CN101638401A - 一种高纯度丹酚酸b的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高纯度丹酚酸B的制备方法，所述的方法包括步骤：(1)将丹参水提物和禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)静息细胞混合，在20－35℃生物转化24－90小时，得到去除迷迭香酸的丹参水提物；和(2)去除迷迭香酸的丹参水提物经反相树脂吸附，通过水或甲醇水溶液洗脱得到高纯度的丹酚酸B。本发明提供的制备方法所得到的丹酚酸B纯度≥99％，回收率＞60％，工艺简单、成本低。

Description

一种高纯度丹酚酸B的制备方法

技术领域

本发明涉及植物纯化领域，尤其涉及一种从丹参中提取高纯度丹酚酸B的方法。

背景技术

已有的丹酚酸B的分离纯化方法主要是通过大孔吸附树脂分离或者高速逆流色谱分离。

大孔吸附树脂分离的主要缺点是制备得到的丹酚酸B样品纯度较低。CN1247855A公开了丹参多酚酸镁盐的制备方法，其主要有效成分为丹酚酸B镁盐，但是其含量只能达到60％。CN1240695C公开的丹酚酸B的提取工艺，采用硅胶柱层析分离纯化丹酚酸B，得到的纯度50％-96％的丹酚酸B，但是过程复杂，并且采用硅胶柱层析成本较高，操作过程烦琐，难以扩大到生产。Xiao Wang等在J.Sep.Sci.30(2007)，3214-3217描述了采用高速逆流色谱法分离纯化丹酚酸B的工艺，显示pH梯度逆流色谱可以将丹酚酸B纯化到94.1％，并可能应用于大批量生产。但是其工艺复杂，并且成本高。CN1876641A中将丹参采用微波处理，离心去除沉淀后上聚酰胺树脂，采用乙醇梯度洗脱，得到纯度达到95％的丹酚酸B，所述丹酚酸B的纯度不是太高，同时文中也没有提及其收率。

因此，本领域迫切需要提供一种制备高纯度丹酚酸B的方法，该方法应当工艺简单、成本低，而且收率高。

发明内容

本发明旨在提供一种高纯度丹酚酸B的制备方法。

在本发明中，提供了一种高纯度丹酚酸B的制备方法，所述的方法包括步骤：

(1)将丹参水提物和禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)静息细胞接触，在20-35℃生物转化24-90小时，得到去除迷迭香酸的丹参水提物；和

(2)去除迷迭香酸的丹参水提物经反相树脂吸附，通过水或甲醇水溶液洗脱得到高纯度的丹酚酸B，所述的丹酚酸B的纯度≥97w/w％。

在另一优选例中，所述的丹酚酸B的纯度≥99w/w％。

在另一优选例中，将以干品计20-70g的丹参水提物和10⁹-10¹⁰个/ml禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)静息细胞混合。

在另一优选例中，将以干品计40-50g的丹参水提物和5×10⁹-10¹⁰个/ml禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)静息细胞混合。

在另一优选例中，所述的禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)静息细胞是处于对数生长期后期的静息细胞。

在另一优选例中，所述的丹参水提物以干品为基准，其中的丹酚酸B含量为10-60w/w％。

在另一优选例中，所述的丹参水提物以干品为基准，其中的丹酚酸B含量为20-60w/w％。

在另一优选例中，在步骤(1)的放置过程中通入空气并搅拌或振荡。

在另一优选例中，步骤(1)中，在22-32℃放置30-80小时。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述的反相树脂是以聚苯乙烯为基质的树脂。

在另一优选例中，步骤(2)中，将步骤(1)得到的转化液调节pH1-3，经反相树脂吸附，通过甲醇水溶液洗脱得到高纯度的丹酚酸B；或将步骤(1)得到的转化液调节pH6-9，经反相树脂吸附，通过水洗脱得到高纯度的丹酚酸B。

在另一优选例中，通过甲醇水溶液梯度洗脱得到高纯度的丹酚酸B，所述的甲醇水溶液中的甲醇含量为35-70v/v％。

在另一优选例中，所述的甲醇水溶液中的甲醇含量为40-60v/v％。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤：

(a)将丹参水提物和禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)静息细胞混合，在20-35℃通入空气，搅拌或振荡24-90小时，得到去除迷迭香酸的丹参水提物；

(b)将去除迷迭香酸的丹参水提物离心除去菌体，调节pH1-3过滤，除去沉淀得到滤液；和

(c)滤液调节pH1-3，经反相树脂吸附，通过甲醇水溶液洗脱得到高纯度的丹酚酸B；或滤液调节pH6-9，经反相树脂吸附，通过水洗脱得到高纯度的丹酚酸B。

据此，本发明提供了一种制备高纯度丹酚酸B的方法，该方法工艺简单、成本低，而且收率高。

附图说明

图1显示了丹参水提物的HPLC图谱。

图2显示了丹参水提物在使用禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)生物转化前后的HPLC图谱；其中

A为转化前的，B为转化后的。(因采用的色谱柱不同，主要化合物的保留时间略有不同，但经过与标准品和其紫外图谱的对比，确定了其主要的化合物的吸收峰。)

图3显示了本发明提供的制备方法的流程。

图4显示了实施例2制备得到的丹酚酸B的HPLC图谱。

具体实施方式

为了从丹参水提物中获得高纯度和高回收率的丹酚酸B，发明人经过广泛而深入的研究，发现了一种制备方法，就是利用微生物细胞中的酶等生物活性成分将在反相高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)中保留时间与丹酚酸B很接近的迷迭香酸分解成小分子物质，然后将经生物转化的丹参水提物通过pH调节使成中性或弱碱性或成酸性，由反相树脂吸附后，经水或甲醇水溶液洗脱，便能得到高纯度的丹酚酸B，该制备方法的丹酚酸B的回收率也很高。

定义

丹参(Radix Salviae Miltiorrhizae)，唇形科鼠尾草属植物丹参的根。

丹酚酸B的化学结构如式I所示：

迷迭香酸的化学结构如式II所示：

如本文所用，“丹参水提物”是指丹参经水提取所获得的物质，其中丹酚酸B的含量，以干品为基准，为10-60w/w％，较佳地为20-60w/w％。它可以通过本领域技术人员熟知的方法获得，例如，将丹参和水混合，加热(60-100℃，优选80-100℃)提取1-5次(优选2-4次)，合并滤液而得。一种优选的方法是将丹参和水混合，加热(60-100℃，优选80-100℃)提取1-5次(优选2-4次)，减压浓缩后调节pH1-3，加乙酸乙酯萃取1-3次(优选2次)，除去多糖得到的。

在本发明中，将禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)静息细胞和丹参水提物接触，使丹参水提物中的迷迭香酸分解成小分子物质。所述的接触包括将静息细胞加入到丹参水提物中，将丹参水提物加入到静息细胞中，和将静息细胞和丹参水提物加入到溶液中混合。在本发明中，将以干品计20-70g的丹参水提物和10⁹-10¹⁰个/ml禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)静息细胞接触，优选地，将以干品计40-50g的丹参水提物和5×10⁹-10¹⁰个/ml禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)静息细胞接触。所述的禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)可以通过本领域技术人员熟知的方法获得，例如可购自中国农业微生物菌种保藏中心，菌株保藏编号30068。

如本文所用，“静息细胞”是指禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)经培养基培养至对数生长期后期的菌体。所述的培养基可以是本领域技术人员常用的适合禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)，例如但不限于，PDA培养基、或其它一些真菌培养基。一种优选的获得静息细胞的方法，是将禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)菌株在PDA培养基中培养之对数生长期后期，离心收集菌体，以无菌水洗涤菌体1-3次(优选1-2次)得到。

如本文所用，“生物转化”是指利用静息细胞中的酶等生物活性成分将在反相HPLC中保留时间与丹酚酸B很接近的迷迭香酸分解成小分子物质的过程。

在本发明中所述的反相HPLC的方法，是进行丹酚酸B可以是本领域常用的药典中规定的检测丹酚酸B含量的方法，一种优选的HPLC方法是色谱柱：C18，Hypersil ODS2，250mm×4.6mm，5μm，大连伊利特分析仪器有限公司出品，流动相：1.7％乙酸水溶液∶甲醇∶乙腈＝67∶28∶5，流速0.8ml/min，检测波长281nm。

如本文所用，“反相树脂”是指树脂的基质为极性较低的化合物，待分离的化合物被树脂吸附后，采用极性较大的流动相进行洗脱，并逐渐降低流动相的极性，在洗脱过程中可实现化合物的分离，直至待分离物质被洗脱。同本领域熟知的大孔非极性吸附树脂的性质和使用方法相同。其实大孔非极性吸附树脂就是一种反相树脂。本发明优选采用苯乙烯为桥架材料制成的吸附层析担体，即聚苯乙烯作为基质的树脂，树脂粒径40-100微米。更佳地本发明可以采用amberlite XAD系列和三菱化成公司生产的HP系列及其类似的国产树脂，如XAD-2，HP-20和安徽三星树脂科技有限公司的YPR-II树脂等。

制备方法

本发明提供的高纯度丹酚酸B的制备方法，包括步骤：

(1)将以干品计20-70g的丹参水提物和10⁹-10¹⁰个/ml禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)静息细胞接触，在20-35℃放置24-90小时，得到去除迷迭香酸的丹参水提物；和

(2)去除迷迭香酸的丹参水提物经反相树脂吸附，通过水或甲醇水溶液洗脱得到高纯度的丹酚酸B。

较佳地，将以干品计40-50g的丹参水提物和5×10⁹-10¹⁰个/ml 10⁹静息细胞混合。

较佳地，在22-32℃通入空气，搅拌或振荡30-80小时，得到去除迷迭香酸的丹参水提物；更佳地，在25-30℃通入空气，搅拌或振荡36-72小时，得到去除迷迭香酸的丹参水提物。

在本发明的一个优选例中，将丹参水提物和静息细胞混合，进行生物转化的过程是通过HPLC跟踪的，一般是待迷迭香酸峰恰好消失时，将去除迷迭香酸的丹参水提物离心去除菌体，终止转化。

在本发明的一个优选例中，去除迷迭香酸的丹参水提物在上反相树脂前，可以将其调节pH1-3，静置15分钟以上(优选20-40分钟)，过滤除去不溶性沉淀。

去除迷迭香酸的丹参水提物在上反相树脂前，根据随后将采取的洗脱方式，进行pH调节。

如果调节pH为酸性，那么在上反相树脂后，可以先用蒸馏水洗脱树脂柱，除去无机盐和极性色素；再用低浓度的甲醇水溶液(35-55v/v％甲醇，优选40-50v/v％)洗脱HPLC中保留时间小于丹酚酸B的杂质，直至洗脱完毕；然后再用高浓度的甲醇水溶液(45-70v/v％甲醇，优选50-60v/v％)，将丹酚酸B洗脱下来。

如果调节pH为中性或偏碱，可以是丹酚酸B成盐，但同时又不破坏丹酚酸B，那么在上反相微球树脂后，可以仅用水洗脱，得到高纯度的丹酚酸B。本发明提供的这种单纯用水洗脱的方法，还可以应用于含有羧基、磺酸基等酸性基团的物质的分离纯化。

在本发明的一个优选例中，高纯度丹酚酸B的制备方法包括步骤：

(a)配制pH7的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液，将静息细胞和丹参水提物(已经除去多糖)加入到缓冲液中，通气搅拌，转化，HPLC检测，待迷迭香酸恰好被水解完毕后，离心或过滤除去菌体，中止转化，得到去除迷迭香酸的丹参水提物；

(b)将去除迷迭香酸的丹参水提物调节pH1-3(优选pH2)，静置，过滤除去不溶性沉淀；

(c)将步骤(b)得到的滤液调节pH1-4(优选pH3)，上反相树脂柱，流速，1倍柱体积/小时；

(d)5倍柱体积的蒸馏水洗脱树脂柱，流速，3倍柱体积/小时，除去无机盐和极性色素；

(e)45％的甲醇洗脱树脂柱，流速，2倍柱体积/小时，分步收集，HPLC检测，待保留时间小于丹酚酸B的杂质洗脱完毕后停止洗脱；

(f)55％甲醇洗脱丹酚酸B，流速，2倍柱体积/小时，HPLC检测，待丹酚酸B洗脱基本完毕时中止洗脱；

(g)将丹酚酸B浓缩，调节pH2后乙酸乙酯萃取除盐，回收乙酸乙酯后以水溶解丹酚酸B，冷冻干燥，得到丹酚酸B纯度大于97％的样品。

在本发明的另一优选例中，高纯度丹酚酸B的制备方法包括步骤：

(i)配制pH7的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液，将静息细胞和丹参水提物(已经除去多糖)加入到缓冲液中，通气搅拌，转化，HPLC检测，待迷迭香酸恰好被水解完毕后，离心或过滤除去菌体，中止转化，得到去除迷迭香酸的丹参水提物；

(ii)将去除迷迭香酸的丹参水提物调节pH1-3(优选pH2)，静置，过滤除去不溶性沉淀；

(iii)将步骤(b)得到的滤液调节pH6-9(优选pH7)，使丹酚酸B成为钠盐，上反相树脂柱，流速5倍柱体积/小时；上柱后以去离子水洗脱树脂柱，流速5倍柱体积/小时，分布收集，HPLC检测，合并纯度达标的丹酚酸B样品；

(iv)浓缩，调节pH2后乙酸乙酯萃取除盐，回收乙酸乙酯后以水溶解丹酚酸B，冷冻干燥，得到纯度超过99％的丹酚酸B样品。

对于纯度未达标的丹酚酸B洗脱液，可以收集后重复上述步骤进行分离。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明(采用水洗脱的方法)的主要优点在于：

1、纯化得到的丹酚酸B纯度更高，可以有效去除甲醇洗脱不能够有效分离的杂质，可以将丹酚酸B纯化到100％(高效液相纯度)。

2、分离过程中不用有机溶剂，降低了工作环境和产物的毒性。

3、使用水做为洗脱剂，有效降低了分离的成本。

4、节省了分离工作所需要的时间，提高了工作效率。

5、对于纯度未达到要求的洗脱液，可以重复分离，明显提高了收率(该步骤收率可以达到80％)。

6、在分离过程中，先流出的有色物质基本不含丹酚酸B，HPLC亦不能检出。因此，该方法可以有效去除丹酚酸B中HPLC不能检测的杂质，有效提高丹酚酸B的毫克效价。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

称取丹参干药材100g(丹酚酸B含量2％)，加入400ml水90℃提取两次，合并两次滤液，减压浓缩至50ml，调节pH2，加入50ml乙酸乙酯萃取两次，合并两次乙酸乙酯液，浓缩回收乙酸乙酯。将浓缩残渣以200mlpH7的磷酸缓冲液溶解，加入禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)湿菌体10g，于28℃摇床上振荡，转化36小时，得到无迷迭香酸的丹酚酸粗提液。将该粗提液过滤除菌后调节pH2，静置沉淀杂质，过滤后上反相树脂XAD-2，树脂体积200ml。上柱后1000ml水洗脱树脂柱，后再以45％的甲醇洗脱树脂柱至保留时间小于丹酚酸B的杂质去除完全。以55％甲醇洗脱树脂柱至丹酚酸B洗脱完全。合并纯度达标的丹酚酸B洗脱液，浓缩后调节至pH2后以乙酸乙酯萃取除盐，回收乙酸乙酯后以水溶解丹酚酸B，冻干，得到丹酚酸B高纯度样品纯度97.1％。

各部分丹酚酸B损失及总收率：

1.水提取，损失10％丹酚酸B

2.微生物转化除迷迭香酸，损失10％丹酚酸B

3.45％甲醇除保留时间小于丹酚酸B的极性物质，损失30％丹酚酸B丹酚酸B(纯度大于97％)。

总收率：50％。

实施例2

称取丹参干药材100g(丹酚酸B含量2％)，加入400ml水90℃提取两次，合并两次滤液，减压浓缩至50ml，调节pH2，加入50ml乙酸乙酯萃取两次，合并两次乙酸乙酯液，浓缩回收乙酸乙酯。将浓缩残渣以200mlpH7的磷酸缓冲液溶解，加入禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)湿菌体10g，于28℃摇床上振荡，转化36小时，得到无迷迭香酸的丹酚酸粗提液。将该粗提液过滤除菌，然后调节pH2，静置沉淀杂质，过滤后将滤液调节pH7，上反相树脂HP-20，水洗脱，收集纯度达到99％的丹酚酸B洗脱液，合并，调节至pH2后以乙酸乙酯萃取除盐，回收乙酸乙酯后以水溶解丹酚酸B，冻干。将纯度不达标的洗脱液重复上柱分离，共得到丹酚酸B 1.31g纯度超过99％。

最终制得的丹酚酸B的HPLC图谱如图4。

各部分丹酚酸B损失及总收率：

水提取、微生物转化收率同甲醇洗脱法，水洗脱去纯化丹酚酸B损失丹酚酸B小于总量的20％；丹酚酸B(纯度大于99％)。

总收率：大于60％。

实施例3

称取丹参干药材100g(丹酚酸B含量2％)，加入400ml水90℃提取两次，合并两次滤液，减压浓缩至50ml，调节pH2，加入50ml乙酸乙酯萃取两次，合并两次乙酸乙酯液，浓缩回收乙酸乙酯。将浓缩残渣以200mlpH7的磷酸缓冲液溶解，加入禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)湿菌体20g，于28℃摇床上振荡，转化36小时，得到无迷迭香酸的丹酚酸粗提液。将该粗提液过滤除菌，然后调节pH2，静置沉淀杂质，过滤后将滤液调节pH7，上反相树脂，水洗脱，收集纯度达到99.5％的丹酚酸B洗脱液，合并，调节至pH2后以乙酸乙酯萃取除盐，回收乙酸乙酯后以水溶解丹酚酸B，冻干。将纯度不达标的洗脱液重复上柱分离，共得到丹酚酸B 1.02g液相纯度100％。

实施例4

称取丹参干药材100g(丹酚酸B含量2％)，加入400ml水90℃提取两次，合并两次滤液，减压浓缩至50ml，调节pH1，乙酸乙酯萃取两次，合并两次乙酸乙酯液，浓缩回收乙酸乙酯。将浓缩残渣以200mlpH7的磷酸缓冲液溶解，加入禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)湿菌体7g，于28℃摇床上振荡，转化72小时，得到无迷迭香酸的丹酚酸粗提液。将该粗提液过滤除菌，然后调节pH2，静置沉淀杂质，过滤后将滤液调节pH7，上反相树脂柱，水洗脱，收集纯度达到99.5％的丹酚酸B洗脱液，合并，调节至pH2后以乙酸乙酯萃取除盐，回收乙酸乙酯后以水溶解丹酚酸B，冻干。将纯度不达标的洗脱液重复上柱分离，共得到丹酚酸B 1.21g液相纯度99.8％。

实施例5

称取丹参干药材100g(丹酚酸B含量2％)，加入400ml水90℃提取两次，合并两次滤液，减压浓缩至50ml，调节pH2，加入50ml乙酸乙酯萃取两次，合并两次乙酸乙酯液，浓缩回收乙酸乙酯。将浓缩残渣以200mlpH7的磷酸缓冲液溶解，加入禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)湿菌体20g，于28℃摇床上振荡，转化36小时，得到无迷迭香酸的丹酚酸粗提液。将该粗提液过滤除菌，然后调节pH2，静置沉淀杂质，过滤后将滤液调节pH7，上反相树脂柱，水洗脱，收集纯度达到99.5％的丹酚酸B洗脱液，合并，调节至pH2后以乙酸乙酯萃取除盐，回收乙酸乙酯后以水溶解丹酚酸B，冻干。将纯度不达标的洗脱液重复上柱分离，共得到丹酚酸B 1.2g液相纯度99.2％。

实施例6

称取丹参干药材100g(丹酚酸B含量2％)，加入400ml水90℃提取两次，合并两次滤液，减压浓缩至50ml，调节pH2，加入50ml乙酸乙酯萃取两次，合并两次乙酸乙酯液，浓缩回收乙酸乙酯。将浓缩残渣以200mlpH7的磷酸缓冲液溶解，加入禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)湿菌体20g，于28℃摇床上振荡，转化36小时，得到无迷迭香酸的丹酚酸粗提液。将该粗提液过滤除菌，然后调节pH2，静置沉淀杂质，过滤后将滤液调节pH6，上反相树脂，水洗脱，收集纯度达到99.5％的丹酚酸B洗脱液，合并，调节至pH2后以乙酸乙酯萃取除盐，回收乙酸乙酯后以水溶解丹酚酸B，冻干。将纯度不达标的洗脱液重复上柱分离，共得到丹酚酸B 1.25g液相纯度100％。

实施例7

称取丹参干药材100g(丹酚酸B含量2％)，加入400ml水90℃提取两次，合并两次滤液，减压浓缩至50ml，调节pH2，加入50ml乙酸乙酯萃取两次，合并两次乙酸乙酯液，浓缩回收乙酸乙酯。将浓缩残渣以200mlpH7的磷酸缓冲液溶解，加入禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)湿菌体20g，于28℃摇床上振荡，转化36小时，得到无迷迭香酸的丹酚酸粗提液。将该粗提液过滤除菌，然后调节pH2，静置沉淀杂质，过滤后将滤液调节pH9，上反相树脂柱，水洗脱，收集纯度达到99.5％的丹酚酸B洗脱液，合并，调节至pH2后以乙酸乙酯萃取除盐，回收乙酸乙酯后以水溶解丹酚酸B，冻干。将纯度不达标的洗脱液重复上柱分离，共得到丹酚酸B 1.22g液相纯度99.1％。

实施例8

称取丹参干药材100g(丹酚酸B含量2％)，加入400ml水90℃提取两次，合并两次滤液，减压浓缩至50ml，调节pH2，加入50ml乙酸乙酯萃取两次，合并两次乙酸乙酯液，浓缩回收乙酸乙酯。将浓缩残渣以200mlpH7的磷酸缓冲液溶解，加入禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)湿菌体20g，于25℃摇床上振荡，转化50小时，得到无迷迭香酸的丹酚酸粗提液。将该粗提液过滤除菌，然后调节pH2，静置沉淀杂质，过滤后将滤液调节pH7，上反相树脂柱，水洗脱，收集纯度达到99.5％的丹酚酸B洗脱液，合并，调节至pH2后以乙酸乙酯萃取除盐，回收乙酸乙酯后以水溶解丹酚酸B，冻干。将纯度不达标的洗脱液重复上柱分离，共得到丹酚酸B 1.21g液相纯度99％。

实施例9

称取丹参干药材100g(丹酚酸B含量2％)，加入400ml水90℃提取两次，合并两次滤液，减压浓缩至50ml，调节pH2，加入50ml乙酸乙酯萃取两次，合并两次乙酸乙酯液，浓缩回收乙酸乙酯。将浓缩残渣以200mlpH7的磷酸缓冲液溶解，加入禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)湿菌体20g，于35℃摇床上振荡，转化36小时，得到无迷迭香酸的丹酚酸粗提液。将该粗提液过滤除菌，然后调节pH2，静置沉淀杂质，过滤后将滤液调节pH7，上反相树脂柱，水洗脱，收集纯度达到99.5％的丹酚酸B洗脱液，合并，调节至pH2后以乙酸乙酯萃取除盐，回收乙酸乙酯后以水溶解丹酚酸B，冻干。将纯度不达标的洗脱液重复上柱分离，共得到丹酚酸B 1.22g液相纯度100％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (14)

1.一种高纯度丹酚酸B的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(1)将丹参水提物和禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)静息细胞接触，在20-35℃生物转化24-90小时，得到去除迷迭香酸的丹参水提物；和

(2)去除迷迭香酸的丹参水提物经反相树脂吸附，通过水或甲醇水溶液洗脱得到高纯度的丹酚酸B，所述的丹酚酸B的纯度≥97w/w％。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的丹酚酸B的纯度≥99w/w％。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将以干品计20-70g的丹参水提物和10⁹-10¹⁰个/ml禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)静息细胞混合。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，将以干品计40-50g的丹参水提物和5×10⁹-10¹⁰个/ml禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)静息细胞混合。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)静息细胞是处于对数生长期后期的静息细胞。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的丹参水提物以干品为基准，其中的丹酚酸B含量为10-60w/w％。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的丹参水提物以干品为基准，其中的丹酚酸B含量为20-60w/w％。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)的放置过程中通入空气并搅拌或振荡。

9.如权利要求1或8任一所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，在22-32℃放置30-80小时。

10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的反相树脂是以聚苯乙烯为基质的树脂。

11.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，将步骤(1)得到的转化液调节pH1-3，经反相树脂吸附，通过甲醇水溶液洗脱得到高纯度的丹酚酸B；或将步骤(1)得到的转化液调节pH6-9，经反相树脂吸附，通过水洗脱得到高纯度的丹酚酸B。

12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，通过甲醇水溶液梯度洗脱得到高纯度的丹酚酸B，所述的甲醇水溶液中的甲醇含量为35-70v/v％。

13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述的甲醇水溶液中的甲醇含量为40-60v/v％。

14.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(a)将丹参水提物和禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)静息细胞混合，在20-35℃通入空气，搅拌或振荡24-90小时，得到去除迷迭香酸的丹参水提物；

(b)将去除迷迭香酸的丹参水提物离心除去菌体，调节pH1-3过滤，除去沉淀得到滤液；和

(c)滤液调节pH1-3，经反相树脂吸附，通过甲醇水溶液洗脱得到高纯度的丹酚酸B；或滤液调节pH6-9，经反相树脂吸附，通过水洗脱得到高纯度的丹酚酸B。

Images