CN103041176A - 见血清提取物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种见血清乙醇提取物、乙醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水相提取物以及包括乙醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水相提取物活性成分的提取物，本发明还公开了上述见血清提取物的用途。本发明提供的见血清提取物均具有良好的止血活性，可广泛用于治疗体内、外出血及手术出血。

Description

见血清提取物及其用途

技术领域

本发明涉及见血清提取物及其用途。

背景技术

见血清为兰科植物脉羊耳兰Liparis nervosa (Thunb.) Lindl.的全草，又称“立地好”、“黑兰”、“矮胖儿”，性寒，味苦，凉血止血、清热解毒。见血清常生长在山野、溪边等阴湿处，分布于四川、湖北、台湾等地，目前民间用药材均为野生。

迄今，国内外对见血清的研究报道较少，文献记载也不够详尽。在对见血清的止血研究上，周继铭等使用见血清与其他药材进行组方，发现复方见血清止血药对临床14类54例手术切口有显著止血效果，药物能被机体吸收，无继发性出血，伤口快速愈合（周继铭,刘常五,冉崇行等.复方见血清外用止血药的初步研究[J].中国医院药学杂志,1983,3(3):101-2.）。

目前，还未见有见血清有效部位和活性成分的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种见血清提取物，以及该提取物的用途。

本发明提供了一种见血清乙醇提取物，它是由如下方法制成：取见血清药材，将其粉碎后用60~95%的乙醇提取，提取液回收溶剂后，即得见血清乙醇提取物。

上述提取方法包括冷浸、回流、超声或微波提取。

本发明还提供了一种见血清乙醚提取物，它是由如下方法制成：取上述见血清乙醇提取物，加水混悬后依次用石油醚、乙醚萃取，取乙醚萃取液，回收溶剂后，即得见血清乙醚提取物。将乙醚提取物经过反复硅胶柱层析，采用不同比例的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，石油醚:乙酸乙酯（30:1）得到ß-谷甾醇，石油醚:乙酸乙酯（20：1）得到木栓酮，石油醚:乙酸乙酯（10:1）得到乙酰胺。

本发明还提供了一种见血清乙酸乙酯提取物，它是由如下方法制成：取上述见血清乙醇提取物，加水混悬后依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取液，回收溶剂后，即得见血清乙酸乙酯提取物。

本发明还提供了一种见血清正丁醇提取物，它是由如下方法制成：取上述见血清乙醇提取物，加水混悬后依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取正丁醇萃取液，回收溶剂后，即得见血清正丁醇提取物。将正丁醇提取物加入蒸馏水后上D101大孔吸附树脂，用包括浓度为60%的乙醇进行梯度洗脱，回收60%部位浸膏，然后通过硅胶短柱层析，分别以不同比例的氯仿-甲醇梯度洗脱，氯仿：甲醇（15:1）得到3,5-二(3-甲基-2-丁烯)苯甲酸-4-O-β-D-吡喃木糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷，氯仿：甲醇（10:1）得到腺苷。

本发明还提供了一种见血清水相提取物，它是由如下方法制成：取上述见血清乙醇提取物，加水混悬后依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将萃余液浓缩后，即得见血清水相提取物。

本发明还提供了上述的见血清提取物在制备止血药物中的应用。

本发明提供的见血清乙醇提取物、乙醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水相提取物或其混合物加上药学上可接受的载体形成组合物。

本发明所提供的见血清提取物均具有良好的止血活性，可广泛用于治疗体内、外出血及手术出血。

具体实施方式

实施例1 见血清乙醇提取物的制备

取见血清药材，将其粉碎后加入85%的乙醇回流提取2次，每次3h，每次加入药材10倍量（W/V）的乙醇，趁热过滤，合并滤液，回收至无醇味后干燥，即制得见血清乙醇提取物。

上述用乙醇提取时还可采用冷浸、回流、超声或微波提取。

实施例2 见血清各有效部位的制备

取实施例1制备的见血清乙醇提取物，加水混悬后，依次用等体积的石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每种溶剂萃取3次，分别收集石油醚萃取液、乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液以及萃余液，回收溶剂后，60℃减压干燥，分别得到见血清石油醚部位、乙醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水相部位。

将见血清乙醚提取物经过反复硅胶柱层析，以不同比例的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，石油醚:乙酸乙酯（30:1）得到化合物（1），石油醚:乙酸乙酯（20：1）得到化合物（2），石油醚:乙酸乙酯（10:1）得到化合物（3）, 应用多种光谱及波普技术(IR,UV,MS,NMR)对化合物（1）、化合物（2）和化合物（3）进行结构鉴定，确定化合物（1）为ß-谷甾醇，化合物（2）为木栓酮，化合物（3）为乙酰胺。化合物（1）、化合物（2）和化合物（3）的结构式如下：

将见血清正丁醇提取物提取物加入等体积蒸馏水后上D101大孔吸附树脂，分别用3倍柱体积的浓度为0%、30%、60%、90%的乙醇进行梯度洗脱，回收60%部位浸膏，再通过硅胶短柱反复层析，以不同比例的氯仿-甲醇梯度洗脱，氯仿：甲醇（15:1）得到化合物（4），氯仿：甲醇（10:1）得到化合物（5），应用多种光谱及波普技术(IR,UV,MS,NMR)对化合物（4）和化合物（5）进行结构鉴定，确定化合物（4）为3,5-二(3-甲基-2-丁烯)苯甲酸-4-O-β-D-吡喃木糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷，其分子式为C₂₈H₄₀O₁₂，化合物（5）为腺苷。化合物（4）和化合物（5）的化学结构式如下：

以下通过药效实验具体说明本发明提取物的有益效果。

试验例1 见血清乙醇提取物止血作用的研究

1 实验材料

1.1药品和试剂

见血清购买于成都荷花池中药材市场（经成都大学陈封政教授鉴定），云南白药，95%乙醇为分析纯。

1.2动物

清洁级昆明种小鼠，体重(20±2g)。由四川省医学科学院实验动物研究所提供，动物合格证号：SCXK（川）2010-12。

2实验方法

2.1供试品的制备

取实施例1制备的乙醇提取物放入研钵中加入适量0.5%CMC-Na溶液，研磨均匀，再加入适量蒸馏水配制成含生药0.1g/ml的悬浊液。

2.2 对凝血时间的影响

2.2.1 毛细玻管法

取正常体重(20±2g)小鼠40只，雌雄各半，称重、标记、随机分为4组。灌胃给药，每日1次，连续7天。末次给药30min后，用毛细玻管插入小鼠内眦眼球后静脉丛取血，以达5cm血柱为止。每隔30s折断毛细玻管一小截，检查有无血凝丝出现。记录从毛细玻管采血到出现血凝丝的时间，此即为凝血时间。作均数显著性测验。

表1 见血清乙醇提取物对凝血时间的影响(毛细玻管法)

(注：与空白组比较，**P<0.01，*P<0.05)

2.2.2 玻片法

见血清乙醇提取物取正常体重(20±2g)小鼠40只，雌雄各半，称重、标记、随机分为4组。灌胃给药，每日1次，连续7天。末次给药30min后，用眼科弯镊迅速摘取一侧眼球，即有血液流出。于载玻片两端各滴一滴血，血滴直径约为5mm，立即用秒表计时。每隔30s用清洁大头针自血滴边缘向里轻轻挑动一次，并观察有无血丝挑起。从采血开始至挑起血丝止，所历时间即为凝血时间。另一滴血供最后复验。记录凝血时间，作均数显著性测验。结果见表2。

表2 见血清乙醇提取物对凝血时间的影响(玻片法)

(注：与空白组比较，**P<0.01，*P<0.05)

结果表明：与空白对照组相比，见血清乙醇提取物对小鼠的凝血时间的影响具有统计学意义，并且与云南白药止血效果接近。

2.3 对出血时间的影响(剪尾法)

取正常体重(20±2g)小鼠40只，雌雄各半，称重、标记、随机分为4组。灌胃给药，每日1次，连续7天。末次给药30min后，将小鼠趋入固定器中，露鼠尾于外，用剪刀剪去尾尖约3rnm，待血液自行溢出。每隔30s用滤纸轻轻吸取血滴，以人工形成创面到出血停止所经时间为出血时间。记录出血时间，作均数显著性测验。结果见表3。

表3 对出血时间的影响(剪尾法)

(注：与空白组比较，**P<0.01，*P<0.05)

结果表明：与空白对照组相比，见血清乙醇提取物对小鼠的出血时间及出血量的影响具有统计学意义，并且与云南白药止血效果接近。

试验例2 见血清不同极性部位对成年健康大鼠出凝血系统的影响

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF 等级 Wistar大鼠60只，体重200g～220g，雌雄各半，由北京华阜康科技股份有限责任公司提供，许可证号SCXK -(京)2009-0007。

1.2 实验试剂

水合氯醛：国药集团化学试剂有限公司提供；

枸橼酸钠（分析纯）：北京化学试剂公司提供；

4, 5-腺苷二磷酸二钠盐（ADP）：北京世帝科学仪器公司提供；

APTT、PT、TT、Fib 试剂盒：上海太阳生物技术有限公司提供；

云南白药胶囊：云南白药集团提供，批号20110904；

见血清药材购买于成都荷花池中药材市场（经成都大学陈封政教授鉴定）。

1.3 实验仪器及耗材

COALAD 1000(TECO)全自动血凝测试仪，Thermo IEC CL31RMultispeed台式离心机，JA2003型电子天平，10ml一次性注射器，10ml离心管，微量上样器，EP管，手术器械，凝血四项检测杯。

1.4 供试品制备

云南白药临床用量为2g，实验动物按临床用量20倍给药, 即0.667g/kg。取云南白药胶囊粉末6.67g 加入生理盐水100mL研磨均匀即得云南白药供试品。

见血清药材购自四川成都, 经成都大学中药化学实验室陈封政教授鉴定为兰科羊耳兰属植物羊耳兰Liparis nervosa (Thunb.) Lindl.的干燥全草。

取实施例2制备的见血清各有效部位。乙醚部位水溶性低，将该提取物放入研钵中加入适量0.5%CMC-Na溶液，研磨均匀，再加入适量蒸馏水配制成含生药0.2g/ml的悬浊液。乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物及水相部位分别加入少量蒸馏水研磨均匀后，再加入适量蒸馏水配制成含生药量0.2g/ml的悬浊液。

2 实验方法

2.1 实验分组

大鼠70只，雌雄各半，随机分为见血清石油醚提部位组、见血清乙醚提部位组、见血清乙酸乙酯提部位组、见血清正丁醇提部位组、见血清水相部位组、云南白药组和空白对照组6组，每组10只。各组大鼠灌胃给予相应药物，每日一次，连续5日。其中空白对照组给予等量体积生理盐水灌胃。

2.2血小板聚集功能的测定：

各组大鼠于末次给药1h后, 按腹腔内注射3.5%水合氯醛麻醉, 腹主动脉取血5.4mL，加入盛有枸橼酸钠（3.8%）溶液0.6mL的离心管内抗凝。以800rpm离心10min，取上层液即为富血小板血浆（PRP）；余下部分再以3000rpmin离心10min，取上清液即为贫血小板血浆（PPP）。按Born比浊法 测定血小板最大聚集率, 分别精密吸取各组PPP 和PRP各300μL加入测试杯中，PPP调透光率到100%，PRP在37 ℃预温槽中预热3min后，加入诱导剂ADP10μL(终浓度为5μmol/ L)检测5min, 记录浊度改变曲线及其最大聚集率( MAR%) 。

2.3凝血四项（PT、APTT、TT、Fib）的测定

各组大鼠于末次给药1h后, 按腹腔内注射3.5%水合氯醛麻醉, 腹主动脉取血5.4mL，加入盛有枸橼酸钠（3.8%）溶液0.6mL的离心管内抗凝，3000rpmin离心10min，按试剂盒操作说明检测各组大鼠凝血四项（PT、APTT、TT、Fib）。

2.4 统计分析

统计学处理使用SPSS 10.0统计软件包，组间分析采用方差分析 One-Way ANOVA，两组比较采用T- Test，结果表示为

。

3 实验结果

各组大鼠血小板聚集率、PT、APTT、TT、Fib水平的比较见表1。

表1 各组大鼠血小板聚集率、PT、APTT、TT、Fib水平的比较 X±SD n=10

（注：*与空白对照组比较P<0.01）

4.结论

在凝血四项检测中，APTT 检测内源性凝血系统，TT 检测血浆中纤维蛋白原转变为纤维蛋白的能力，PT 检测外源性凝血系统，Fib 检测纤维蛋白原含量，纤维蛋白原(Fib)即凝血因子Ⅰ。从表1可以看出凝血四项指标表明阳性药云南白药组、见血清乙醚提取部位组、乙酸乙酯提取部位组、正丁醇提取部位组、水相部位组在PT、APTT均与空白对照组有显著差异（P<0.01）；在TT上则上述各组均与空白对照组比较无统计学差异（P>0.05）；在FIB上仅阳性药云南白药组和正丁醇提取部位组与空白对照组比较有显著统计学差异（P<0.01），而其他提取部位组均与空白对照组比较无统计学差异（P>0.05）。见血清不同提取部位在对内源性、外源性凝血方面具有相似的作用，但作用间无显著差异。

在ADP诱导血小板聚集方面数据阳性药云南白药组、见血清水相部位组和正丁醇提取部位组与空白对照组比较均能显著促进血小板聚集，并显示显著差异（P<0.01）。

试验例3 见血清不同极性部位对成年健康大鼠纤溶系统的影响

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF 等级 Wistar大鼠49只，体重200g～220g，雌雄各半，由北京华阜康科技股份有限责任公司提供，许可证号SCXK -(京)2009-0007。

1.2 实验试剂

水合氯醛：国药集团化学试剂有限公司；

枸橼酸钠（分析纯）：北京化学试剂公司提供；

云南白药胶囊：云南白药集团提供，批号20110904

大鼠血管性假性血友病因子（vWF）ELISA检测试剂盒：北京鑫方程生物技术有限公司，批号201208

大鼠组织型纤维溶酶激活剂（t-PA）ELISA检测试剂盒：北京鑫方程生物技术有限公司，批号201208

大鼠纤溶酶原激活物抑制因子1（PAI-1）ELISA检测试剂盒：北京鑫方程生物技术有限公司，批号201208

大鼠组织因子（TF）ELISA检测试剂盒：北京鑫方程生物技术有限公司，批号201208

大鼠组织因子途径抑制物(TFPI) ELISA检测试剂盒：北京鑫方程生物技术有限公司，批号201208

见血清药材经成都大学陈封政教授鉴定。

1.3 实验仪器及耗材

COALAD 1000(TECO)全自动血凝测试仪，Thermo IEC CL31RMultispeed台式离心机，JA2003型电子天平。10ml一次性注射器，10ml离心管，微量上样器，EP管，手术器械。

1.4 供试品制备

云南白药临床用量为2g, 实验动物按临床用量20倍给药, 即0.667g/kg。取云南白药胶囊粉末6.67g 加入生理盐水100mL研磨均匀即得云南白药供试品。

取实施例2制备的见血清各有效部位。石油醚、乙醚部位水溶性低，将该提取物放入研钵中加入适量0.5%CMC-Na溶液，研磨均匀，再加入适量蒸馏水配制成含生药0.2g/ml悬浊液。乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物及水相部位分别加入少量蒸馏水研磨均匀后，再加入适量蒸馏水配制成含生药量0.2g/ml悬浊液。

2 实验方法

2.1 实验分组

大鼠49只，雌雄各半，随机分组，每组7只。各组大鼠按4g生药/kg灌胃给予相应药物，每日一次，连续5日。其中空白对照组给予等量体积生理盐水灌胃。

2.2 各组大鼠血浆ELISA的测定

各组大鼠于末次给药1h后, 按腹腔内注射3.5%水合氯醛麻醉, 腹主动脉取血，血液标本以3.8％枸橼酸钠1:9抗凝，3000rpmin离心10min，按ELISA试剂盒操作说明分别检测各组大鼠血浆vWF、t-PA、PAI-1、TF、TFPI含量。

2.4 统计分析

TF变化率=（空白对照组血TF值-给药组血浆TF值）/空白对照组血浆TF值

TFPI变化率=（空白对照组血浆TFPI值-给药组血浆TFPI值）/空白对照组血浆TFPI值

统计学处理使用SPSS 10.0统计软件包，组间分析采用方差分析 One-Way ANOVA，两组比较采用T- Test，结果表示为均数±标准差。

3 实验结果

各组大鼠血浆vWF、t-PA、PAI-1、TF、TFPI水平的比较见表1。

表1 各组大鼠血浆vWF、t-PA、PAI-1水平的比较（ng/L,

）

（注：*与空白对照组比较P<0.01）

表2 各组大鼠血浆TF、TFPI水平的比较（ng/L，

）

(注：*与空白对照组比较P<0.01)

4 结果分析

内皮细胞受损是血栓形成的始动环节，损伤的内皮细胞产生物质可通过不同途径参与血栓形成。血栓形成是在血管内皮、血小板、凝血、抗凝血、纤溶系统以及血液学等多种因素改变的综合作用下发生的。

4.1见血清不同提取部位对血管性假性血友病因子（vWF）的影响

血管性假性血友病因子（von Willebrand Factor；vWF）是初期止血中支持血小板粘附的重要因素，参与凝血和血小板黏附过程，是反映血管壁损伤的特异指标之一。

本实验结果表明：见血清乙醚提取部位组、乙酸乙酯提取部位组与水相部位组与空白比较具有显著统计学差异（P<0.01）。说明见血清水相部位、乙酸乙酯提取部位及乙醚提取部位具有显著提高血浆中vWF含量的作用，正丁醇提取部位组对血浆中vWF含量的影响较小，石油醚部位组无此作用。

4.2见血清不同提取部位对组织型纤维溶酶激活剂（t-PA）和纤溶酶原激活物抑制因子1（PAI-1）的影响

组织型纤维溶酶激活剂（t-PA）和纤溶酶原激活物抑制因子1（PAI-1）是纤溶系统中重要的生理活性物质，二者间的平衡对维持血液纤溶系统功能正常非常重要。当血管内皮细胞受损后，PAI活性增高而使t-PA纤溶活性降低，从而有利于血栓或血栓前状态形成。

本实验结果表明：在对血浆中t-PA含量的影响方面，见血清乙醚提取部位组、水相部位组可显著降低血浆中t-PA含量，与空白对照组比较具有显著统计学差异（P<0.01）。

在对血浆中PAI-1含量的影响方面，见血清乙醚提取部位、乙酸乙酯提取部位、正丁醇提取部位和水相部位组、及均可升高血浆中PAI-1含量，与空白对照组比较具有显著统计学差异（P<0.01）。石油醚部位组无此作用。

4.3见血清不同提取部位对组织因子（TF）和组织因子途径抑制物（TFPI）的影响

组织因子（TF）即凝血Ⅲ因子，在正常情况下，血管内的大多数细胞并不表达TF，只有内皮细胞和单核细胞微量地表达TF，但在受到炎性因子等刺激时，可大量表达TF，从而促进血液高凝和血栓形成的发生。TFPI是TF内源性抑制因子，可特异性抑制TF介导的血栓形成过程。近年来发现TF途径被过度激活和/或TFPI活性降低均可引起高凝状态，从而使机体更易形成血栓。

本实验结果表明：在对血浆中TF含量的影响方面，见血清水相部位组、乙酸乙酯提取部位组、乙醚提取部位组可降低血浆中TF含量，与空白对照组比较具有显著统计学差异（P<0.01），可能与该药“止血不留瘀”的功效有关。

在对血浆中TFPI含量的影响方面，见血清水相部位组、乙酸乙酯提取部位组、正丁醇提取部位组、乙醚提取部位组均可显著降低血浆中TFPI含量，与空白对照组比较具有显著统计学差异（P<0.01）。说明除石油醚组以外，各组均可对血浆中TFPI具有明确地抑制作用，TFPI活性降低引起血液的高凝状态，有利于血栓的形成。

从上述见血清止血活性筛选及作用机制研究发现，见血清各提取部位中除石油醚部位以外，其他各提取物组在内源性、外源性凝血系统和纤溶系统中具有显著的与止血相关的作用。

Claims (6)

1.一种见血清乙醇提取物，其特征在于由如下方法制成：取见血清药材，将其粉碎后用60~95%的乙醇提取，提取液回收溶剂后，即得见血清乙醇提取物。

2.一种见血清乙醚提取物，其特征在于由如下方法制成：取权利要求1所述的见血清乙醇提取物，加水混悬后依次用石油醚、乙醚萃取，取乙醚萃取液，回收溶剂后，即得见血清乙醚提取物。

3.一种见血清乙酸乙酯提取物，其特征在于由如下方法制成：取权利要求1所述的见血清乙醇提取物，加水混悬后依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取液，回收溶剂后，即得见血清乙酸乙酯提取物。

4.一种见血清正丁醇提取物，其特征在于由如下方法制成：取权利要求1所述的见血清乙醇提取物，加水混悬后依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取正丁醇萃取液，回收溶剂后，即得见血清正丁醇提取物。

5.一种见血清水相提取物，其特征在于由如下方法制成：取权利要求1所述的见血清乙醇提取物，加水混悬后依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将萃余液浓缩后，即得见血清水相提取物。

6.权利要求1-5任意一项所述的见血清提取物在制备止血药物中的应用。