CN104762347B - 一种三磷酸腺苷(atp)的生产方法 - Google Patents

Abstract

一种三磷酸腺苷(ATP)的生产方法，它主要包括以下步骤：啤酒酵母的冷冻处理、发酵提转化酶、板框压滤、微滤、发酵合成三磷酸腺苷、纳滤除盐、树脂吸附、树脂洗涤洗脱、超滤除蛋白和热源、乙醇沉淀、干燥等；由于本发明采用了高效节能的膜分离技术，在发酵提转化酶步骤后，通过微滤处理提高转化酶的纯度，从而提高了三磷酸腺苷的合成转化率；在三磷酸腺苷发酵合成液的分离提纯过程中采用纳滤工艺将合成过程中添加的无机盐类营养物质去除，增强了离子交换树脂吸附ATP的容量；采用超滤去除蛋白和热源，提高产品的纯度；本发明具有能提高ATP产品的生产能力、回收率、产品纯度，降低化学试剂的消耗，简化生产工艺，减少污染排放，等特点。

Description

一种三磷酸腺苷(ATP)的生产方法

技术领域

本发明涉及一种用腺苷(AR)为原料生产三磷酸腺苷（ATP）的方法，具体涉及三磷酸腺苷发酵合成二步发酵：第一步为发酵提转化酶，第二步为在转化酶的催化作用下将腺苷磷酸化为三磷酸腺苷。

背景技术

三磷酸腺苷(ATP)是一种由一个腺嘌呤，一个核糖和一个三磷酸单位组成的核苷酸药物，分子式C₁₀H₁₆N₅O₁₃P₃，分子量为507。它是生物体内的能量转换器和贮存器，在人体能量代谢中起着重要的作用。ATP也是生物体内重要的代谢物质，作为代谢的中间体、辅酶参与生物体内脂肪、蛋白质、糖类和核酸等的代谢。在临床应用上，ATP除了能作为抢救危重病人的辅助药品外，还对急慢性肝炎、肾炎、心肌炎、冠状动脉硬化、进行性肌肉萎缩、再生障碍性贫血、风湿性关节炎等病症具有良好的治疗作用。三磷酸腺苷二钠原料以及注射液已收载于 《中国药典》 2010年版二部。

三磷酸腺苷的合成主要有化学合成法、酶催化合成、光合磷酸化和氧化磷酸化、微生物酶系催化合成等方法。考虑到药品的安全性、环保、生产成本等因素，用腺苷为原料微生物酶系催化合成三磷酸腺苷成为目前工业生产三磷酸腺苷的主要工艺。然而，我国三磷酸腺苷生产水平总体还比较低，产品的产量、回收率、产品的纯度等方面达不到进口产品的水平。

申请号为95100148.5的中国专利申请文件中公开了一种“用腺苷（AR）为原料生产腺苷三磷酸（ATP）的新工艺”。该工艺主要包括：啤酒酵母冷冻处理、发酵提酶、离心分离、腺苷发酵合成ATP、酒精沉淀、沉淀物回溶、冷冻除盐、稀释后离子交换、树脂洗涤洗脱、树脂脱色、活性炭除热源、结晶、干燥等。该工艺由于酵母与转化酶的分离不彻底，发酵后期酵母所产酶系成分变化，转化酶活力下降,使得三磷酸腺苷转化率为90%，而且发酵过程中因菌体衰老自溶等因素带入较多杂物等问题；其次在发酵合成液中除了有三磷酸腺苷外，还有未反应的AR及副反应产物AMP、ADP，及微生物所需的营养物质磷酸氢二钾、磷酸氢二钾、硫酸镁等无机盐。发酵合成液中无机盐的浓度约4万mg/L。在离子交换吸附过程中，离子与ATP竞争吸附到离子交换树脂上，造成树脂吸附ATP量仅约5～13克/100克树脂（201×7），采用酒精沉淀脱盐工艺后树脂吸附ATP量提高到18～22克/100克树脂（201×7），但需要消耗ATP发酵液体积4～5倍的无水乙醇。三磷酸腺苷回收率和设备利用率低，产品中杂质较多。

综合以上背景技术，如何通过高效分离技术提高酶液的纯度和降低合成液中无机盐的含量，从而提高三磷酸腺苷的产量、回收率、纯度成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种能提高ATP产品的生产能力、回收率、产品纯度，降低化学试剂的消耗，简化生产工艺，减少污染排放，明显提高经济效益的三磷酸腺苷的生产方法。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种三磷酸腺苷（ATP）的生产方法，它主要是利用酵母细胞内的酶系统，以葡萄糖为能源经糖酵解途径使腺苷(AR)磷酸化合成三磷酸腺苷，所述的生产方法包括如下步骤：

a）发酵反应锅中加去离子水，将水的温度升到30～42℃，定量投加啤酒酵母，再定量投加葡萄糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾溶液，调节pH值在6.0～7.0范围内，保持温度为30～42℃并发酵2.0～2.5小时提转化酶，得到发酵提酶液；上述各反应物的用量为：

啤酒酵母泥250～280g/L， 葡萄糖35～45 g/L，磷酸氢二钾25～30 g/L，磷酸二氢钾20～25 g/L。

b）发酵提酶液需经过板框过滤去除酶液中颗粒度较大的酵母泥杂质，得到粗滤提酶液；

c）经过板框过滤的粗滤提酶液再经过精度为0.1～10μm的微滤膜处理，进一步去除细微的酵母等杂质，得到清酶液；

d）在清酶液中加入反应物腺苷20～40g/L，再加入营养物质硫酸镁1.6～2.0g/L，调节pH值在6.0～7.0范围内，并在温度为32～35℃条件下发酵4.0～6.0小时，腺苷由葡萄糖提供能量，在转化酶的催化作用下，腺苷磷酸化为三磷酸腺苷，三磷酸腺的浓度为36～72g/L；立即加冰水冷却，将温度降低到15～20℃；

e）采用截留分子量为150～500的纳滤膜，通过纳滤膜的选择透过性能使单价的离子透过膜，三磷酸腺苷溶液中80%以上的无机盐被去除，三磷酸腺苷因分子较大被纳滤膜截留在浓缩液中，得到三磷酸腺苷浓缩液；

f）经过去除无机盐的三磷酸腺苷合浓缩液用去离子水稀释，使三磷酸腺苷的浓度调整到0.5～1.5%；

g）上述稀释后的三磷酸腺苷溶液通过201×7阴离子交换树脂吸附，树脂粒度0.315～1.25mm；吸附结束后用去离子水和0.04～0.06%氯化钠溶液洗涤，去除AR、AMP、ADP等原料物和合成副产物，再用4.0～6.0%的氯化钠溶液洗脱，得到三磷酸腺苷洗脱液；

h）三磷酸腺苷洗脱液经过截留分子量为3000～10000的超滤膜处理去除蛋白质和热源，通过活性炭吸附去除色度物质；

i）上述经过超滤膜处理和活性炭吸附的三磷酸腺苷洗脱液经过无水乙醇沉淀、离心分离、淋洗和浸泡提纯，得到三磷酸腺苷固体，无水乙醇的用量为三磷酸腺苷超滤膜透过液的2.5～3.5倍，再经过38～42℃的真空干燥，得到三磷酸腺苷成品。

本发明优选的是：所述的步骤a）中所加入的啤酒酵母，需先经过-15～-20℃冷冻处理，冷冻处理7～10天；

步骤c）中， 微滤膜的形式有平板式、中空纤维式等，膜材料选用PP、N-6、PS、 PES、PVDF中的一种，操作压力小于1.0MPa，温度5～40℃；

步骤e）中，选用纳滤膜的形式包括平板式、中空纤维式，膜材料有芳香族聚酰胺复合膜、磺化聚醚砜，操作压力0.8～2.5MPa，温度5～40℃，浓缩3～10倍；

步骤g）中，纳滤脱盐工艺除盐后，201×7阴树脂的吸附ATP量由原来的5～13g/100g树脂，提高到24～28g/100g树脂，优于乙醇沉淀脱盐工艺吸附18～22 g/100g树脂的水平，并且无乙醇的使用；阴离子交换树脂选用凝胶或大孔强碱性的阴树脂；

步骤h）中，超滤工艺的超滤膜为卷式膜或中空纤维膜，操作压力0.2～1.5MPa，温度5～40℃，浓缩3～12倍，膜材料为PP、PAN、PS、 PES、PVDF中的任意一种；活性炭为果壳型粉末活性炭或粒状活性炭。

本发明采用微滤处理提高转化酶的纯度，提高了三磷酸腺苷的合成转化率；在三磷酸腺苷发酵合成液的分离提纯过程中采用纳滤工艺将合成过程中添加的无机盐类营养物质去除，增强了离子交换树脂吸附ATP的容量；采用超滤去除蛋白和热源,提高产品的纯度。

本发明能使磷酸腺苷转化率达到95%以上，总回收率由达到80%以上，纯度提高到98%以上。

本发明具有能提高ATP产品的生产能力、回收率、产品纯度，降低化学试剂的消耗，简化生产工艺，减少污染排放，明显提高经济效益等特点。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明作详细的介绍：一种三磷酸腺苷（ATP）的生产方法，它主要是利用酵母细胞内的酶系统，以葡萄糖为能源经糖酵解途径使腺苷(AR)磷酸化合成三磷酸腺苷，所述的生产方法包括如下步骤：

a）发酵反应锅中加去离子水，将水的温度升到30～42℃，定量投加啤酒酵母，再定量投加葡萄糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾溶液，调节pH值在6.0～7.0范围内，保持温度为30～42℃并发酵2.0～2.5小时提转化酶，得到发酵提酶液；上述各反应物的用量为：

啤酒酵母泥250～280g/L， 葡萄糖35～45 g/L，磷酸氢二钾25～30 g/L，磷酸二氢钾20～25 g/L。

b）发酵提酶液需经过板框过滤去除酶液中颗粒度较大的酵母泥杂质，得到粗滤提酶液；

c）经过板框过滤的粗滤提酶液再经过精度为0.1～10μm的微滤膜处理，进一步去除细微的酵母等杂质，得到清酶液；

d）在清酶液中加入反应物腺苷20～40g/L，再加入营养物质硫酸镁1.6～2.0g/L，调节pH值在6.0～7.0范围内，并在温度为32～35℃条件下发酵4.0～6.0小时，腺苷由葡萄糖提供能量，在转化酶的催化作用下，腺苷磷酸化为三磷酸腺苷，三磷酸腺的浓度为36～72g/L；立即加冰水冷却，将温度降低到15～20℃；

e）采用截留分子量为150～500的纳滤膜，通过纳滤膜的选择透过性能使单价的离子透过膜，三磷酸腺苷溶液中80%以上的无机盐被去除，三磷酸腺苷因分子较大被纳滤膜截留在浓缩液中，得到三磷酸腺苷浓缩液；

f）经过去除无机盐的三磷酸腺苷合浓缩液用去离子水稀释，使三磷酸腺苷的浓度调整到0.5～1.5%；

g）上述稀释后的三磷酸腺苷溶液通过201×7阴离子交换树脂吸附，树脂粒度0.315～1.25mm；吸附结束后用去离子水和0.04～0.06%氯化钠溶液洗涤，去除AR、AMP、ADP等原料物和合成副产物，再用4.0～6.0%的氯化钠溶液洗脱，得到三磷酸腺苷洗脱液；

h）三磷酸腺苷洗脱液经过截留分子量为5000～10000的超滤膜处理去除蛋白质和热源，通过活性炭吸附去除色度物质；

i）上述经过超滤膜处理和活性炭吸附的三磷酸腺苷洗脱液经过无水乙醇沉淀、离心分离、淋洗和浸泡提纯，得到三磷酸腺苷固体，无水乙醇的用量为三磷酸腺苷超滤膜透过液的2.5～3.5倍，再经过38～42℃的真空干燥，得到三磷酸腺苷成品。

本发明优选的实施例是：所述的步骤a）中所加入的啤酒酵母，需先经过-15～-20℃冷冻处理，冷冻处理7～10天；

步骤c）中， 微滤膜的形式有平板式、中空纤维式等，膜材料选用PP、N-6、PS、 PES、PVDF中的一种，操作压力小于1.0MPa，温度5～40℃；

步骤e）中，选用纳滤膜的形式包括平板式、中空纤维式，膜材料有芳香族聚酰胺复合膜、磺化聚醚砜，操作压力0.8～2.5MPa，温度5～40℃，浓缩3～10倍；

步骤g）中，纳滤脱盐工艺除盐后，201×7阴树脂的吸附ATP量由原来的5～13g/100g树脂，提高到24～28g/100g树脂，优于乙醇沉淀脱盐工艺吸附18～22 g/100g树脂的水平，并且无乙醇的使用；阴离子交换树脂选用凝胶或大孔强碱性的阴树脂；

步骤h）中，超滤工艺的超滤膜为卷式膜或中空纤维膜，操作压力0.2～1.5MPa，温度5～40℃，浓缩3～12倍，膜材料为PP、PAN、PS、 PES、PVDF中的任意一种；活性炭为果壳型粉末活性炭或粒状活性炭。

实施例1：在反应锅内加400L去离子水，开动搅拌机，夹套通热水进行加热使反应锅内水温达到40℃，投加经过冷冻处理的啤酒酵母泥280千克使其溶解，再投加浓度40%葡萄糖溶液100千克、20%磷酸氢二钾溶液125千克、20%磷酸二氢钾溶液100千克，调节pH值为7.0，在温度为40～42℃下发酵2.5小时提转化酶，得到发酵提酶液。

发酵提酶液先经过板框过滤，滤布为涤纶滤布，精度约300目。再经过精度为1μm的微滤膜过滤，得到清酶液。微滤膜的形式为平板式，膜材料为PP，操作压力小于0.5MPa，温度30℃。

将腺苷配制成20%的溶液，在上述清酶液中投加腺苷溶液125千克，再加入营养物质硫酸镁2千克，调节pH值为7.0，在温度为33～35℃下发酵5.0小时，腺苷由葡萄糖提供能量，在转化酶的催化作用下，将腺苷转化为三磷酸腺苷，转化率95.5%，三磷酸腺的浓度为45g/L。

采用截留分子量为200的纳滤卷式膜处理，膜材料为芳香族聚酰胺复合膜，操作压力1.5MPa，温度20℃，浓缩8倍。三磷酸腺苷溶液中81.3%的无机盐被去除，三磷酸腺苷因分子较大被纳滤膜截留在浓缩液中，得到三磷酸腺苷浓缩液。

经过去除无机盐的三磷酸腺苷合浓缩液用去离子水稀释，使三磷酸腺苷的浓度

调整到1.0%。

上述稀释后的三磷酸腺苷溶液通过201×7阴离子交换树脂吸附，纳滤脱盐工艺

使201×7阴树脂的吸附ATP量达到27.5g/100g树脂。吸附结束后用去离子水和0.05%

氯化钠溶液洗涤，去除AR、AMP、ADP等原料物和合成副产物，再用5.0%的氯化钠

溶液洗脱，得到三磷酸腺苷洗脱液。

三磷酸腺苷洗脱液经过截留分子量为6000的超滤膜处理去除蛋白质和热源，通

过活性炭吸附去除色度物质。超滤工艺的超滤膜为中空纤维膜，操作压力0.2～0.4MPa，

温度20℃，膜材料有PS。活性炭为椰子壳粉末活性炭，投加比例为1.0%。

上述经过超滤膜处理和活性炭吸附的三磷酸腺苷洗脱液经过无水乙醇沉淀、离心分离、淋洗和浸泡提纯，得到三磷酸腺苷固体，无水乙醇的用量为三磷酸腺苷超滤膜透过液的2.5倍，再经过40℃的真空干燥，得到三磷酸腺苷成品。

三磷酸腺苷成品总回收率由达到80.6%，纯度提高到98.0%。

实施例2：在反应锅内加500L去离子水，开动搅拌机，夹套通热水进行加热使反应锅内水温达到40℃，投加经过冷冻处理的啤酒酵母泥320千克使其溶解，再投加浓度40%葡萄糖溶液120千克、20%磷酸氢二钾溶液150千克、20%磷酸二氢钾溶液100千克，调节pH值为6.5，在温度为38～40℃下发酵2.5小时提转化酶，得到发酵提酶液。

发酵提酶液先经过板框过滤，滤布为涤纶滤布，精度约300目。再经过精度为0.22μm的微滤膜过滤，得到清酶液。微滤膜的形式为平板式，膜材料为PP，操作压力小于0.5MPa，温度30℃。

将腺苷配制成20%的溶液，在上述清酶液中投加腺苷溶液150千克，再加入营养物质硫酸镁2千克，调节pH值为6.5，在温度为32～33℃下发酵4.5小时，腺苷由葡萄糖提供能量，在转化酶的催化作用下，将腺苷转化为三磷酸腺苷，转化率95.3%，三磷酸腺的浓度为42.5g/L。

采用截留分子量为300的纳滤卷式膜处理，膜材料为芳香族聚酰胺复合膜，操作压力1.5MPa，温度15℃，浓缩7.6倍。三磷酸腺苷溶液中82.0%的无机盐被去除，三磷酸腺苷因分子较大被纳滤膜截留在浓缩液中，得到三磷酸腺苷浓缩液。

经过去除无机盐的三磷酸腺苷合浓缩液用去离子水稀释，使三磷酸腺苷的浓度调整到1.0%。

上述稀释后的三磷酸腺苷溶液通过201×7阴离子交换树脂吸附，纳滤脱盐工艺

使201×7阴树脂的吸附ATP量达到27.5g/100g树脂。吸附结束后用去离子水和0.06%

氯化钠溶液洗涤，去除AR、AMP、ADP等原料物和合成副产物，再用6.0%的氯化钠

溶液洗脱，得到三磷酸腺苷洗脱液。

三磷酸腺苷洗脱液经过截留分子量为6000的超滤膜处理去除蛋白质和热源，通

过活性炭吸附去除色度物质。超滤工艺的超滤膜为中空纤维膜，操作压力0.2～0.5MPa，

温度20℃，膜材料有PS。活性炭为椰子壳粉末活性炭，投加比例为1.2%。

上述经过超滤膜处理和活性炭吸附的三磷酸腺苷洗脱液经过无水乙醇沉淀、离心分离、淋洗和浸泡提纯，得到三磷酸腺苷固体，无水乙醇的用量为三磷酸腺苷超滤膜透过液的3.0倍，再经过40℃的真空干燥，得到三磷酸腺苷成品。

三磷酸腺苷成品总回收率由达到81.2%，纯度提高到98.2%。

以上所述是本发明的优选实施例， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种三磷酸腺苷(ATP)的生产方法，它主要是利用酵母细胞内的酶系统，以葡萄糖为能源经糖酵解途径使腺苷AR磷酸化合成三磷酸腺苷，其特征在于所述的生产方法包括如下步骤：

a）发酵反应锅中加去离子水，将水的温度升到30～42℃，定量投加啤酒酵母，再定量投加葡萄糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾溶液，调节pH值在6.0～7.0范围内，保持温度为30～42℃并发酵2.0～2.5小时提转化酶，得到发酵提酶液；上述各反应物的用量为：

啤酒酵母泥250～280g/L， 葡萄糖35～45 g/L，磷酸氢二钾25～30 g/L，磷酸二氢钾20～25 g/L；

b）发酵提酶液需经过板框过滤去除酶液中颗粒度较大的酵母泥杂质，得到粗滤提酶液；

c）经过板框过滤的粗滤提酶液再经过精度为0.1～10μm的微滤膜处理，进一步去除细微的酵母杂质，得到清酶液；

d）在清酶液中加入反应物腺苷20～40g/L，再加入营养物质硫酸镁1.6～2.0g/L，调节pH值在6.0～7.0范围内，并在温度为32～35℃条件下发酵4.0～6.0小时，腺苷由葡萄糖提供能量，在转化酶的催化作用下，腺苷磷酸化为三磷酸腺苷，三磷酸腺的浓度为36～72g/L；立即加冰水冷却，将温度降低到15～20℃；

e）采用截留分子量为150～500的纳滤膜，通过纳滤膜的选择透过性能使单价的离子透过膜，三磷酸腺苷溶液中80%以上的无机盐被去除，三磷酸腺苷因分子较大被纳滤膜截留在浓缩液中，得到三磷酸腺苷浓缩液；

f）经过去除无机盐的三磷酸腺苷浓缩液用去离子水稀释，使三磷酸腺苷的浓度调整到0.5～1.5%；

g）上述稀释后的三磷酸腺苷溶液通过201×7阴离子交换树脂吸附，树脂粒度0.315～1.25mm；吸附结束后用去离子水和0.04～0.06%氯化钠溶液洗涤，去除AR、AMP、ADP原料物和合成副产物，再用4.0～6.0%的氯化钠溶液洗脱，得到三磷酸腺苷洗脱液；

h）三磷酸腺苷洗脱液经过截留分子量为3000～10000的超滤膜处理去除蛋白质和热源，通过活性炭吸附去除色度物质；

i）上述经过超滤膜处理和活性炭吸附的三磷酸腺苷洗脱液经过无水乙醇沉淀、离心分离、淋洗和浸泡提纯，得到三磷酸腺苷固体，无水乙醇的用量为三磷酸腺苷超滤膜透过液的2.5～3.5倍，再经过38～42℃的真空干燥，得到三磷酸腺苷成品。

2.根据权利要求1所述的三磷酸腺苷（ATP）的生产方法，其特征在于所述的步骤a）中所加入的啤酒酵母，需先经过-15～-20℃冷冻处理，冷冻处理7～10天；

步骤c）中， 微滤膜的形式有平板式、中空纤维式，膜材料选用PP、N-6、PS、 PES、PVDF中的一种，操作压力小于1.0MPa，温度5～40℃；

步骤e）中，选用纳滤膜的形式包括平板式、中空纤维式，膜材料有芳香族聚酰胺复合膜、磺化聚醚砜，操作压力0.8～2.5MPa，温度5～40℃，浓缩3～10倍；

步骤g）中，纳滤脱盐工艺除盐后，201×7阴树脂的吸附ATP量由原来的5～13g/100g树脂，提高到24～28g/100g树脂，优于乙醇沉淀脱盐工艺吸附18～22 g/100g树脂的水平，并且无乙醇的使用；

步骤h）中，超滤工艺的超滤膜为卷式膜或中空纤维膜，操作压力0.2～1.5MPa，温度5～40℃，浓缩3～12倍，膜材料为PP、PAN、PS、 PES、PVDF中的任意一种；活性炭为果壳型粉末活性炭或粒状活性炭。