CN108132318B - 一种nadph的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制药领域,具体涉及一种NADPH的分离纯化方法。该分离纯化方法,包括以下步骤:将NADPH粗品溶液过滤,得供试品溶液;将所述供试品溶液通过反相柱层析纯化,梯度洗脱,HPLC检测,收集,浓缩,干燥,即得。本发明通过优化选择反相柱层析的介质、色谱柱、流动相、梯度洗脱的步骤等,使得NADPH的分离纯化的周期大大缩短(3小时即可完成分离纯化过程),收率较高(约50%),纯度较高(>92%),适于NADPH的工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域,具体涉及一种NADPH的分离纯化方法。
背景技术
NADPH即还原型辅酶,学名:还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(triphosphopyridine nucleotide),是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)中与腺嘌呤相连的核糖环系2'-位的磷酸化衍生物,在很多生物体内的化学反应中起递氢体的作用,并且参与多种代谢反应的合成,如脂类、脂肪酸和核苷酸的合成,还可以在暗反应中为二氧化碳的固定进行供能。在上述反应中, NADPH是NADP+的还原形式,NADPH的作用是还原剂和氢负离子的供体;同时,NADPH是细胞内抗氧化防御系统的重要组成成分,在细胞防御活性氧(ROS)损伤方面起着重要的作用。
有文献报道,细胞的生长、分裂、分化、迁移、凋亡及衰老等许多生命活动,也与NADPH密切相关;而且,维持NADPH(NADH)的固定浓度,或者外加辅助的NADPH(NADH),可以对抗细胞的凋亡和衰老过程,延缓机体衰老。最新的研究发现,NADPH和NADH在机体生理与病理条件下都发挥重要的功能。当前,对细胞内NADPH(NADH)作用和代谢的研究已成为国际性的研究热点。
近几年,人工合成NADPH、然后进行分离纯化是NADPH的重要来源之一。然而,现有的对人工合成的NADPH粗品进行分离纯化方法,由于分离纯化周期较长、使得在分离纯化中NADPH极易发生氧化,而且分离纯化得到的NADPH纯度也较低。
因此,在不造成NADPH损失和破坏的前提下,研究一种操作步骤简便、分离纯化周期短、适于工业化生产的NADPH的分离纯化方法具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是由于现有的NADPH的分离纯化周期较长、使得NADPH在分离纯化中发生氧化的问题,本发明要解决的第二个技术问题是现有的分离纯化得到的NADPH纯度较低的问题。
为解决上述技术问题,本发明提出一种分离纯化周期较短、分离纯化得到的NADPH纯度较高的NADPH的分离纯化方法。
为解决上述技术问题,本发明是通过以下技术方案来实现的:
本发明提供一种NADPH的分离纯化方法,包括以下步骤:
将NADPH粗品溶液过滤,得供试品溶液;将所述供试品溶液通过反相柱层析纯化,梯度洗脱,HPLC检测,收集,浓缩,干燥,即得。
优选地,本发明上述NADPH的分离纯化方法,
进一步优选地,本发明上述NADPH的分离纯化方法,
所述反相柱层析的色谱柱为Sepax GP-C18。
进一步优选地,本发明上述NADPH的分离纯化方法,
以8~12mM NaH2PO4缓冲液为流动相A,以体积分数为100%的甲醇为流动相B。
进一步优选地,本发明上述NADPH的分离纯化方法,
以10mM NaH2PO4缓冲液为流动相A,以甲醇为流动相B。
进一步优选地,本发明上述NADPH的分离纯化方法,
所述梯度洗脱的具体程序为:0-10min,A:B的体积比为95%:5%; 10-40min,A:B的体积比为90%:10%;40-60min,A:B的体积比由90%: 10%→40%:60%;60min,A:B的体积比为60%:40%。
进一步优选地,本发明上述NADPH的分离纯化方法,
所述梯度洗脱前还包括以下步骤:先用体积分数为100%的甲醇进行活化洗脱30min,再用A:B的体积比为95%:5%的流动相进行平衡洗脱35min。
进一步优选地,本发明上述NADPH的分离纯化方法,
以重量百分含量计,所述NADPH粗品溶液中,主要含有以下成分: NADPH的含量为60~70%,NADP的含量为10~20%,葡萄糖的含量为10~15%,其他成分的含量为5-10%。
进一步优选地,本发明上述NADPH的分离纯化方法,所述NADPH粗品溶液的制备方法为:在固定化酶的催化下,NADP与葡萄糖在水溶液中反应,即得。
进一步优选地,本发明上述NADPH的分离纯化方法,采用0.45μm微孔滤膜进行过滤。
进一步优选地,本发明上述NADPH的分离纯化方法,柱温为15℃,流速为40mL/min,检测波长为260nm。
与现有技术相比,本发明的上述技术方案具有以下优点:
本发明NADPH的分离纯化方法,在不造成组分损失和破坏的前提下,将NADPH粗品溶液先过滤,然后通过反相柱层析纯化,并进一步优化选择反相柱层析的介质、色谱柱、流动相、梯度洗脱的步骤等,使得NADPH的分离纯化的周期大大缩短(3小时即可完成分离纯化过程),收率较高(约 50%),纯度较高(>92%),适于NADPH的工业化生产。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解,下面根据本发明的具体实施例并结合附图,对本发明作进一步详细的说明,其中:
图1为实验例1中NADPH标准品的HPLC检测图;
图2为实验例1中实施例1分离纯化的NADPH的HPLC检测图;
图3为实验例1中实施例2分离纯化的NADPH的HPLC检测图;
图4为实验例1中实施例3分离纯化的NADPH的HPLC检测图;
图5为实验例1中对比例1分离纯化的NADPH的HPLC检测图;
图6为实验例1中对比例2分离纯化的NADPH的HPLC检测图;
图7为实验例1中对比例3分离纯化的NADPH的HPLC检测图。
具体实施方式
本发明以下实施例、对比例和实验例中,(1)NADPH粗品溶液的制备方法为:在固定化酶的催化下,NADP与葡萄糖在水溶液中反应,即得;(2) 以重量百分含量计,所述NADPH粗品溶液中,主要含有以下成分:NADPH的含量为60~70%,NADP的含量为10~20%,葡萄糖的含量为10~15%,未知杂质的含量为5-10%;(3)NADPH的收率采用面积法按照如下公式进行计算:收率=峰面积×样品体积/(粗品主峰面积×样品体积×稀释倍数)。
实施例1
本实施例NADPH的分离纯化方法,包括以下步骤:
将NADPH粗品溶液采用0.45μm微孔滤膜进行过滤,得供试品溶液;将所述供试品溶液通过反相柱层析纯化,反相柱层析的介质为C18,颗粒度为 10μm,粒径为色谱柱为Sepax GP-C18,以10mM NaH2PO4缓冲液为流动相A,以体积分数为100%的甲醇为流动相B,先用体积分数为100%的甲醇进行活化洗脱30min,再用A:B的体积比为95%:5%的流动相进行平衡洗脱 35min,然后按照如下程序进行梯度洗脱:0-10min,A:B的体积比为95%:5%;10-40min,A:B的体积比为90%:10%;40-60min,A:B的体积比由90%:10%→40%:60%;60min,A:B的体积比为60%:40%,柱温为 15℃,流速为40mL/min,检测波长为260nm,HPLC检测,收集,浓缩,干燥,即得。
本实施例整个分离纯化过程仅需3小时即可完成,收率为55%。
实施例2
本实施例NADPH的分离纯化方法,包括以下步骤:
将NADPH粗品溶液采用0.45μm微孔滤膜进行过滤,得供试品溶液;将所述供试品溶液通过反相柱层析纯化,反相柱层析的介质为C18,颗粒度为 100μm,粒径为色谱柱为Sepax GP-C18,以8mM NaH2PO4缓冲液为流动相A,以体积分数为100%的甲醇为流动相B,先用体积分数为100%的甲醇进行活化洗脱30min,再用A:B的体积比为95%:5%的流动相进行平衡洗脱 35min,然后按照如下程序进行梯度洗脱:0-10min,A:B的体积比为95%:5%;10-40min,A:B的体积比为90%:10%;40-60min,A:B的体积比由90%:10%→40%:60%;60min,A:B的体积比为60%:40%,柱温为 15℃,流速为40mL/min,检测波长为260nm,HPLC检测,收集,浓缩,干燥,即得。
本实施例整个分离纯化过程仅需3小时即可完成,收率为52%。
实施例3
本实施例NADPH的分离纯化方法,包括以下步骤:
将NADPH粗品溶液采用0.45μm微孔滤膜进行过滤,得供试品溶液;将所述供试品溶液通过反相柱层析纯化,反相柱层析的介质为C18,颗粒度为 50μm,粒径为色谱柱为Sepax GP-C18,以12mM NaH2PO4缓冲液为流动相A,以体积分数为100%的甲醇为流动相B,先用体积分数为100%的甲醇进行活化洗脱30min,再用A:B的体积比为95%:5%的流动相进行平衡洗脱 35min,然后按照如下程序进行梯度洗脱:0-10min,A:B的体积比为95%: 5%;10-40min,A:B的体积比为90%:10%;40-60min,A:B的体积比由90%:10%→40%:60%;60min,A:B的体积比为60%:40%,柱温为 15℃,流速为40mL/min,检测波长为260nm,HPLC检测,收集,浓缩,干燥,即得。
本实施例整个分离纯化过程仅需3小时即可完成,收率约为50%。
对比例1
本对比例NADPH的分离纯化方法与实施例1的区别仅在于:以20mM乙酸铵为流动相A,以体积分数为100%的甲醇为流动相B,按照如下程序进行梯度洗脱:0-20min,A:B的体积比为95%:5%;20-60min,A:B的体积比为90%:10%;60-100min,A:B的体积比由90%:10%→80%:20%; 100min,A:B的体积比为80%:20%;100-120min,A:B的体积比由80%: 20%→60%:40%;120min,A:B的体积比为60%:40%;其余实验条件和实验操作步骤均与实施例1相同。
本对比例整个分离纯化过程需4小时即可完成,收率约为30%。
对比例2
本对比例NADPH的分离纯化方法与实施例1的区别仅在于:以20mM碳酸氢钠溶液为流动相A,以体积分数为100%的甲醇为流动相B,按照如下程序进行梯度洗脱:0-15min,A:B的体积比为95%:5%;15min,A:B的体积比为90%:10%;15-60min,A:B的体积比为90%:10%→70%:30%; 60min,A:B的体积比为70%:30%;60-80min,A:B的体积比由70%:30%→60%:40%;80min,A:B的体积比为60%:40%;其余实验条件和实验操作步骤均与实施例1相同。
本对比例整个分离纯化过程需3.5小时即可完成,收率约为40%。
对比例3
本对比例NADPH的分离纯化方法与实施例1的区别仅在于:按照如下程序进行梯度洗脱:0-10min,A:B的体积比为95%:5%;10min,A:B的体积比为90%:10%;10-50min,A:B的体积比为90%:10%→70%:30%; 50min,A:B的体积比为70%:30%;50-80min,A:B的体积比由70%: 30%→60%:40%;80min,A:B的体积比为60%:40%;其余实验条件和实验操作步骤均与实施例1相同。
本对比例整个分离纯化过程需3.5小时即可完成,收率约为45%。
实验例1纯度检测实验
对于实施例1、2、3制备的NADPH的纯度通过高效液相色谱法HPLC 检测。
依据中华人民共和国药典(2010版)第二部附录(ⅤD)方法,以 ReproSil-Pur120ODS-3(5μm,4.6×250mm)为色谱柱,以乙腈为流动相A,以100mM NaH2PO4的水溶液为流动相B,按如下程序进行梯度洗脱:0- 15min,A:B的体积比为5%:95%→60%:40%;15-22min,A:B的体积比由60%:40%,进样量为20μL,柱温为25℃,流速为1.0mL/min,检测波长为260nm。用HPLC系统工作站对结果进行数据处理,用面积归一化法计算出其纯度。
NADPH标准品的HPLC检测图如图1所示,实施例1分离纯化的 NADPH的HPLC检测图如图2所示,实施例2分离纯化的NADPH的 HPLC检测图如图3所示,实施例3分离纯化的NADPH的HPLC检测图如图4所示,对比例1分离纯化的NADPH的HPLC检测图如图5所示,对比例2分离纯化的NADPH的HPLC检测图如图6所示,对比例 3分离纯化的NADPH的HPLC检测图如图7所示。
由图2、3、4、5、6、7可知,实施例1分离纯化的NADPH的纯度为95%,实施例2分离纯化的NADPH的纯度为93%,实施例3分离纯化的NADPH的纯度为92%,对比例1分离纯化的NADPH的纯度为75.7%,对比例2分离纯化的 NADPH的纯度为86.8%,对比例3分离纯化的NADPH的纯度为93%。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (6)
1.一种NADPH的分离纯化方法,其特征在于,包括以下步骤:
将NADPH粗品溶液过滤,得供试品溶液;将所述供试品溶液通过反相柱层析纯化,梯度洗脱,HPLC检测,收集,浓缩,干燥,即得;
所述反相柱层析的介质为C18,颗粒度为10-100μm,粒径为色谱柱为Sepax GP-C18,以8~12mM NaH2PO4缓冲液为流动相A,以体积分数为100%的甲醇为流动相B,柱温为15℃,流速为40mL/min,检测波长为260nm,
所述梯度洗脱的具体程序为:0-10min,A:B的体积比为95%:5%;10-40min,A:B的体积比为90%:10%;40-60min,A:B的体积比由90%:10%→40%:60%;60min,A:B的体积比为60%:40%。
2.根据权利要求1所述的NADPH的分离纯化方法,其特征在于,
以10mM NaH2PO4缓冲液为流动相A,以甲醇为流动相B。
3.根据权利要求1或2所述的NADPH的分离纯化方法,其特征在于,
所述梯度洗脱前还包括以下步骤:先用体积分数为100%的甲醇进行活化洗脱30min,再用A:B的体积比为95%:5%的流动相进行平衡洗脱35min。
4.根据权利要求1或2所述的NADPH的分离纯化方法,其特征在于,
以重量百分含量计,所述NADPH粗品溶液中,主要含有以下成分:NADPH的含量为60~70%,NADP的含量为10~20%,葡萄糖的含量为10~15%,未知杂质的含量为5-10%。
5.根据权利要求3所述的NADPH的分离纯化方法,其特征在于,
以重量百分含量计,所述NADPH粗品溶液中,主要含有以下成分:NADPH的含量为60~70%,NADP的含量为10~20%,葡萄糖的含量为10~15%,未知杂质的含量为5-10%。
6.根据权利要求1、2或5中任一项所述的NADPH的分离纯化方法,其特征在于,采用0.45μm微孔滤膜进行过滤。
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Effective date of registration: 20201209 Address after: Room 201, No. 578 Linzi Avenue, Linzi District, Zibo City, Shandong Province Applicant after: Shandong lankang Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: No.2, 3rd floor, No.69, Donglin Er village, Donglin street, Qijiang District, Chongqing (formerly Wansheng District) Applicant before: CHONGQING BENBEIDE BIOLOGICAL ENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE Co.,Ltd. |
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