CN105535154A - 垂丝海棠提取物和活性化合物、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物提取技术领域，具体涉及了一种包括垂丝海棠花总浸膏、40%甲醇部位浸膏、60%甲醇部位浸膏、甲醇部位浸膏的垂丝海棠花提取物，以及从垂丝海棠花中分离得到的活性化合物宝藿苷Ⅱ（1）、山奈酚-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷（2）、根皮素-4ˊ-O-葡萄糖苷（3）、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷（4）的制备和运用。实验证明，垂丝海棠花各提取物和各活性化合物均具有抗凝血作用，可以单独或组合用于制备抗凝血剂。

Description

垂丝海棠提取物和活性化合物、制备方法及应用
技术领域
本发明属于医药和/或保健品技术领域，具体涉及一种垂丝海棠提取物和从垂丝海棠花中分离得到的活性化合物、制备方法，以及其在抗凝血方面的新用途。
背景技术
垂丝海棠（MalushallianaKoehne）是蔷薇科苹果属植物。垂丝海棠，气微，味微苦、涩，性平，归肝经，有调经和血的功效，主要用于治疗血崩。垂丝海棠与同科的贴梗海棠（C.speciosa）、西府海棠（M.micromalus）和木瓜海棠（C.cathayensis）并称“海棠四品”。查阅文献发现：垂丝海棠具有保肝、抗氧化、体外抑制α-葡萄糖苷酶活性，而且垂丝海棠花、叶和果实中都有一定的活性成分，药用价值较高。但对垂丝海棠的研究主要集中在园林美化、栽培繁育、保健饮料、生物活性方面，化学成分仅见脂溶性成分的报道。
血液凝固简称凝血，是在内源性或（和）外源性凝血途径下产生凝血酶原激活物，凝血酶原激活物在凝血因子的作用下产生凝血酶，最后凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，血液由溶胶状态转变为凝胶状态。凝血过程通常分为：①内源性凝血途径；②外源性凝血途径；③共同凝血途径。外源性凝血途径是从组织因子暴露于血液而启动，到因子X被激活的过程；临床上以凝血酶原时间（PT）测定来反映外源性凝血途径的状况。内源性凝血途径是指从因子XII激活，到因子X激活的过程；临床上以活化部分凝血活酶时间（APTT）来反映体内内源性凝血途径的状况。从因子X被激活至纤维蛋白形成，是内、外源共同凝血途径；主要包括凝血酶生成和纤维蛋白形成两个阶段。
血栓形成是许多疾病如心肌梗死、缺血性卒死、深静脉血栓等的基本病理过程，它严重地危害着人类的健康，它的形成与血小板的聚集、粘附，内源性和外源性凝血系统以及纤维蛋白的形成密切相关。根据世界卫生组织的调查报告，由于动脉粥样硬化导致的血栓疾病引起的死亡已经排到了第一位。动脉血栓是由于动脉粥样硬化，斑块不稳定发生了斑块的破裂，使血液里的血小板发生聚集，激活了体内的凝血系统，最后导致血栓形成。一旦堵塞以后就会发生组织的缺血和坏死，产生严重的后果。在动脉血栓性疾病的急性或特殊状态下，需要辅助使用抗凝血药物，才能达到更好的抗血栓效果。
目前，尚无垂丝海棠花提取物和化合物宝藿苷Ⅱ、山奈酚-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷、根皮素-4'-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷对家兔体外血浆凝血四项影响的报道。本发明通过测定垂丝海棠花提取物和化合物对凝血四项的影响，考察其体外抗凝血作用。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种垂丝海棠提取物和从垂丝海棠花中分离得到的活性化合物、制备方法，以及其在制备抗凝血药物方面的新用途。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种垂丝海棠提取物的制备方法，其以垂丝海棠花为原料，将阴干的垂丝海棠花用70%乙醇浸渍提取2－4次，每次2－4d，提取液浓缩得到垂丝海棠花总浸膏；将垂丝海棠花总浸膏用甲醇溶解，D-101型大孔树脂拌样、装柱，依次用水、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、甲醇梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱5个柱体积，每个柱体积2000mL，浓缩，分别得到水部位浸膏、20%甲醇部位浸膏、40%甲醇部位浸膏、60%甲醇部位浸膏、甲醇部位浸膏。垂丝海棠提取物即为垂丝海棠花总浸膏、40%甲醇部位浸膏、60%甲醇部位浸膏和甲醇部位浸膏中的一种或两种以上的混合物。
一种从60%甲醇部位浸膏中分离垂丝海棠活性化合物的方法，其将上述的60%甲醇部位浸膏进行200－300目硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50的二氯甲烷乙酸乙酯混合液、以及体积比为10:0、9:1、8:2的二氯甲烷甲醇混合液进行梯度洗脱，薄层色谱进行检测，相同成分合并，共得到11个组分；其中的第4组分经过反复的硅胶柱色谱和凝胶柱色谱分离得到化合物1、2和4；其中的第6组分经过中压制备液相色谱、硅胶柱色谱、SephadexLH-20凝胶柱色谱分离得到化合物3。垂丝海棠花活性化合物即为化合物1、2、3和4中的一种或两种以上的混合物。其中，化合物1、2、3、4分别为宝藿苷Ⅱ、山奈酚-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷、根皮素-4'-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷（4），其结构如图1所示。
采用上述方法制备得到的垂丝海棠提取物。
采用上述方法制备得到的垂丝海棠活性化合物。
上述垂丝海棠提取物在制备抗凝血药物方面的应用。
述垂丝海棠活性化合物在制备抗凝血药物方面的应用。
上述垂丝海棠提取物和垂丝海棠活性化合物联合使用用于制备抗凝血药物。
和现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供具有活性化合物的来源植物垂丝海棠，其为蔷薇科植物垂丝海棠Malushalliana花。本发明从垂丝海棠花提取获得各部位，且从60%甲醇部位中进一步分离得到四个化合物，并对垂丝海棠花各部位和活性化合物的体外抗凝血效果进行考察。结果表明：垂丝海棠花各部位和化合物1－4均具有良好的抗凝血效果，且垂丝海棠花总浸膏抗凝血效果比灯盏花素好。可见，它们可以单独或组合用于抗凝血剂。
附图说明
图1为垂丝海棠花活性化合物中化合物1－4的结构式；
图2为凝血机制图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
下述实施例中所用垂丝海棠花采集于河南大学金明校区，为蔷薇科苹果属植物垂丝海棠Malushalliana花。
实施例1垂丝海棠花提取物及活性化合物的提取分离
一种垂丝海棠提取物的制备方法，其以垂丝海棠花为原料，将阴干的垂丝海棠花用70V%乙醇浸渍提取3次，每次3d，提取液合并、过滤、浓缩得到垂丝海棠花总浸膏。取部分垂丝海棠花总浸膏用甲醇溶解，D-101型大孔树脂柱色谱分离，依次用水、20V%甲醇、40V%甲醇、60V%甲醇、甲醇梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱5个柱体积，每个柱体积2000mL，浓缩，分别得到水部位浸膏、20%甲醇部位浸膏、40%甲醇部位浸膏、60%甲醇部位浸膏、甲醇部位浸膏。
一种从60%甲醇部位浸膏中分离垂丝海棠活性化合物的方法，具体为：将上述的60%甲醇部位浸膏进行200－300目硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50的二氯甲烷乙酸乙酯混合液、以及体积比为10:0、9:1、8:2的二氯甲烷甲醇混合液进行梯度洗脱，薄层色谱进行检测，相同成分合并，共得到11个组分；其中的第4组分经过反复的硅胶柱色谱和凝胶柱色谱分离得到化合物1、2和4；其中的第6组分经过中压制备高效液相色谱、硅胶柱色谱、SephadexLH-20凝胶柱色谱分离得到化合物3。
运用多种谱学技术鉴定化合物1、2、3和4的结构，结果如下：
宝藿苷Ⅱ（1）:黄色结晶(甲醇)，mp156~158o。1H-NMR(CD3OH,400Hz)δ：0.77(3H,d,J=4Hz,rha-Me)，5.70(1H,s,rha-1)，1.37(3H,s,H-5")，1.44(3H,s,H-4")，4.51(1H,d,J=4Hz,H-2")，3.29(2H,s,H-1")，6.37(1H,s,H-6)，6.92(2H,d,J=8Hz,H-3',5')，7.78(2H,d,J=8Hz,H-2',6')；13C-NMR(CD3OH,100Hz)δ：159.3(C-2)，135.4(C-3)，179.5(C-4)，163.2(C-5)，95.0(C-6)，165.9(C-7)，105.9(C-8)，158.6(C-9)，99.9(C-10)，122.6(C-1')，131.9(C-2',6')，116.5(C-3',5')，161.7(C-4')，99.7(rha-1)，74.7(rha-2)，77.2(rha-3)，79.5(rha-4)，69.5(rha-5)，17.0(rha-6)，26.5(C-1")，110.3(C-2")，131.9(C-3")，28.3(C-4")，17.0(C-5")。
山奈酚-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷（2）：浅黄色粉末，溶于甲醇，mp230~231℃。EI-MSm/z：419[M+1]+。1H-NMR(DMSO-d6,400Hz)δ：5.59，5.35，4.74，4.14，3.61，3.28，3.16（糖的-CH和-OH信号），6.20（1H,d,J=4Hz,H-6），6.45(1H,d,J=4Hz,H-8)，6.88(2H,d,J=8.0Hz,H-3′,5′)，8.00(2H,d,J=8.0Hz,H-2′,6′)，12.62(1H,s,5-OH)；13C-NMR(DMSO-d6,100Hz)δ：156.6(C-2)，133.6(C-3)，177.9(C-4)，157.1(C-5)，98.9(C-6)，164.5(C-7)，94.0(C-8)，161.4(C-9)，104.2(C-10)，120.9(C-1′)，131.0(C-2′,6′)，115.7(C-3′,5′)，160.1(C-4′)，108.3(C-1′′)，82.3(C-2′′)，77.3(C-3′′)，86.5(C-4′′)，61.0(C-5′′)。
根皮素-4'-O-葡萄糖苷（3）：白色针晶，溶于甲醇，mp128~130℃。1H-NMR(CD3OH,400Hz)δ：3.34(2H,t,J=4Hz,H-α)，2.91(2H,t,J=8Hz,H-β)，7.08(2H,d,J=8Hz,H-2,6)，6.71(2H,d,J=8Hz,H-3,5)，5.99(1H,d,J=4Hz,H-3')，6.21(1H,d,J=4Hz,H-5')，5.06(1H,d,J=8Hz,Glc-1)；13C-NMR(CD3OH,100Hz)δ：206.6(C=O)，46.9(C-α)，30.8(C-β)，133.9(C-1)，130.4(C-2,6)，116.1(C-3,5)，156.3(C-4)，106.9(C-1')，165.9(C-2')，98.4(C-3')，167.5(C-4')，95.5(C-5')，162.3(C-6')，102.1(Glc-1)，74.7(Glc-2)，78.4(Glc-3)，71.2(Glc-4)，78.4(Glc-5)，62.5(Glc-6)。
山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷（4）：黄色结晶（甲醇），mp172~174o。1H-NMR(CD3OH,400Hz)δ：7.81(2H,d,J=8Hz,H-2',6')，6.98(2H,d,J=8Hz,H-3',5')，6.42(1H,d,J=4Hz,H-8)，6.24(1H,d,H-6)，5.41(1H,d,H-1")，4.59,4.26,3.75,3.35(m,糖上质子)，0.96(3H,d,J=4Hz,CH3-6")；13C-NMR(CD3OH,100Hz)δ：158.6(C-2)，136.2(C-3)，179.6(C-4)，163.2(C-5)，99.9(C-6)，165.9(C-7)，94.8(C-8)，159.3(C-9)，106.0(C-10)，122.7(C-1')，131.9(C-2')，116.6(C-3')，161.6(C-4')，116.6(C-5')，131.9(C-6')，103.5(C-1")，72.0(C-2")，73.2(C-3")，72.0(C-4")，72.2(C-5")，17.6(C-6")。
实施例2垂丝海棠花提取物及活性化合物的抗凝血试验
方法：家兔体外血浆凝血四项检测
仪器和材料：TGL-16gR高速台式冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；LRH-150生化培养箱（上海一恒科技有限公司）；氯化钠注射液（河北天成药业股份有限公司，A14091701）；0.109mol/L枸橼酸钠溶液（自制）、注射用灯盏花素（湖南恒生制药有限公司，20110202）；凝血酶原时间（PT）测定试剂盒（105241）、活化部分凝血酶时间（APTT）测定试剂盒（112175）、凝血酶时间（TT）测定试剂盒（121132）、纤维蛋白原（FIB）含量测定试剂盒（1320701）均由上海太阳生物技术有限公司生产。
实验动物：獭兔，雄性，体重2.0～2.5kg，由河南大学药学院中药研究所提供（医动字14-2-6号）。
样品溶液配制：
提取物类：取3mg浸膏用200μL溶剂（DMSO:吐温80:生理盐水=2:1:17）溶解，制得15mg/mL溶液；
活性化合物类：取1mg化合物用200μL溶剂（DMSO:吐温80:生理盐水=2:1:17）溶解，制得5mg/mL溶液；
取灯盏花素8mg用600μL溶剂（DMSO:吐温80:生理盐水=2:1:17）溶解，制得13.33mg/mL溶液。
实验方法：
(1)对APTT影响的检测方法
血浆的制备：家兔耳缘静脉取血3.6mL，置于含有0.109mol/L枸橼酸钠400μL的4mL离心管中，轻轻颠倒混匀，3000rpm离心15min，取上层清液，备用。
在测试杯中加入20μL样品溶液，再加入100μL血浆和37℃预温的APTT试剂100μL，37℃孵育5min后加入37℃预温的0.025mol/LCaCl2溶液100μL，记录凝固时间。
(2)对PT影响的检测方法
血浆的制备方法同(1)。在测试杯中加入20μL的样品溶液，再加入100μL的血浆，37℃孵育3min后加入37℃预温的PT试剂200μL，记录凝固试剂，即为PT值。
(3)对TT影响的检测方法
血浆的制备方法同(1)。在测试杯中加入40μL样品溶液和200μL的血浆，孵育3min后加入TT试剂200μL，记录凝固时间。
(4)对FIB影响的检测方法
血浆的制备方法同(1)。按照试剂说明书定标准曲线。取200μL血浆和100μL样品，然后加入700μL缓冲液。混匀后，取稀释后的血浆200μL，37℃预温3min，加入凝血酶溶液100μL，记录纤维蛋白原的含量。
数据处理：结果采用算术平均值和标准差表示，数值统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析法(One-WayANOVA)比较其显著性差异。测定结果见表1。
表1垂丝海棠花提取物和活性化合物对兔凝血时间的影响(，n=4)
注：与空白组相比：***P＜0.001，0.001<**p<0.01，0.01<*p<0.05.
与灯盏花素组相比：###P<0.001，0.001<##p<0.01，0.01<#p<0.05.
与空白组相比，垂丝海棠花提取物（即不同部位的浸膏）和化合物1－3的抗凝血效果有极显著差异（P＜0.001）；化合物4的抗凝血效果有非常显著性差异（0.001<p<0.01）。与阳性对照灯盏花素相比，垂丝海棠花总浸膏抗凝血活性较好，结果具有极显著性差异（P＜0.001）。

Claims (7)

1.一种垂丝海棠提取物的制备方法，其特征在于，以垂丝海棠花为原料，将阴干的垂丝海棠花用70%乙醇浸渍提取2－4次，每次2－4d，提取液浓缩得到垂丝海棠花总浸膏；将垂丝海棠花总浸膏用甲醇溶解，D-101型大孔树脂拌样、装柱，依次用水、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、甲醇梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱5个柱体积，每个柱体积2000mL，浓缩，分别得到水部位浸膏、20%甲醇部位浸膏、40%甲醇部位浸膏、60%甲醇部位浸膏、甲醇部位浸膏；垂丝海棠提取物即为垂丝海棠花总浸膏、40%甲醇部位浸膏、60%甲醇部位浸膏和甲醇部位浸膏中的一种或两种以上的混合物。
2.一种从60%甲醇部位浸膏中分离垂丝海棠活性化合物的方法，其特征在于，将权利要求1所述的60%甲醇部位浸膏进行200－300目硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50的二氯甲烷乙酸乙酯混合液、以及体积比为10:0、9:1、8:2的二氯甲烷甲醇混合液进行梯度洗脱，薄层色谱进行检测，相同成分合并，共得到11个组分；其中的第4组分经过反复的硅胶柱色谱和凝胶柱色谱分离得到化合物1、2和4；其中的第6组分经过中压制备液相色谱、硅胶柱色谱、SephadexLH-20凝胶柱色谱分离得到化合物3；垂丝海棠花活性化合物即为化合物1、2、3和4中的一种或两种以上的混合物。
3.采用权利要求1所述方法制备得到的垂丝海棠提取物。
4.采用权利要求2所述方法制备得到的垂丝海棠活性化合物。
5.权利要求3所述垂丝海棠提取物在制备抗凝血药物方面的应用。
6.权利要求4所述垂丝海棠活性化合物在制备抗凝血药物方面的应用。
7.权利要求3所述垂丝海棠提取物和权利要求4所述垂丝海棠活性化合物联合使用用于制备抗凝血药物。
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