CN101239178A - 一种肽类化合物的抗血栓用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，是从皖南尖吻腹蛇中分离纯化的一种新的抗血栓的肽类化合物。结构式如上图，动物试验表明该化合物对大鼠动静脉旁路血栓形成有抑制作用，并且可以延长小鼠的凝血时间。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种肽类化合物的抗血栓用途。
背景技术
发明人在前期研究中从尖吻蝮蛇蛇毒中提取到了结构式I的肽类化合物：
其分子量是429Da。药理试验证明式I的肽类化合物(简称AAP)具有抗肿瘤的药效(公开于CN101058572A)。
发明内容
发明人药理试验研究发现，式I化合物不仅具有抗肿瘤功效，而且具有优异的抗血栓功能。
式I的肽类化合物可用以下方法制备：
1溶解：称取尖吻蝮蛇蛇毒2g，溶于400ml缓冲液(Tris-HCl pH 8.0 10mmol)中，充分溶解。
2超滤：10000rpm离心10min，取上清，10000Da滤膜超滤(400ml-200ml)，收集滤出液，冷冻干燥浓缩。
3阴离子交换分离纯化：采用SOURCE Q色谱介质，色谱柱先用平衡液(A液：10mmol Tris-HClpH 8.0)平衡后，将冷冻干燥后的浓缩液上样，上样后用平衡液洗出未吸附组分，然后用洗脱液(B液：10mmol Tris-HCl pH 8.0+0.5mol·ml-1 NaCl)进行梯度洗脱，程序为0％-100％B 30ml，流速0.8ml/min，检测波长为280nm。
4反相色谱纯化：收集上述分离的第2个组分，用反相色谱纯化。色谱柱为：RESOURCE RPC，用平衡液(A液：2％乙腈(含0.05％TFA))平衡后，上样，然后用洗脱液(B液：90％乙腈(含0.05％TFA))进行梯度洗脱，程序为0-100％B 20ml，流速为1ml/min，检测波长为280nm。
5收集主峰(峰1)，冷冻干燥，即得。
除了上述提取方法，还可用化学合成方法制备。
具体实施方式
实施例1
AAP抗凝作用：
1.玻片法测小鼠凝血时间
药物与试剂
受试药：AAP
溶剂：生理盐水
配制方法：将8mgAAP粉末溶于20ml生理盐水中配成高剂量浓度药物；将4mg粉末溶于20ml生理盐水中配成中剂量浓度药物；将2mg粉末溶于20ml生理盐水中配成低剂量浓度药物；
试验动物
小鼠32只，雌雄各半，18-22g。
试验方法与结果
将小鼠随机分为4组，每组雌雄各半，分别为空白对照组(给予等体积的生理盐水)，高剂量给药组(8mg/kg)，中剂量给药组(4mg/kg)和低剂量给药组(2mg/kg)。给药容积为0.4ml/20g，各组小鼠均尾静脉注射给药，连续给药4天，每天一次。最后一天给药后五分钟对小鼠进行眼眶取血(0.2ml左右)，并将血液滴于表面干净的盖玻片上，然后用一次性1ml注射器针头不断挑动血液，约三秒钟一次。规定自血液从眼眶流出到血液被挑出“细丝”的时间为凝血时间，记录每只小鼠凝血时间，并与空白对照组作组间t检验比较，见表1：
表1 AAP对玻片法小鼠凝血时间的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 凝血时间(s) |
| 空白对照组AAP | -842 | 19.6±8.2101.1±24.1**104.0±36.2**59.3±26.4**△△° |
**P＜0.01，与空白对照组比较；
△△P＜0.01，与AAP高剂量组(8mg/kg)比较；
°P＜0.05，与AAP中剂量组(4g/kg)比较。
结果表明，与空白组相比，高剂量给药组(8mg/kg)可明显延长小鼠的凝血时间，差异极其显著(p＜0.01)；中剂量给药组(4mg/kg)可明显延长小鼠的凝血时间，差异极其显著(p＜0.01)；低剂量给药组(2mg/kg)可明显延长小鼠的凝血时间，差异极其显著(p＜0.01)。低剂量组与高剂量组相比，小鼠的凝血时间较短，差异极其显著(p＜0.01)；低剂量组与中剂量组相比，小鼠的凝血时间较短，差异显著(p＜0.05)。由此可见，AAP三个剂量组可呈剂量依赖性的延长小鼠的凝血时间，具有抗凝血作用。
2.毛细玻管法测小鼠凝血时间及小鼠断尾法测出血时间
药物与试剂
(1)受试药：AAP
溶剂：生理盐水
配制方法：将8mgAAP粉末溶于20ml生理盐水中配成高剂量浓度药物；将4mgAAP粉末溶于20ml生理盐水中配成中剂量浓度药物；将2mgAAP粉末溶于20ml生理盐水中配成低剂量浓度药物；
(2)阳性药：低分子肝素钙(生产厂家：天津红日药业股份有限公司；产品批号：060107；规格：0.4ml：4100IU)
配制方法：取0.02ml(内含低分子肝素钙200IU)溶于生理盐水5ml配制成阳性药物的终浓液；
试验动物
小鼠60只，雌雄各半，18-22g。
试验方法与结果
将小鼠随机分为5组，每组雌雄各半，分别为空白对照组(给予等体积的生理盐水)，阳性对照组(800IU/kg)，高剂量给药组(8mg/kg)，中剂量给药组(4mg/kg)和低剂量给药组(2mg/kg)。给药容积为0.4ml/20g，各组小鼠均尾静脉注射给药，给药后五分钟，用长10cm、内径1mm的玻璃毛细管插入小鼠眼内眦后静脉丛中，深约4～5mm，轻轻转动，自血液流出开始计时，取出毛细管平放于桌上，每隔约10s折断两端约0.5cm，并缓慢向左右拉开，观察折断处出现凝血丝所需时间，即为凝血时间。以毫米尺测量鼠尾长度并标记之，血液自毛细玻管流出的同时，用手术剪将小鼠尾5mm处剪断，待血液自行溢出开始计时，每隔30s用滤纸吸去血滴1次，直到滤纸吸时无血(血液自然停止)为止，即为出血时间。室内温度为23℃。记录凝血时间及出血时间，并与空白对照组作组间t检验比较，结果见表2、表3：
表2 AAP对毛细玻管法小鼠凝血时间的影响
| 组别 | 剂量 | 凝血时间(s) |
| 空白对照组阳性对照组高剂量组中剂量组低剂量组 | -800IU/kg8mg/kg4mg/kg2mg/kg | 55.9±33.5745.5±322.9***101.1±34.9**98.3±47.3*96.7±32.9* |
***p＜0.001；**p＜0.01；*p＜0.05；均与空白对照组比较。
表3 AAP对小鼠出血时间的影响
| 组别 | 剂量 | 出血时间(min) |
| 空白对照组阳性对照组高剂量组中剂量组低剂量组 | -800IU/kg8mg/kg4mg/kg2mg/kg | 16.50±10.6738.69±22.55*20.79±13.69**23.99±10.5928.03±16.07 |
*p＜0.05与空白对照组比较；**p＜0.05与阳性对照组比较；
结果表明，与空白对照组相比，高剂量给药组(8mg/kg)可明显延长小鼠的凝血时间，差异具有显著性(p＜0.01)；中剂量给药组(4mg/kg)可延长小鼠的凝血时间，差异具有显著性(p＜0.05)；低剂量给药组(2mg/kg)可延长小鼠的凝血时间，差异具有显著性(p＜0.05)。由此可见，AAP的三个剂量组均可延长小鼠的凝血时间，具有抗凝血作用。各剂量组与阳性组比较，抗凝作用有明显差异，具有显著性(p＜0.001)。
与空白对照组相比，阳性药能明显延长小鼠的出血时间，差异具有显著性(p＜0.05)；AAP的三个剂量组均不会明显延长小鼠的出血时间，差异不具有显著性(p＞0.05)；高剂量组与阳性药比较，差异具有显著性(p＜0.05)。由此可见，AAP不会明显影响小鼠的出血时间。
试验结论
实验表明，高中低三个剂量组均可明显延长小鼠的凝血时间，具有抗凝血作用，但是不会同时延长小鼠的出血时间。与低分子量肝素比较，低分子量肝素虽然可以非常明显地延长小鼠的凝血时间，但是对出血时间的影响也比较明显。在临床使用的时候，低分子量肝素适应症比较少，安全范围也比较窄，因此很大程度上限制了其在临床上的使用。从这个方面来说，AAP具有明显的优势。
实施例2
抑制血栓形成作用：
对大鼠动静脉旁路血栓形成的影响：
药物与试剂
(1)受试药：AAP
溶剂：生理盐水
配制方法：将20mgAAP粉末溶于50ml生理盐水中配成高剂量浓度药物(4mg/kg)；将10mgAAP粉末溶于50ml生理盐水中配成中剂量浓度药物(2mg/kg)；将5mgAAP粉末溶于50ml生理盐水中配成低剂量浓度药物(1mg/kg)；
(2)阳性药：阿司匹林(生产厂家：南京白敬宇制药有限责任公司；产品批号：070518；规格：25mg/片)
配制方法：取25mg溶于生理盐水25ml配制成的终浓液(10mg/kg)；
阳性药：尿激酶(生产厂家：丽珠集团丽珠制药厂；产品批号：070301；规格：10万国际单位/瓶)
配制方法：先取5ml生理盐水注入瓶中，溶解后，取2ml稀释至40ml。
试验动物
SD大鼠60只，雌雄各半，240-280g。
试验方法与结果
将大鼠随机分为6组，每组雌雄各半，分别为空白对照组(给予等体积的生理盐水)，阿司匹林组(10ml/kg)，尿激酶组(1万单位/kg)，高剂量给药组(4mg/kg)，中剂量给药组(2mg/kg)和低剂量给药组(1mg/kg)。给药容积为1ml/100g，除阿司匹林组外，均尾静脉注射给药。阿司匹林组灌胃给药，每天一次，连续给药7天，最后一次给药后1h进行手术。大鼠用20％乌拉坦按1g/kg麻醉，颈部正中切口，分离右侧颈总动脉及左颈外静脉，在三段聚乙烯管的中段放入一根长6cm的7号手术丝线，将生理盐水溶液充满聚乙烯管，将其一端插入右侧颈总动脉，另一端插入左颈外静脉，打开动脉夹，血液从右颈总动脉经聚乙烯管返回左颈外静脉。开放血流20min，中断血流，迅速取出丝线称重，总重量减去丝线重量，即为血栓湿重。然后放入烤箱(60℃)中烤20min，立即称重，此重量减去丝线重量即为血栓干重。与空白对照组比较，结果用SSPS13.0作方差分析，再用LSD作组间比较。结果见表4：
表4 AAP对大鼠动静脉旁路血栓湿重和干重的影响
| 组别 | 剂量 | 血栓湿重(mg) | 血栓干重(mg) |
| 空白对照组阿司匹林组尿激酶组高剂量组中剂量组低剂量组 | -10mg/kg10000IU/kg4mg/kg2mg/kg1mg/kg | 31.31±15.9818.39±4.62**21.38±5.61**21.61±5.09*18.42±4.04**16.93±5.49*** | 6.49±2.263.82±2.35*4.07±1.60*3.92±2.38**3.42±1.49*3.56±1.92** |
*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；均与空白对照组比较。
结果表明，与空白对照组相比，高剂量给药组(4mg/kg)可降低血栓湿重，差异具有显著性(p＜0.05)，且明显降低血栓干重，差异具有显著性(p＜0.01)；中剂量给药组(2mg/kg)可明显降低血栓湿重和血栓干重，差异具有显著性(p＜0.01)；低剂量给药组(1mg/kg)可明显降低血栓湿重和血栓干重，差异具有显著性(p＜0.01)。由此可见，AAP的三个剂量组均可明显降低血栓湿重和血栓干重，具有抗血栓形成的作用。
Claims (1)
1、结构式(I)的肽类化合物用于制备治疗血栓疾病的药物的用途
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2008
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