CN104974239A - 一种离子交换和反相层析结合分离纯化眼镜蛇毒神经毒素的方法 - Google Patents

一种离子交换和反相层析结合分离纯化眼镜蛇毒神经毒素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种离子交换和反相层析结合分离纯化眼镜蛇毒神经毒素的方法。该分离纯化方法，包括以下步骤：(1)将0.05-0.15g/mL的眼镜蛇毒粗品溶液进行离心，过滤，得供试品溶液A，备用；(2)将所述供试品溶液A通过离子交换层析纯化，梯度洗脱，HPLC检测，收集，得供试品溶液B，备用；(3)将所述供试品溶液B通过反相柱层析纯化，梯度洗脱，HPLC检测，收集，浓缩，干燥，即得眼镜蛇毒神经毒素的纯品。该方法在不造成组分损失和破坏的前提下，简化了操作步骤，缩短了分离纯化的周期，提高了收率，纯度较高，适于眼镜蛇毒神经毒素的工业化生产。

Description

一种离子交换和反相层析结合分离纯化眼镜蛇毒神经毒素的方法
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种离子交换和反相层析结合分离纯化眼镜蛇毒神经毒素的方法。
背景技术
眼镜蛇毒是由眼镜蛇的毒腺分泌的毒液，其化学成分复杂，含有多种蛋白质、多肽、酶类和其他小分子物质，具有广泛的生物学活性。自1933年Monaelessert和Taguet首次报道眼镜蛇毒对癌组织压迫神经引起疼痛的病例有显著疗效以来，眼镜蛇毒的镇痛作用得到了深入的研究，其中眼镜蛇毒神经毒素显示了独特的镇痛作用。眼镜蛇毒神经毒素有长链和短链之分，短链含60～62个氨基酸，4个二硫键；长链含65～72个氨基酸，5个二硫键。眼镜蛇毒神经毒素的镇痛机理与吗啡相似，镇痛效果强于吗啡，持续时间长，无成瘾性和耐药性，起效较吗啡慢，有助于戒除吗啡的毒瘾，具有独特的治疗作用。
有文献报道，通过眼镜王蛇毒的粗分离、组分的活性鉴定、SephadexG-50凝胶柱层析、CM-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Phenyl-Sepharose HP疏水层析和Sephasil Peptide C18反相层析等步骤分离纯化眼镜王蛇毒神经毒素。但是，该方法由于需要联合使用凝胶柱层析、离子交换层析、疏水层析和反相层析等柱层析方法，不仅操作步骤复杂，而且分离纯化周期长(仅眼镜王蛇毒的粗分离这一步就需要576小时)，使得其应用范围仅局限于实验室中。
因此，在不造成组分损失和破坏的前提下，研究一种操作步骤简便、分离纯化周期短、适于工业化生产的眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化方法具有重要的意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一种不造成组分损失和破坏的、操作简便、分离纯化周期短、适于工业化生产的眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化方法。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供一种眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)将0.05-0.15g/mL的眼镜蛇毒粗品溶液进行离心，过滤，得供试品溶液A，备用；
(2)将所述供试品溶液A通过离子交换层析纯化，梯度洗脱，HPLC检测，收集，得供试品溶液B，备用；
(3)将所述供试品溶液B通过反相柱层析纯化，梯度洗脱，HPLC检测，收集，浓缩，干燥，即得眼镜蛇毒神经毒素的纯品。
本发明上述分离纯化方法中，所述离子交换层析的介质为CM SepharoseFast Flow。
本发明上述分离纯化方法中，所述反相柱层析的介质为C18，粒径为5-50μm。
本发明上述分离纯化方法中，所述步骤(2)的流动相为pH 6.8-7.0的磷酸盐缓冲液。
本发明上述分离纯化方法中，所述步骤(2)中，以8-12mM NaH2PO3缓冲液为流动相A，以包括1M NaCl的8-12mM NaH2PO3缓冲液为流动相B。
优选地，所述步骤(2)中，以10mM NaH2PO3缓冲液为流动相A，以包括1M NaCl的10mM NaH2PO3缓冲液为流动相B。
本发明上述分离纯化方法中，所述步骤(3)中，以乙腈为流动相A，以水为流动相B。
本发明上述分离纯化方法中，所述步骤(2)中梯度洗脱的步骤为：A：B体积比为100％：0％，A：B体积比为90％：10％，A：B体积比为85％：15％，A：B体积比为40％：60％。
本发明上述分离纯化方法中，所述步骤(3)中梯度洗脱的步骤为：A：B体积比为5％：95％，A：B体积比为10％：90％，A：B体积比为60％：40％。
本发明上述分离纯化方法中，所述步骤(2)中，所述梯度洗脱前还包括以下步骤：先用1-3个柱床体积的流动相B进行活化洗脱，再用2-4个柱床体积的流动相A进行平衡洗脱。
优选地，所述步骤(2)中，所述梯度洗脱前还包括以下步骤：先用2个柱床体积的流动相B进行活化洗脱，再用3个柱床体积的流动相A进行平衡洗脱。
本发明上述分离纯化方法中，所述步骤(3)中，所述梯度洗脱前还包括以下步骤：先用1-4个柱床体积的100％甲醇进行活化洗脱，再用2-5个柱床体积的A：B体积比为5％：95％的流动相进行平衡洗脱。
优选地，所述步骤(3)中，所述梯度洗脱前还包括以下步骤：先用2-3个柱床体积的100％甲醇进行活化洗脱，再用3-4个柱床体积的A：B体积比为5％：95％的流动相进行平衡洗脱。
本发明上述分离纯化方法中，所述步骤(1)中，所述过滤为采用0.45μm微孔滤膜进行过滤。
一种本发明上述分离纯化方法得到的眼镜蛇毒神经毒素。
与现有技术相比，本发明的上述技术方案具有以下优点：
本发明眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化方法，在不造成组分损失和破坏的前提下，将眼镜蛇毒粗品溶液通过离子交换层析和反相柱层析两步纯化，并进一步优化选择离子交换层析的介质、离子交换层析的流动相、离子交换层析的梯度洗脱的步骤、反相柱层析的介质、反相柱层析的流动相和反相柱层析的梯度洗脱的步骤等，简化了分离纯化的步骤，缩短了分离纯化的周期(8-10小时即可完成分离纯化过程)，收率较高(约50％)，纯度较高(>97％)，适于眼镜蛇毒神经毒素的工业化生产。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1为实验例1中对照品的C18柱HPLC检测图；
图2为实验例1中实施例1制备的眼镜蛇毒神经毒素的C18柱HPLC检测图；
图3为实验例1中实施例1制备的眼镜蛇毒神经毒素的高分子蛋白检测图；
图4为实施例1中步骤(2)的制备图；
图5为实施例1中步骤(3)的制备图；
图6为实施例1中步骤(2)的HPLC检测图；
图7为实施例1中步骤(3)的HPLC检测图。
具体实施方式
实施例1
本实施例眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)将0.10g/mL的眼镜蛇毒粗品溶液进行离心，采用0.45μm微孔滤膜进行过滤，得供试品溶液A，备用。
(2)将所述供试品溶液A通过离子交换层析纯化，所述离子交换层析的介质为CM Sepharose Fast Flow，以10mM NaH2PO3缓冲液为流动相A，以包括1M NaCl的10mM NaH2PO3缓冲液为流动相B。梯度洗脱前先用2个柱床体积的流动相B进行活化洗脱，再用3个柱床体积的流动相A进行平衡洗脱；然后进行梯度洗脱，梯度洗脱的步骤为：A：B体积比为100％：0％，A：B体积比为90％：10％，A：B体积比为85％：15％，A：B体积比为40％：60％，HPLC检测，收集，得供试品溶液B，备用；该步骤的制备图和HPLC检测图如图4和图6所示。
(3)将所述供试品溶液B通过反相柱层析纯化，所述反相柱层析的介质为C18，粒径为5-50μm，以乙腈为流动相A，以水为流动相B。梯度洗脱前先用2-3个柱床体积的100％甲醇进行活化洗脱，再用3-4个柱床体积的A：B体积比为5％：95％的流动相进行平衡洗脱，梯度洗脱，梯度洗脱的步骤为：A：B体积比为5％：95％，A：B体积比为10％：90％，A：B体积比为60％：40％，HPLC检测，收集，浓缩，干燥，即得眼镜蛇毒神经毒素的纯品；该步骤的制备图和HPLC检测图如图5和图7所示。
本实施例整个分离纯化过程仅需8-10小时即可完成，收率约为50％，纯度>97％，适于眼镜蛇毒神经毒素的工业化生产。
实施例2
本实施例眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)将0.05g/mL的眼镜蛇毒粗品溶液进行离心，采用0.45μm微孔滤膜进行过滤，得供试品溶液A，备用。
(2)将所述供试品溶液A通过离子交换层析纯化，所述离子交换层析的介质为CM Sepharose Fast Flow，以8mM NaH2PO3缓冲液为流动相A，以包括1M NaCl的8mM NaH2PO3缓冲液为流动相B。梯度洗脱前先用1个柱床体积的流动相B进行活化洗脱，再用2个柱床体积的流动相A进行平衡洗脱，然后进行梯度洗脱，梯度洗脱的步骤为：A：B体积比为100％：0％，A：B体积比为90％：10％，A：B体积比为85％：15％，A：B体积比为40％：60％，HPLC检测，收集，得供试品溶液B，备用。
(3)将所述供试品溶液B通过反相柱层析纯化，所述反相柱层析的介质为C18，粒径为5-50μm，以乙腈为流动相A，以水为流动相B。梯度洗脱前先用1-2个柱床体积的100％甲醇进行活化洗脱，再用2-3个柱床体积的A：B体积比为5％：95％的流动相进行平衡洗脱，梯度洗脱，梯度洗脱的步骤为：A：B体积比为5％：95％，A：B体积比为10％：90％，A：B体积比为60％：40％，HPLC检测，收集，浓缩，干燥，即得眼镜蛇毒神经毒素的纯品。
本实施例整个分离纯化过程仅需8-10小时即可完成，收率约为50％，纯度>97％，适于眼镜蛇毒神经毒素的工业化生产。
实施例3
本实施例眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)将0.15g/mL的眼镜蛇毒粗品溶液进行离心，采用0.45μm微孔滤膜进行过滤，得供试品溶液A，备用。
(2)将所述供试品溶液A通过离子交换层析纯化，所述离子交换层析的介质为CM Sepharose Fast Flow，以12mM NaH2PO3缓冲液为流动相A，以包括1M NaCl的12mM NaH2PO3缓冲液为流动相B。梯度洗脱前先用3个柱床体积的流动相B进行活化洗脱，再用4个柱床体积的流动相A进行平衡洗脱，梯度洗脱，梯度洗脱的步骤为：A：B体积比为100％：0％，A：B体积比为90％：10％，A：B体积比为85％：15％，A：B体积比为40％：60％，HPLC检测，收集，得供试品溶液B，备用。
(3)将所述供试品溶液B通过反相柱层析纯化，所述反相柱层析的介质为C18，粒径为5-50μm，以乙腈为流动相A，以水为流动相B。梯度洗脱前先用3-4个柱床体积的100％甲醇进行活化洗脱，再用4-5个柱床体积的A：B体积比为5％：95％的流动相进行平衡洗脱；然后梯度洗脱，梯度洗脱的步骤为：A：B体积比为5％：95％，A：B体积比为10％：90％，A：B体积比为60％：40％，HPLC检测，收集，浓缩，干燥，即得眼镜蛇毒神经毒素的纯品。
本实施例整个分离纯化过程仅需8-10小时即可完成，收率约为50％，纯度>97％，适于眼镜蛇毒神经毒素的工业化生产。
实验例1 纯度检测实验
以购自中国药品生物制品检定所的国家眼镜蛇神经毒素(科博肽)为对照品，对于实施例1制备的眼镜蛇毒神经毒素的纯度通过高效液相色谱法HPLC检测。
依据中华人民共和国药典(2010版)第二部附录(ⅤD)方法，以ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6×150mm，3.5μm为色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1％TFA的水溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱，进样量为20μl，温度为25℃，流速为0.5ml/min，吸收波长为280nm，25min停止。用HPLC系统工作站对结果进行数据处理，用面积归一化法计算出其纯度。
表1 梯度洗脱表
时间 A％ B％
0 5 95
15 60 40
30 60 40
经检测，对照品的纯度为98.4％，如附图1所示；实施例1制备的眼镜蛇毒神经毒素的纯度为99％以上，如附图2所示。
实验例2 生物学活性实验
1、对小鼠皮下注射神经毒素的半数致死量LD50测定试验
1.1实验目的
测定皮下注射实施例1制备的眼镜蛇毒神经毒素的LD50，观察其毒性反应。
1.2实验动物和试剂
动物：ICR小鼠18-22g，雌雄各30只；
试剂：实施例1制备的眼镜蛇毒神经毒素。
1.4实验步骤
(1)预试实验：预试实验测得Dn和Dm。
(2)正式实验：在预试实验测得Dn和Dm的剂量范围内设4～6个剂量组，最多10组。最理想的结果是使LD50的上下各有2～3组。组数愈少，准确性愈差。各剂量组的动物要求相等，至少10只动物(分组时应注意分层随机均匀化的原则)。本实验要求最大反应率为100％，最小反应率为0％，或至少反应率接近100％或0％。组间剂量比值(1：K)，常用1：0.8或1：0.75。如实验中出现相邻剂量有重复的100％和0％反应率时，应将靠边的组弃去不计，使大剂量组只有一个100％的反应率，小剂量组也只有一个0％的反应率。
分组完毕和各组剂量算出后，分组灌服或注射不同剂量的受试药物。为能得到理想的结果，实验最好从中间剂量开始，以便从最初几个剂量组动物接受药物后的反应来判断两端剂量是否合适，便于调整剂量和组数。为了提高实验的精确度和节省药物，受试药物可按“低比稀释法”配置。即使每只动物的用药体积相等(0.2ml/10g)，而溶质不等。给药后，逐日观察并记录中毒反应、死亡率和死亡情况，结果见表2及表3。
1.5实验结果
表2
表3
用Bliss法计算半数致死量，回归方程为y(Probit)＝-45.139+22.051Log(D)。
经计算，LD50＝187.83μg/kg；LD50(Feiller校正)95％的可信限＝180.07-196.4μg/kg；LD5＝158.19μg/kg；LD95＝223.03μg/kg。
1.6毒性反应
40min内活动增加，不安，之后少有几只活跃。1h后几乎全部活动减少,耸毛、倦卧、腹颤。2-5h死亡主要发生阶段，死亡前有些突眼、大小便失禁，抽搐，大口喘气，死亡；有些无抽搐、倦卧至死。尸体解剖后，可见心脏肿大，肺淤血，其他脏器无明显病理改变。存活过5h的小鼠基本不再死亡。
小鼠皮下注射的LD50剂量与文献报道的神经毒素相吻合，中毒死亡的症状符合神经毒素中毒死亡的典型表现。
实验例3 高分子排阻实验
为了进一步检测实施例1制备的眼镜蛇毒神经毒素的纯度，在C18柱HPLC检测的基础上，利用高分子排阻技术检测是否含有不同分子量杂质和测定杂质含量。
150mM磷酸盐缓冲液作流动相，高分子色谱柱连接高效液相仪，柱温:25℃，流速：0.5ml/min，吸收波长：280nm，30min停止，用HPLC系统工作站对结果进行数据处理，用面积归一化法计算出其纯度。
检测结果如附图3所示，可知，实施例1制备的眼镜蛇毒神经毒素的纯度在99％以上。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将0.05-0.15g/mL的眼镜蛇毒粗品溶液进行离心，过滤，得供试品溶液A，备用；
(2)将所述供试品溶液A通过离子交换层析纯化，梯度洗脱，HPLC检测，收集，得供试品溶液B，备用；
(3)将所述供试品溶液B通过反相柱层析纯化，梯度洗脱，HPLC检测，收集，浓缩，干燥，即得眼镜蛇毒神经毒素的纯品。
2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述离子交换层析的介质为CM Sepharose Fast Flow。
3.根据权利要求1或2所述的分离纯化方法，其特征在于，所述反相柱层析的介质为C18，粒径为5-50μm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)的流动相为pH 6.8-7.0的磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求4所述的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，以8-12mM NaH2PO3缓冲液为流动相A，以包括1M NaCl的8-12mMNaH2PO3缓冲液为流动相B。
6.根据权利要求1-5任一项所述的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)中，以乙腈为流动相A，以水为流动相B。
7.根据权利要求1-6任一项所述的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中梯度洗脱的步骤为：A：B体积比为100％：0％，A：B体积比为90％：10％，A：B体积比为85％：15％，A：B体积比为40％：60％。
8.根据权利要求1-7任一项所述的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)中梯度洗脱的步骤为：A：B体积比为5％：95％，A：B体积比为10％：90％，A：B体积比为60％：40％。
9.根据权利要求5-8任一项所述的分离纯化方法，其特征在于，
所述步骤(2)中，所述梯度洗脱前还包括以下步骤：先用1-3个柱床体积的流动相B进行活化洗脱，再用2-4个柱床体积的流动相A进行平衡洗脱；
所述步骤(3)中，所述梯度洗脱前还包括以下步骤：先用1-4个柱床体积的100％甲醇进行活化洗脱，再用2-5个柱床体积的A：B体积比为5％：95％的流动相进行平衡洗脱；
所述步骤(1)中，所述过滤为采用0.45μm微孔滤膜进行过滤。
10.一种权利要求1-9任一项所述的分离纯化方法得到的眼镜蛇毒神经毒素。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108132318A (zh) * 2016-12-01 2018-06-08 重庆本贝得生物工程技术研究院有限公司 一种nadph的分离纯化方法
CN109929020A (zh) * 2017-12-15 2019-06-25 浙江京新药业股份有限公司 一种眼镜蛇毒的纯化方法及其产品
CN109929021A (zh) * 2017-12-15 2019-06-25 浙江京新药业股份有限公司 一种蛇毒神经毒素晶型及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101058572A (zh) * 2007-03-13 2007-10-24 中国药科大学 一种新的具有抗肿瘤活性的肽类化合物
CN101270159A (zh) * 2008-05-16 2008-09-24 福建医科大学 一种蛇毒抗肿瘤的细胞毒素及其生产工艺
CN101845089A (zh) * 2010-01-15 2010-09-29 中鑫东泰(莱阳)纳米基因生物技术有限公司 一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神经毒性的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101058572A (zh) * 2007-03-13 2007-10-24 中国药科大学 一种新的具有抗肿瘤活性的肽类化合物
CN101270159A (zh) * 2008-05-16 2008-09-24 福建医科大学 一种蛇毒抗肿瘤的细胞毒素及其生产工艺
CN101845089A (zh) * 2010-01-15 2010-09-29 中鑫东泰(莱阳)纳米基因生物技术有限公司 一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神经毒性的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HENG ZHOU等: "A weak neurotoxin exhibits synergic effect with cardiotoxins when co-applied to two non-neural cell lines", 《BIOLOGICAL AND PHARMACEUTICAL BULLETIN》 *
MICHELLE KHAI KHUN YAP等: "Proteomic characterization of venom of the medically important southeast Asian Naja sumatrana(Equatorial spitting cobra)", 《ACTA TROPICA》 *
田亚平: "《生化分离技术》", 30 September 2006, 化学工业出版社 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108132318A (zh) * 2016-12-01 2018-06-08 重庆本贝得生物工程技术研究院有限公司 一种nadph的分离纯化方法
CN108132318B (zh) * 2016-12-01 2021-03-09 山东蓝康药业股份有限公司 一种nadph的分离纯化方法
CN109929020A (zh) * 2017-12-15 2019-06-25 浙江京新药业股份有限公司 一种眼镜蛇毒的纯化方法及其产品
CN109929021A (zh) * 2017-12-15 2019-06-25 浙江京新药业股份有限公司 一种蛇毒神经毒素晶型及其制备方法

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