CN105481923A - 一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，包括如下步骤：S1、破碎细胞；S2、浓缩：取S1中得到的清液A超滤，取超滤液纳滤得到浓缩液B，用盐酸水溶液调节浓缩液B的pH＝2-2.5得到浓缩液C；S3、洗脱；S4、分离：将S3中得到的综合液E纳滤得到浓缩液F；用硝酸水溶液调节浓缩液F的pH＝1-3，加丙酮沉淀，离心得到固体G；S5、纯化：将S4中得到固体G加水溶解，过制备色谱，脱盐，分离，收集分离液，浓缩，冻干得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。本发明制备得到的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸纯度高，收率好。

Description

一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法
技术领域
本发明涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸制备技术领域，尤其涉及一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(缩写为NAD)，也称为二磷酸吡啶核苷酸(缩写为DPN)，或辅脱氢酶Ⅰ或辅酶Ⅰ。在哺乳动物体内存在氧化型(NAD+)和还原型(NADH)两种状态，氧化型(NAD+)在260nm处具有最大紫外吸收光谱，通过各种脱氨酶，从底物中接受一个氢原子和一个电子，变成还原型(NADH)，在340nm处有最大吸收。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸参与细胞物质代谢、能量合成、细胞DNA修复等多种生理活动，对机体免疫能力有重要作用。在健康状态下，人体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度稳定，维持各项细胞正常功能。体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度决定了细胞衰老的过程和程度，浓度下降会加速细胞衰老的过程。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸主要存在于酵母细胞线粒体中，目前通常选用破壁和提纯的方法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，常用的破壁方法有温差法(热处理法)和高压均浆法，温差法破壁效果不理想，高压均浆法不适合工业化大生产，常用的提纯方法为柱洗脱，但是柱洗脱过程繁琐，耗时长，不利于工业化生产，溶剂使用量大，污染环境，制得的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸纯度低，收率低。因此需要提供一种新的制备方法。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，本发明操作简便，设备简单，适合工业化生产，大大缩短了制备时间，使用溶剂种类少、使用量少，使用的原料廉价易得，制备得到的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸纯度高，收率好。
本发明提出的一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，包括如下步骤：
S1、破碎细胞：将酵母细胞加入盐酸水溶液中浸泡0.5-2.5h，进行温差破壁处理后，用陶瓷膜过滤，取滤液得到清液A；
S2、浓缩：取S1中得到的清液A超滤，取超滤液纳滤得到浓缩液B，用盐酸水溶液调节浓缩液B的pH＝2-2.5得到浓缩液C；
S3、洗脱：将S2中得到的浓缩液C过D152树脂柱，用氨水洗脱，收集洗脱液D，用盐酸水溶液调节洗脱液D的pH＝7-8后，过717树脂柱，用氯化钾水溶液洗脱，收集得到综合液E；
S4、分离：将S3中得到的综合液E纳滤得到浓缩液F；用硝酸水溶液调节浓缩液F的pH＝1-3，加丙酮沉淀，离心得到固体G；
S5、纯化：将S4中得到固体G加水溶解，过制备色谱，脱盐，分离，收集分离液，浓缩，冻干得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
优选地，S1中，盐酸水溶液的质量分数为0.04-0.55wt％，酵母细胞和盐酸水溶液的重量体积(g/ml)比为3-5：16-80。
优选地，S1中，陶瓷膜孔径为40-80nm。
优选地，S2中，超滤膜的截留分子量为4000-6000D。
优选地，S2中，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为200-300D。
优选地，S3中，氨水的浓度为0.1-0.3mol/l。
优选地，S3中，氨水洗脱时，用核酸蛋白检测仪检测洗脱液D至核酸蛋白检测仪读数为200-570时停止洗脱。
优选地，S3中，氯化钾水溶液的浓度为0.1-0.3mol/l。
优选地，S3中，氯化钾水溶液洗脱时，用核酸蛋白检测仪检测综合液E至核酸蛋白检测仪读数为≤200时停止洗脱。
优选地，S4中，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为200-300D。
优选地，S4中，浓缩液F和丙酮的重量比为1：4-8。
优选地，S5中，固体G和水的重量体积(g/ml)比为1-2：5。
优选地，S5中，制备色谱的固定相为改性硅胶。
优选地，S5中，脱盐时用质量分数为1-3wt％甲醇水溶液以20-30ml/mim的速度洗涤，其中，固体G、甲醇水溶液的重量体积(g/ml)比为1-2：55-80。
优选地，S5中，分离时用30-40min内，质量分数由3wt％匀速增至10wt％的甲醇水溶液梯度洗脱，其中，洗脱速度为20-30ml/min，2-4g的固体G所用洗脱时间为30-40min。
上述水均为去离子水。
上述“过柱”是本专业常用术语，是分离物质的一种方法。
上述丙酮和甲醇均可回收利用。
上述S2中，超滤是一种过滤方法。
上述S2和S3中，盐酸水溶液的作用是调节pH，不规定其质量分数，根据具体操作确定其质量分数。
上述S2和S4中，纳滤是一种过滤方法。
上述S3中，D152树脂为大孔弱酸阳离子树脂，717树脂为强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。
上述S4中，硝酸水溶液的作用是调节pH，不规定其质量分数，根据具体操作确定其质量分数。
本发明选用盐酸浸泡酵母细胞后，再进行温差破壁，可以使酵母细胞壁更容易破碎，促进更多的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸溶出；用陶瓷膜过滤去除菌体蛋白，超滤去除大分子的蛋白质和杂质，纳滤去除无机盐和水，再经柱洗脱提纯，与常用的柱洗脱方法相比，大大缩短了柱洗脱的工序，大大节省了时间，操作简便，适合工业化生产，且可避免其他杂质的干扰，大大增加了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的纯度和收率；综合液E纳滤得到浓缩液F后，再经丙酮沉淀，可大大减少丙酮的用量，减少环境污染，并可增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的收率；固体G经过制备色谱的脱盐、分离，可以大大增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的纯度；制备色谱用的有机溶剂为甲醇，甲醇和丙酮均匀廉价易得可降低本发明的成本，且溶剂用量少，回收利用，可减少环境污染。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，包括如下步骤：
S1、破碎细胞：将酵母细胞加入质量分数为0.04wt％盐酸水溶液中浸泡2.5h，进行温差破壁处理后，用孔径为40nm的陶瓷膜过滤，取滤液得到清液A，其中，酵母细胞和盐酸水溶液的重量体积(g/ml)比为5：16；
S2、浓缩：取S1中得到的清液A超滤，取超滤液纳滤得到浓缩液B，用盐酸水溶液调节浓缩液B的pH＝2.5得到浓缩液C，其中，超滤膜的截留分子量为4000D，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为300D；
S3、洗脱：将S2中得到的浓缩液C过D152树脂柱，用浓度为0.1mol/l的氨水洗脱，收集洗脱液D，用核酸蛋白检测仪检测洗脱液D至核酸蛋白检测仪读数为570时停止洗脱，用盐酸水溶液调节洗脱液D的pH＝7后，过717树脂柱，用浓度为0.3mol/l的氯化钾水溶液洗脱，收集得到综合液E，用核酸蛋白检测仪检测综合液E至核酸蛋白检测仪读数为≤200时停止洗脱；
S4、分离：将S3中得到的综合液E纳滤得到浓缩液F；用硝酸水溶液调节浓缩液F的pH＝1，加丙酮沉淀，离心得到固体G，其中，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为300D，浓缩液F和丙酮的重量比为1：4；
S5、纯化：将S4中得到固体G加水溶解，过固定相为改性硅胶的制备色谱，脱盐，分离，收集分离液，浓缩，冻干得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中，固体G和水的重量体积(g/ml)比为2：5，脱盐时用质量分数为1wt％甲醇水溶液以30ml/mim的速度洗涤，其中，固体G、甲醇水溶液的重量体积(g/ml)比为1：80，分离时用30min内，质量分数由3wt％匀速增至10wt％的甲醇水溶液梯度洗脱，其中，洗脱速度为30ml/min，2g的固体G所用洗脱时间为30min。
实施例2
一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，包括如下步骤：
S1、破碎细胞：将酵母细胞加入质量分数为0.55wt％盐酸水溶液中浸泡0.5h，进行温差破壁处理后，用孔径为80nm的陶瓷膜过滤，取滤液得到清液A，其中，酵母细胞和盐酸水溶液的重量体积(g/ml)比为3：80；
S2、浓缩：取S1中得到的清液A超滤，取超滤液纳滤得到浓缩液B，用盐酸水溶液调节浓缩液B的pH＝2得到浓缩液C，其中，超滤膜的截留分子量为6000D，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为200D；
S3、洗脱：将S2中得到的浓缩液C过D152树脂柱，用浓度为0.3mol/l的氨水洗脱，收集洗脱液D，用核酸蛋白检测仪检测洗脱液D至核酸蛋白检测仪读数为200时停止洗脱，用盐酸水溶液调节洗脱液D的pH＝8后，过717树脂柱，用浓度为0.1mol/l的氯化钾水溶液洗脱，收集得到综合液E，用核酸蛋白检测仪检测综合液E至核酸蛋白检测仪读数为≤200时停止洗脱；
S4、分离：将S3中得到的综合液E纳滤得到浓缩液F；用硝酸水溶液调节浓缩液F的pH＝3，加丙酮沉淀，离心得到固体G，其中，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为200D，浓缩液F和丙酮的重量比为1：8；
S5、纯化：将S4中得到固体G加水溶解，过固定相为改性硅胶的制备色谱，脱盐，分离，收集分离液，浓缩，冻干得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中，固体G和水的重量体积(g/ml)比为1：5，脱盐时用质量分数为3wt％甲醇水溶液以20ml/mim的速度洗涤，其中，固体G、甲醇水溶液的重量体积(g/ml)比为2：55，分离时用40min内，质量分数由3wt％匀速增至10wt％的甲醇水溶液梯度洗脱，其中，洗脱速度为20ml/min，4g的固体G所用洗脱时间为40min。
实施例3
一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，包括如下步骤：
S1、破碎细胞：将酵母细胞加入质量分数为0.1wt％盐酸水溶液中浸泡2h，进行温差破壁处理后，用孔径为50nm的陶瓷膜过滤，取滤液得到清液A，其中，酵母细胞和盐酸水溶液的重量体积(g/ml)比为9：80；
S2、浓缩：取S1中得到的清液A超滤，取超滤液纳滤得到浓缩液B，用盐酸水溶液调节浓缩液B的pH＝2.4得到浓缩液C，其中，超滤膜的截留分子量为4500D，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为300D；
S3、洗脱：将S2中得到的浓缩液C过D152树脂柱，用浓度为0.15mol/l的氨水洗脱，收集洗脱液D，用核酸蛋白检测仪检测洗脱液D至核酸蛋白检测仪读数为500时停止洗脱，用盐酸水溶液调节洗脱液D的pH＝7.3后，过717树脂柱，用浓度为0.25mol/l的氯化钾水溶液洗脱，收集得到综合液E，用核酸蛋白检测仪检测综合液E至核酸蛋白检测仪读数为≤200时停止洗脱；
S4、分离：将S3中得到的综合液E纳滤得到浓缩液F；用硝酸水溶液调节浓缩液F的pH＝1.5，加丙酮沉淀，离心得到固体G，其中，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为300D，浓缩液F和丙酮的重量比为1：5；
S5、纯化：将S4中得到固体G加水溶解，过固定相为改性硅胶的制备色谱，脱盐，分离，收集分离液，浓缩，冻干得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中，固体G和水的重量体积(g/ml)比为1.8：5，脱盐时用质量分数为1.5wt％甲醇水溶液以27ml/mim的速度洗涤，其中，固体G、甲醇水溶液的重量体积(g/ml)比为3：175，分离时用32min内，质量分数由3wt％匀速增至10wt％的甲醇水溶液梯度洗脱，其中，洗脱速度为27ml/min，2.5g的固体G所用洗脱时间为32min。
实施例4
一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，包括如下步骤：
S1、破碎细胞：将酵母细胞加入质量分数为0.4wt％盐酸水溶液中浸泡1h，进行温差破壁处理后，用孔径为70nm的陶瓷膜过滤，取滤液得到清液A，其中，酵母细胞和盐酸水溶液的重量体积(g/ml)比为7：120；
S2、浓缩：取S1中得到的清液A超滤，取超滤液纳滤得到浓缩液B，用盐酸水溶液调节浓缩液B的pH＝2.2得到浓缩液C，其中，超滤膜的截留分子量为5500D，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为200D；
S3、洗脱：将S2中得到的浓缩液C过D152树脂柱，用浓度为0.25mol/l的氨水洗脱，收集洗脱液D，用核酸蛋白检测仪检测洗脱液D至核酸蛋白检测仪读数为300时停止洗脱，用盐酸水溶液调节洗脱液D的pH＝7.7后，过717树脂柱，用浓度为0.15mol/l的氯化钾水溶液洗脱，收集得到综合液E，用核酸蛋白检测仪检测综合液E至核酸蛋白检测仪读数为≤200时停止洗脱；
S4、分离：将S3中得到的综合液E纳滤得到浓缩液F；用硝酸水溶液调节浓缩液F的pH＝2.5，加丙酮沉淀，离心得到固体G，其中，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为200D，浓缩液F和丙酮的重量比为1：7；
S5、纯化：将S4中得到固体G加水溶解，过固定相为改性硅胶的制备色谱，脱盐，分离，收集分离液，浓缩，冻干得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中，固体G和水的重量体积(g/ml)比为1.2：5，脱盐时用质量分数为2.5wt％甲醇水溶液以23ml/mim的速度洗涤，其中，固体G、甲醇水溶液的重量体积(g/ml)比为3：100，分离时用38min内，质量分数由3wt％匀速增至10wt％的甲醇水溶液梯度洗脱，其中，洗脱速度为23ml/min，3.5g的固体G所用洗脱时间为38min。
实施例5
一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，包括如下步骤：
S1、破碎细胞：将酵母细胞加入质量分数为0.3wt％盐酸水溶液中浸泡1.5h，进行温差破壁处理后，用孔径为70nm的陶瓷膜过滤，取滤液得到清液A，其中，酵母细胞和盐酸水溶液的重量体积(g/ml)比为2：25；
S2、浓缩：取S1中得到的清液A超滤，取超滤液纳滤得到浓缩液B，用盐酸水溶液调节浓缩液B的pH＝2.3得到浓缩液C，其中，超滤膜的截留分子量为5000D，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为300D；
S3、洗脱：将S2中得到的浓缩液C过D152树脂柱，用浓度为0.2mol/l的氨水洗脱，收集洗脱液D，用核酸蛋白检测仪检测洗脱液D至核酸蛋白检测仪读数为350时停止洗脱，用盐酸水溶液调节洗脱液D的pH＝7.5后，过717树脂柱，用浓度为0.2mol/l的氯化钾水溶液洗脱，收集得到综合液E，用核酸蛋白检测仪检测综合液E至核酸蛋白检测仪读数为≤200时停止洗脱；
S4、分离：将S3中得到的综合液E纳滤得到浓缩液F；用硝酸水溶液调节浓缩液F的pH＝2，加丙酮沉淀，离心得到固体G，其中，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为300D，浓缩液F和丙酮的重量比为1：6；
S5、纯化：将S4中得到固体G加水溶解，过固定相为改性硅胶的制备色谱，脱盐，分离，收集分离液，浓缩，冻干得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中，固体G和水的重量体积(g/ml)比为3：10，脱盐时用质量分数为2wt％甲醇水溶液以25ml/mim的速度洗涤，其中，固体G、甲醇水溶液的重量体积(g/ml)比为3：130，分离时用35min内，质量分数由3wt％匀速增至10wt％的甲醇水溶液梯度洗脱，其中，洗脱速度为25ml/min，3g的固体G所用洗脱时间为35min。
试验例1
测定实施例1-5制备得到的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的纯度和收率，并与温差法-柱洗脱方法制备得到的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作比较，结果如下表：
项目 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 对照组
纯度(％) 99.1 99.0 99.2 99.1 99.3 96.5
收率(％) 0.139 0.141 0.140 0.143 0.145 0.071
其中，收率(％)＝烟酰胺腺嘌呤二核苷酸重/酵母细胞重×100％
由上表可知，本发明的收率好，制备得到的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸纯度高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、破碎细胞：将酵母细胞加入盐酸水溶液中浸泡0.5-2.5h，进行温差破壁处理后，用陶瓷膜过滤，取滤液得到清液A；
S2、浓缩：取S1中得到的清液A超滤，取超滤液纳滤得到浓缩液B，用盐酸水溶液调节浓缩液B的pH＝2-2.5得到浓缩液C；
S3、洗脱：将S2中得到的浓缩液C过D152树脂柱，用氨水洗脱，收集洗脱液D，用盐酸水溶液调节洗脱液D的pH＝7-8后，过717树脂柱，用氯化钾水溶液洗脱，收集得到综合液E；
S4、分离：将S3中得到的综合液E纳滤得到浓缩液F；用硝酸水溶液调节浓缩液F的pH＝1-3，加丙酮沉淀，离心得到固体G；
S5、纯化：将S4中得到固体G加水溶解，过制备色谱，脱盐，分离，收集分离液，浓缩，冻干得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
2.根据权利要求1所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，S1中，盐酸水溶液的质量分数为0.04-0.55wt％，酵母细胞和盐酸水溶液的重量体积(g/ml)比为3-5：16-80。
3.根据权利要求1或2所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，S1中，陶瓷膜孔径为40-80nm。
4.根据权利要求1-3任一项所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，S2中，超滤膜的截留分子量为4000-6000D；优选地，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为200-300D。
5.根据权利要求1-4任一项所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，S3中，氨水的浓度为0.1-0.3mol/l；优选地，氨水洗脱时，用核酸蛋白检测仪检测洗脱液D至核酸蛋白检测仪读数为200-570时停止洗脱；优选地，氯化钾水溶液的浓度为0.1-0.3mol/l；优选地，氯化钾水溶液洗脱时，用核酸蛋白检测仪检测综合液E至核酸蛋白检测仪读数为≤200时停止洗脱。
6.根据权利要求1-5任一项所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，S4中，纳滤膜为聚醚砜膜，纳滤膜的截留分子量为200-300D；优选地，浓缩液F和丙酮的重量比为1：4-8。
7.根据权利要求1-6任一项所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，S5中，固体G和水的重量体积(g/ml)比为1-2：5。
8.根据权利要求1-7任一项所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，S5中，制备色谱的固定相为改性硅胶。
9.根据权利要求1-8任一项所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，S5中，脱盐时用质量分数为1-3wt％甲醇水溶液以20-30ml/mim的速度洗涤，其中，固体G、甲醇水溶液的重量体积(g/ml)比为1-2：55-80。
10.根据权利要求1-9任一项所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，其特征在于，S5中，分离时用30-40min内，质量分数由3wt％匀速增至10wt％的甲醇水溶液梯度洗脱，其中，洗脱速度为20-30ml/min，2-4g的固体G所用洗脱时间为30-40min。
CN201511022464.3A 2015-12-30 2015-12-30 一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法 Active CN105481923B (zh)

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