CN105131075B - 一种促凝血黑莓籽有效成分及其提取分离方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种促凝血黑莓籽有效成分及其提取分离方法、应用。本发明采用特殊的方法从黑莓籽的乙酸乙酯部位中分离得到蔷薇酸，并对其体外促凝血效果的考察，结果表明，蔷薇酸具有良好的促凝血效果，可以用于制备促凝血剂。
Description
技术领域
本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种促凝血黑莓籽有效成分及其提取分离方法、应用。
背景技术
黑莓Rubusspp.Blackberry为蔷薇科悬钩子属聚合果类植物，未作药用，是世界上新兴的4种小果类果树之一。原产北美，其果实酸甜可口，具有很高的营养价值和药用价值，除鲜食外还大部分制成速冻果、果汁、果酒和果酱等食品。文献检索发现对黑莓研究主要集中在果实挥发油、黑莓籽油脂肪酸成分和黑莓叶、种子中黄酮、花色苷及维生素E含量分析方面。
黑莓籽是黑莓果酒、黑莓汁等加工产品的副产物，含有约27.14%的功能性油脂，其中不饱和脂肪酸总量高达93.55%，此外还有人体必需的氨基酸，在对抗动脉粥样硬化、抗糖尿病、免疫调节、促进生长和智力发育等方面具有重要的作用。
血液凝固简称凝血，是在内源性或(和)外源性凝血途径下产生凝血酶原激活物，凝血酶原激活物在凝血因子的作用下产生凝血酶，最后凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，血液由溶胶状态转变为凝胶状态。凝血过程通常分为：①内源性凝血途径；②外源性凝血途径；③共同凝血途径。外源性凝血途径是从组织因子暴露于血液而启动，到因子X被激活的过程；临床上以凝血酶原时间(PT)测定来反映外源性凝血途径的状况。内源性凝血途径是指从因子XII激活，到因子X激活的过程；临床上以活化部分凝血活酶时间(APTT)来反映体内内源性凝血途径的状况。从因子X被激活至纤维蛋白形成，是内、外源共同凝血途径；主要包括凝血酶生成和纤维蛋白形成两个阶段。
机体凝血系统包括凝血和抗凝两个方面，两者间的动态平衡是正常机体维持体内血液流动状态和防止血液丢失的关键。促凝血药是一些通过加速血液凝固过程或阻止纤维蛋白溶解作用而起到止血效果的药物，其主要通过增强体内凝血因素或抑制抗凝血因素，促使凝血，以达到凝血目的，用于治疗各种出血疾病以及创伤性出血等。
目前尚无蔷薇酸对家兔体外血浆凝血四项影响的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促凝血黑莓籽有效成分，同时提供一种促凝血黑莓籽有效成分的提取分离方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种促凝血黑莓籽有效成分的提取分离方法，包括以下步骤：1）以黑莓籽为原料，黑莓籽破碎后，用石油醚浸提（浸提3-4次，每次3d），石油醚浸提液合并挥干石油醚后，加入70 %乙醇浸提（浸提3次，每次3d），乙醇浸提液合并、过滤、浓缩得乙醇总浸膏，依次用溶剂石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位；
2）乙酸乙酯部位进行200~300目硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，体积比例为100:0~1:1，以TLC薄层色谱检测合并，得到6个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分1-6（极性判断时所用体系为石油醚-乙酸乙酯），组分1经反复硅胶H、SephadexLH-20柱色谱得到蔷薇酸，蔷薇酸即为促凝血黑莓籽有效成分。
按照以上提取分离方法得到的促凝血黑莓籽有效成分。
促凝血黑莓籽有效成分在制备促凝血药物方面的应用。
化合物蔷薇酸的结构如下：
。
本发明采用特殊的方法从黑莓籽的乙酸乙酯部位中分离得到蔷薇酸，并对其体外促凝血效果的考察，结果表明，蔷薇酸具有良好的促凝血效果，可以用于促凝血剂。
附图说明
图1为效果实验时的凝血机制图。
具体实施方式
实施例1
黑莓籽购于河南省封丘县黑莓种植基地，为蔷薇科悬钩子属植物黑莓Rubusspp.Blackberry籽。
本文中的乙醇浓度均为体积浓度。
活性化合物的提取分离方法：
(1)黑莓籽破碎后，先用石油醚浸提4次，每次3 d，挥干石油醚后，加入70 v%乙醇浸提3次，每次3 d，浸提液合并、过滤、浓缩得乙醇总浸膏，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位；
2）乙酸乙酯部位进行200~300目硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱（体积比例为100:0~1:1），以TLC薄层色谱检测合并，得到6个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分1-6，组分1经反复硅胶H、Sephadex LH-20柱色谱得到蔷薇酸，蔷薇酸即为促凝血黑莓籽有效成分。
运用多种谱学技术鉴定结构如下：
蔷薇酸:白色粉末，C30H48O5，EI-MSm/z: 488[M]＋。1H-NMR (CD3OD,400 MHZ) δ:0.83, 0.91, 1.03, 1.03, 1.24, 1.39 (3H×6, s, CH3-24, 26, 23, 25, 27), 0.97(3H, d, J=4.4 Hz, H-30), 2.54 (1H, s, H-18),3.36 (1H, m, H-3), 5.34 (1H, brs,H-12). 13C-NMR (CD3OD,100 MHZ)δ: 42.5 (C-1), 67.2 (C-2), 80.1 (C-3), 39.4 (C-4), 49.0 (C-5), 19.3 (C-6), 34.1 (C-7), 41.3 (C-8), 48.2 (C-9), 39.5 (C-10),24.7 (C-11), 129.4 (C-12), 140.1 (C-13), 43.1 (C-14), 29.2 (C-15), 27.1 (C-16), 49.3 (C-17), 55.1 (C-18), 73.6 (C-19), 42.7 (C-20), 27.1 (C-21), 39.5(C-22), 29.2 (C-23), 22.6 (C-24), 16.6 (C-25), 17.6 (C-26), 24.9 (C-27),182.2 (C-28), 27.1 (C-29), 16.9 (C-30)。
蔷薇酸的促凝血效果实验：
方法：家兔体外血浆凝血四项检测（凝血机制图见图1）
仪器和材料：TGL-16gR高速台式冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）； LRH-150生化培养箱(上海一恒科技有限公司)；氯化钠注射液（河北天成药业股份有限公司，A14091701）；0.109 mol/L枸橼酸钠溶液（自制）、维生素K1注射液(天津药业集团新郑股份有限公司，1403112)；注射用灯盏花素(湖南恒生制药有限公司，20110202)；凝血酶原时间（PT）测定试剂盒（105241）；活化部分凝血酶时间（APTT）测定试剂盒（112175）；凝血酶时间（TT）测定试剂盒（121132）；纤维蛋白原（FIB）含量测定试剂盒（1320701）均由上海太阳生物技术有限公司生产。
实验动物：獭兔，雄性，体重2.0～2.5 kg，由河南大学药学院中药研究所提供(医动字14-2-6号)。
样品溶液配制：分别取化合物1-6（1 mg）用80 μL溶剂溶解制12.5 mg/mL溶液。取灯盏花素8 mg用240μL溶剂溶解制得33.33 mg/mL溶液，维生素K1注射液用溶剂溶解制得维生素K1浓度12.5 mg/mL的溶液。溶剂为：DMSO:1,2-丙二醇=3:2（体积比）。
实验方法：
(1)对APTT影响的检测方法
血浆的制备：家兔耳缘静脉取血3.6 mL，置于含有0.109 mol/L枸橼酸钠400 μL的4 mL离心管中，轻轻颠倒混匀，3000 rpm离心15 min，取上层清液备用。
在测试杯中加入20 μL样品溶液，再加入100 μL血浆和37 ℃预温的APTT试剂100μL，37 ℃孵育5 min后加入37℃预温的0.025 mol/L CaCl2溶液100 μL，记录凝固时间。
(2) 对PT影响的检测方法
血浆制备方法同(1)，在测试杯中加入20 μL的样品溶液，再加入100 μL的血浆，37℃孵育3 min后加入37 ℃预温的PT试剂200 μL，记录凝固时间，即为PT值。
(3) 对TT影响的检测方法
血浆制备方法同(1)，在测试杯中加入40 μL样品溶液和200 μL的血浆，孵育3min后加入TT试剂200 μL，记录凝固时间，即为TT值。
(4) 对FIB影响的检测方法
血浆制备方法同(1)，按照试剂说明书定标准曲线，取200 μL血浆和100 μL样品，然后加入700 μL缓冲液。混匀后，取稀释后的血浆200 μL，37℃预温3 min，加入凝血酶溶液100 μL，测定凝固时间，记录纤维蛋白原的含量。
数据处理：结果采用算术平均值和标准差表示，数值统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析法(One-Way ANOVA)比较其显著性差异。测定结果见表1。
表1 黑莓籽化合物对家兔凝血时间的影响(±s)
注：与空白组相比： △△△P＜0.001.
与灯盏花素组相比：*P>0.05
与维生素K1组相比： 0.001<##P＜0.01,###P＜0.001.
与空白组相比，蔷薇酸促凝血效果有极显著差异（P＜0.001），说明本发明从黑莓籽中分离得到的蔷薇酸具有良好的促凝血效果，可用于促凝血剂。
Claims (2)
1.一种促凝血黑莓籽有效成分的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：1）以黑莓籽为原料，黑莓籽破碎后，用石油醚浸提，石油醚浸提液合并、挥干石油醚后，加入70 %乙醇浸提，乙醇浸提液合并、过滤、浓缩得乙醇总浸膏，依次用溶剂石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位；
2）乙酸乙酯部位进行200~300目硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，体积比例为100:0~1:1，以TLC薄层色谱检测合并，得到6个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分1-6，组分1经反复硅胶H、Sephadex LH-20柱色谱得到蔷薇酸，蔷薇酸即为促凝血黑莓籽有效成分。
2.一种权利要求1所述的促凝血黑莓籽有效成分在制备促凝血药物方面的应用。
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