（凝血机制图见图1）

仪器和材料：TGL-16gR高速台式冷冻离心机 (上海安亭科学仪器厂)；HF6000-4半自动凝血分析仪 (南方汉方医疗器械有限公司)； LRH-150生化培养箱 (上海一恒科技有限公司)；0.109 mol/L枸橼酸钠溶液 (自制)；氯化钠注射液 (1707182703)、注射用灯盏花素(20161103-1) 和云南白药 (2GA1604) 均由昆明龙津药业股份有限公司生产；凝血酶原时间 (PT) 测定试剂盒 (105317)、活化部分凝血酶时间 (APTT) 测定试剂盒 (112198)、凝血酶时间 (TT) 测定试剂盒( 121181)、纤维蛋白原 (FIB) 含量测定试剂盒 (132120 )均由上海太阳生物技术有限公司生产。

实验动物：獭兔，雄性，体重2.0～2.5 kg，由河南大学药学院中药研究所提供 (医动字16-9-2号)。

样品溶液配制：分别精密称取化合物1-5 (1 mg) 溶解于200 μL溶剂制得浓度为5mg/mL的溶液。精密称取灯盏花素8 mg溶解于600 μL溶剂制得浓度为13.33 mg/mL的溶液。精密称取云南白药1 mg溶解于50 μL溶剂制得浓度为20 mg/mL的溶液。溶剂为：DMSO:吐温80:生理盐水=2:8:17 (体积比)。

实验方法：

1）对APTT影响的检测方法

血浆的制备：家兔耳缘静脉取血3.6 mL，置于含有0.109 mol/L枸橼酸钠400 μL的4 mL离心管中，轻轻颠倒混匀，3000 rpm离心15 min，取上层清液备用。

在测试杯中加入20μL样品溶液，再加入100 μL血浆和37 ℃预温的APTT试剂100 μL，37 ℃孵育5 min后加入37℃预温的0.025 mol/L CaCl₂溶液100 μL，记录凝固时间，即为APTT值。

2）对PT影响的检测方法

血浆制备方法同1），分别在不同测试杯中加入25 μL各个样品溶液，再加入100 μL的血浆，37 ℃孵育3 min后加入37 ℃预温的PT试剂200 μL，记录凝固时间，即为PT值。

3）对TT影响的检测方法

血浆制备方法同1），分别在测试杯中加入50 μL各个样品溶液和200 μL的血浆，孵育3min后加入TT试剂200 μL，记录凝固时间，即为TT值。

4）对FIB影响的检测方法

血浆制备方法同1），按照试剂说明书定标准曲线，取200 μL血浆和100 μL样品，然后加入700 μL缓冲液。混匀后，取稀释后的血浆200 μL，37℃预温3 min，加入凝血酶溶液100 μL，记录纤维蛋白原的含量，即为FIB值。

数据处理：结果采用算术平均值和标准差表示，数值统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析法 (One-Way ANOVA) 进行组间比较，组间差异采用LSD (least significantdifference) 检测方法，其中P<0.05说明具有统计学意义。测定结果见表1。

表1 蛹虫草化合物体外凝血四项结果

注：数据代表平均值±SD，N=4；

与空白组比较，***P<0.001, or, *P<0.05；

与云南白药比较，^&&& P<0.001, or, 0.001<^&& P<0.01；

与空白组相比，化合物1麦角甾醇能极显著缩短APTT和PT时间 (P<0.001)，且极显著地降低FIB (P<0.001)；化合物2腺苷、化合物3虫草素及化合物4麦角甾醇过氧化物能极显著缩短APTT、PT和TT时间 (P<0.001)，同时也能极显著地降低FIB (P<0.001)；化合物5甘露醇能极显著缩短APTT和TT时间 (P<0.001)，且极显著地降低FIB (P<0.001)。表明，化合物1至5均具有较好促凝血活性，且化合物4麦角甾醇过氧化物的效果比云南白药好 (P<0.001)，化合物1、2、3、4、5可以单独或组合用于制备促凝血药物，如促凝血剂。

Claims (1)

1.一种促凝血蛹虫草有效成分的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以干燥、粉粹过的蛹虫草为原料，先用二氯甲烷室温浸提，二氯甲烷浸提结束后过滤，回收滤渣，然后用70±10%乙醇室温浸提，乙醇浸提结束后过滤、浓缩得乙醇总浸膏；将乙醇总浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位及正丁醇部位；

2）乙酸乙酯部位用80~100目硅胶拌样后，进行200~300目硅胶柱色谱，以体积比100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16、100:32、0:100的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，以硅胶薄层色谱检测合并，得到8个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分1-8；

组分2经硅胶柱色谱，以体积比40:1、30:1、20:1、10:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，再以体积比9:9:2的石油醚-二氯甲烷-甲醇为洗脱液经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，得到化合物1和化合物2；

组分3经硅胶柱色谱，以体积比40:1的二氯甲烷-甲醇进行洗脱，再以体积比9:9:2的石油醚-二氯甲烷-甲醇为洗脱液经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，得到化合物3；

组分4经硅胶柱色谱，以体积比30:1:1的二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇进行洗脱、以体积比1:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱液经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，得到化合物4；

组分5经硅胶柱色谱，以体积比20:1、10:1、1:1的二氯甲烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱，再以体积比1:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱液经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，得到化合物5；

化合物1、2、3、4、5依次是麦角甾醇、腺苷、虫草素、麦角甾醇过氧化物、甘露醇；所述促凝血蛹虫草有效成分为化合物1、2、3、4和5中的一种或两种以上的混合物。