一种制备高纯度NAD的方法
技术领域
本发明涉及核苷酸类辅酶的纯化的技术领域,特别涉及对NAD的粗品溶液进行纯化的方法。
背景技术
NAD是氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)的英文缩写形式,是存在于包括人类细胞在内的所有活细胞中的一种生理物质,对身体无副作用,这种物质是很多可催化氧化—还原反应的酶的辅助因子,因此被称为辅酶Ⅰ。
NAD在生物体内参与细胞物质代谢、能量合成、细胞DNA修复等多种生理活动,是线粒体中能量产生链中的控制标志物,对机体免疫能力有重要作用。如今,NAD被广泛应用于化工催化反应、原料药生产、保健品生产、以及化妆品等行业,而随着对NAD在疾病的治疗和预防方面的深入研究,NAD作为医药保健品的重要性日益凸显出来,市场需求量逐年增加。
目前,NAD的制备方法主要分为化学合成法和生物催化法,其中的生物催化法又包括生物发酵法和酶催化法,因其相较于化学合成法具有绿色环保无公害的优点而逐渐成为主流方向。通过生物催化法制备NAD得到的粗产物溶液(酶反应液或者生物发酵液)中除NAD外还含有大量杂质,NAD的纯度只有20-40%,故还需经过进一步的分离纯化处理才能得到较为纯净的NAD产品。
中国发明专利CN105131065B一种氧化型辅酶I的制备方法以及中国发明专利CN105481923B一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法中均公开了一种NAD的分离纯化方法,其中都是主要采用树脂柱进行分离和纯化。这种利用树脂柱进行分离纯化的方法操作繁琐、耗时长且溶剂使用量大,不利于大工业化生产,其后期还需对树脂进行活化处理,会用到大量的酸、碱、盐等溶剂,环境污染较大且成本较高。
发明内容
本发明的目的在于解决现有的对NAD进行分离纯化的方法所存在的操作繁琐、耗时长、成本高、污染大的技术问题,提供一种操作简单快捷、成本低廉、污染小的制备高纯度NAD的方法,用于对NAD的粗品溶液进行纯化处理。
为实现上述目的,本发明提供了一种制备高纯度NAD的方法,包括:1)将NAD的粗品溶液的pH值调节至6.0~8.0,然后除去不溶物;2)升温至35±1℃,并加入乙醇至溶液中乙醇的终浓度为20%~40%体积分数,搅拌至澄清;3)降温至6±0.5℃,保持pH值为6.0~8.0进行结晶,待晶体析出后进行过滤,收集滤液;4)将步骤3)的滤液升温至25~30℃,然后调节pH值至1.5~3.0,并搅拌至澄清;5)加入NAD晶种,然后降温至12±0.5℃,保持pH值为1.5~3.0,待溶液中NAD的结晶率达到40%时,再加入乙醇至溶液中乙醇的终浓度为10%~30%体积分数,混合均匀;6)降温至3±0.5℃,保持pH值为1.5~3.0进行结晶,待溶液中NAD的结晶率在90%以上时,过滤,收集滤饼,经干燥后即得高纯度NAD产品。
本发明方法中,步骤1)的NAD的粗品溶液是指除了含有NAD之外还含有大量杂质的溶液,如:将从市场中购买的纯度不够高的NAD产品溶解于水后得到的溶液,或者生物催化法制备NAD得到的粗产物溶液。
优选地,控制NAD的粗品溶液的浓度为100~300mmol/L,以确保后期能够析出足够多的晶体,从而保证足够高的收率。
生物催化(biocatalysis)是指利用生物酶或者生物有机体(细胞、细胞器、组织等)作为催化剂进行物质转化的过程(分别称为酶催化和生物发酵),这种反应过程又称为生物转化(biotransformation)。生物催化中常用的生物有机体主要是微生物,其本质是利用微生物细胞内的酶进行催化,促进生物转化的进程。生物催化法具有作用条件温和(基本上在常温、中性、水等环境中完成);独特、高效的底物选择性(因为催化过程中的酶具有专一性的特点,即一种酶只能催化一种特定的底物发生反应,但是一种底物则可能被多种酶催化);对于手性活性药物成分的合成具有独特性的优点。
本发明所谓生物催化法制备NAD得到的粗产物溶液具体是指利用生物酶催化底物转化成NAD后的酶反应液,或者是利用含有生物酶的生物有机体经发酵培养和诱导表达后去除生物有机体后的含有NAD的生物发酵液。其中所谓生物酶是指可以特异性催化底物转化成NAD的酶,所谓底物是指可以转化成NAD的前体物质。譬如,底物可以是NMN和ATP,也可以是能够转化成NMN或者ATP的前体物质,与之对应的生物酶则是烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶,或者是烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和一种或者多种其他酶的联合使用。
本发明方法步骤1)中将pH值调节为6.0~8.0的作用在于:一方面使溶液中含有的杂质(主要为高价阳离子)以沉淀的形式析出;另一方面,为后续的结晶提供必要的pH条件。优选地,使用氢氧化钠调节pH值。
优选地,本发明方法步骤1)中,除去不溶物的方式为进行微滤处理。微滤又称微孔过滤,以微孔滤膜为过滤介质,在0.1~0.3MPa的压力推动下,截留0.1~1微米之间的颗粒和细菌,但能允许大分子有机物和无机盐等通过。本发明方法中使用的微滤膜优选为0.1~0.5μm孔径的中空纤维膜。
本发明方法步骤2)中升温至35±1℃的目的在于防止加入乙醇后溶液中形成胶状沉淀,从而吸附部分NAD,并且增加过滤的难度。
本发明方法步骤2)中加入乙醇溶液的作用在于:乙醇作为底物和副产物结晶的不良溶液,有利于加快和提高底物和副产物的结晶的转化率。
本发明方法步骤3)中,保持pH值为6.0~8.0的原因在于:NAD在6.0以上不能析出晶体,而杂质(主要为催化的底物、副产物和杂蛋白)结晶的适宜pH值则在6.0~8.0;降温至6±0.5℃有利于杂质最大限度地结晶析出。
当溶液中NAD的纯度大于80%时,对NAD进行结晶时的效率最好,得到的产品纯度最高。因此,本发明方法步骤3)中,优选地,待晶体析出至溶液中NAD的纯度在80%以上时,进行过滤。
本发明方法中的过滤是指采用物理方法将溶液中的固体和液体进行分离的过程,常见的过滤方法均适用于本发明,包括常压过滤、减压过滤、离心过滤等。优选地,本发明方法步骤3)中用500目的过滤装置进行过滤。
本发明方法步骤4)中,将pH值调节至1.5~3.0,有利于NAD结晶析出,优选地,选用盐酸调节pH值;升温至25~30℃可避免NAD在调节pH的过程中形成油状沉淀的过渡态,导致难以析出结晶。
优选地,本发明方法步骤5)中,NAD晶种的加入量为步骤3)的滤液中含有的NAD质量的0.5%~1.5%。
因直接将温度从25~30℃降至3±0.5℃或者一次性加入过量的乙醇溶液会造成NAD形成油状过渡态,从而延迟结晶时间、降低晶体的转化率甚至导致结晶失败。本发明方法步骤5)和步骤6)中,将NAD的结晶过程分为两个阶段操作,分别为:第一阶段降温至12±0.5℃,并在NAD的结晶率达到40%以上时加入乙醇至溶液中乙醇的终浓度为10%~30%体积分数;第二阶段降再温至3±0.5℃。这样做可有效避NAD形成油状过渡态的情况发生,从而提高了结晶效率和晶体转化率。
优选地,在对步骤6)的滤饼进行干燥之前,先用10~15℃的体积分数为30%±2%的乙醇水溶液对滤饼进行洗涤。
优选地,采用真空干燥法对步骤6)的滤饼进行干燥。
当NAD的粗品溶液为生物催化法制备NAD得到的粗产物溶液时,为了提高分离纯化的效率,同时提高NAD结晶的收率,优选地,本发明的方法还包括:在步骤1)之前,将粗产物溶液进行浓缩处理,以除去大量的水分。本发明中的浓缩是指采用物理方法使溶剂减少而提高溶液的浓度的过程,包括减压蒸馏法、超过滤法、透析法、吸附法、冷冻干燥法等。
优选地,上述浓缩处理采用纳滤浓缩。纳滤是一种介于反渗透和超滤之间的压力驱动膜分离过程,以纳滤膜为过滤介质,纳滤膜的孔径范围在几个纳米左右,允许溶剂分子或某些相对分子质量较小的溶质或低价离子透过,从而达到分离和浓缩的效果。优选地,本发明选用的纳滤膜的截留分子量为200~400道尔顿。
浓缩处理后的粗产物溶液的浓度过低会降低后续NAD结晶的收率,而浓度过高则会增大纳滤膜的压力,减短纳滤膜的寿命。优选地,将粗产物溶液浓缩至溶液中NAD的浓度为100~300mmol/L。
对于酶催化反应而言,在反应过程中还需使用铁、镍、镁等用于激活酶的激活剂,这些激活剂在纳滤浓缩的过程中会形成大量无机盐离子沉淀,从而堵塞纳滤膜,所以,优选地,在纳滤浓缩之前,需要对粗产物溶液进行如下预处理:将粗产物溶液的pH值调节至3.0~5.0,然后进行微滤处理,收集微滤液。
优选地,微滤过程中使用的微滤膜为0.1~0.5μm孔径的中空纤维膜。
有益效果:
与现有技术相比,本发明提供的NAD的纯化方法具有收率高和纯化产物纯度高的优点.,经工业实践证实,采用该纯化方法可从生物催化法制备NAD的粗产物溶液中制备得到纯度在99%以上的NAD纯品,且收率在85%以上。该纯化方法操作简单快捷,无需使用大量有毒有害试剂,对环境污染小,且纯化成本低廉,适宜规模化大工业化从生物酶反应液和生物发酵液中分离纯化NAD产品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明,以下实施例是对本发明的解释,本发明并不局限于以下实施例。
本发明提供的制备高纯度NAD的方法优选包括如下步骤:
1)将生物催化法制备NAD得到的粗产物溶液的pH值调节至3.0~5.0,然后用0.1~0.5μm孔径的中空纤维膜进行微滤,收集微滤液;
2)将步骤1)的微滤液用截留分子量为200~400道尔顿的纳滤膜进行纳滤浓缩至NAD的浓度为100~300mmol/L;
3)用氢氧化钠溶液将步骤2)浓缩后的溶液的pH值调节至6.0~8.0,然后用0.1~0.5μm孔径的中空纤维膜进行微滤,收集微滤液;
4)将步骤3)的微滤液升温至35±1℃,并加入乙醇至溶液中乙醇的终浓度为20%~40%体积分数,搅拌至澄清;
5)将步骤4)的澄清溶液降温至6±0.5℃,保持pH值为6.0~8.0进行结晶,待晶体析出至溶液中NAD的纯度在80%以上时,用500目的过滤装置进行过滤,收集滤液;
6)将步骤5)的滤液升温至25~30℃,然后用盐酸调节pH值至1.5~3.0,并搅拌至澄清;
7)向步骤6)的澄清溶液中加入占溶液中含有的NAD的质量的0.5%~1.5%的NAD晶种,然后降温至12±0.5℃,保持pH值为1.5~3.0,待溶液中NAD的结晶率达到40%时,再加入乙醇至溶液中乙醇的终浓度为10%~30%体积分数,混合均匀;
8)将步骤7)混合均匀的溶液降温至3±0.5℃,保持pH值为1.5~3.0进行结晶,待溶液中NAD的结晶率在90%以上时,过滤,收集滤饼;
9)用10~15℃的体积分数为30%±2%的乙醇水溶液对步骤8)的滤饼进行洗涤,然后将洗涤后的滤饼进行真空干燥,即得高纯度NAD产品。
实施例1
处理对象:邦泰生物工程(深圳)有限公司采用生物酶催化法(以NMN和ATP为底物,用烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶进行催化)制备NAD得到的四批粗产物溶液,测得这四批NAD粗产物溶液中NAD的含量和纯度如表1所示。
对上述四批NAD粗产物溶液的纯化过程如下:
1.用盐酸分别将上述四批NAD粗产物溶液的pH值调节至3.0~5.0,然后用0.1~0.5μm孔径的中空纤维膜进行微滤。
2.将微滤后的溶液用截留分子量为200~400道尔顿的纳滤膜进行纳滤浓缩,浓缩至溶液中NAD的浓度为100~300mmol/L。
3.用氢氧化钠将步骤2浓缩后的溶液的pH值调节至6.0~8.0,调pH的过程中会产生大量的沉淀,主要为高价阳离子沉淀,再次用0.1~0.5μm孔径的中空纤维膜进行微滤,去除沉淀。
4.将步骤3微滤后的微滤液转移至结晶釜中,开启搅拌装置,将结晶釜的夹套温度设置为35℃,加入乙醇至溶液中乙醇的终浓度为20~40%体积分数,搅拌至溶液澄清。
5.将结晶釜的夹套温度设置为6℃,当溶液温度降至6℃后,每隔3h取样检测溶液中NAD的纯度,在线监控溶液中的pH值,并随时用氢氧化钠将溶液的pH值保持在6.0~8.0;待溶液中NAD的纯度大于80%时,将溶液排出,用500目滤布过滤,收集滤液,并用高效液相色谱法检测所得滤液中NAD的纯度,即得上述四批NAD粗产物溶液经一次结晶后的纯度,结果如表2所示。
6.将步骤5过滤后的滤液转移至结晶釜中,将结晶釜的夹套温度设置为30℃,待溶液温度大于25℃时,用盐酸将溶液的pH值调节至1.5~3.0之间,并搅拌至澄清。
7.待溶液澄清后,加入占溶液中NAD质量的0.5%~1.5%的量的NAD晶种,并设置结晶釜的夹套温度为12℃,待溶液温度达到12℃后,每隔3h取样检测NAD的结晶率,当结晶率达到40%时,再向溶液中加入乙醇至溶液中乙醇的终浓度为10~30%体积分数,并用盐酸将溶液的pH值调节至1.5~3.0之间,混合均匀。
8.将结晶釜的夹套温度设置为3℃,待溶液到达3℃后,每隔4h取样检测溶液中NAD的转化率,在线监控溶液中的pH值,并随时用盐酸将溶液的pH值保持在1.5~3.0;待溶液中NAD的转化率达到90%以上时,将溶液排出,并进行过滤,然后用10~15℃的体积分数为30%的乙醇水溶液将滤饼洗涤3次,滤饼经真空干燥后即得高纯度NAD产品。
测定上述四批纯化后的NAD产品的重量及纯度,并计算收率,其结果如表3所示。
表1
表2
批次 |
溶液体积/L |
浓度(mmol/L) |
NAD纯度/% |
1 |
224 |
244 |
88.3 |
2 |
253 |
234 |
95.1 |
3 |
216 |
279 |
93.0 |
4 |
430 |
154 |
90.6 |
表3
批次 |
产品重量/g |
NAD纯度/% |
NAD收率/% |
1 |
32410 |
99.54 |
88.6 |
2 |
37050 |
99.39 |
93.2 |
3 |
36120 |
99.58 |
90.0 |
4 |
37900 |
99.62 |
86.2 |