CN103570548B - 一种丹酚酸a的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备丹酚酸A的方法。向丹参药材中加入提取剂，经过加热提取后，提取液经过滤浓缩，得丹参提取液；调节丹参提取液的pH至4-8，减压浓缩得浓缩丹参提取液，将浓缩丹参提取液在70-100℃下加热反应5-40h，得丹酚酸A粗品溶液；调节丹酚酸A粗品溶液pH至6-8，经过反相树脂吸附后，先用水洗脱，然后再用甲醇水溶液或乙醇水溶液洗脱，分步收集洗脱液，HPLC检测，合并丹酚酸A纯度超过97％的样品溶液；纯度超过97％的丹酚酸A样品溶液经过浓缩干燥，得到丹酚酸A粉末。丹酚酸A纯度可以达到97％以上，得率超过0.8％(以药材计)。本方法适用于丹酚酸A高纯度产品的大规模制备。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药活性组分的分离纯化方法，尤其涉及一种从丹参中制备丹酚酸A的方法。
背景技术
丹参是一种临床常用的中药，广泛应用于心脑血管疾病、肝病、肾病、神经系统疾病和肿瘤的预防与治疗。由于中药的传统的使用方法以水煎煮为主，所以丹参中水溶性活性组分吸引了大家的广泛关注。丹参中水溶性活性组分以丹酚酸B含量最高，同时亦含有紫草酸、迷迭香酸、丹参素等(附图1)。
丹酚酸B在高温、高压条件下，可以发生酯水解、脱羧、开环异构化等一系列反应，最终生成丹酚酸A。目前已知丹参水溶性成分中，丹酚酸A的活性最高。药理学研究表明，丹酚酸A具有极强的抗氧化活性，可以清除体内的自由基，具有心脑血管疾病的治疗和预防作用、抗肝纤维化、神经细胞的保护作用等。另外，甄永苏等人的研究发现，丹酚酸A具有抗肿瘤作用，可以增强抗癌药物的疗效。
中国专利CN100420665C中采用高温、高压处理丹参提取物，柱层析，然后有机溶剂萃取等方法，可以得到纯度80％以上的丹酚酸A。然而，该方法得到的丹酚酸A纯度较低，无法满足丹酚酸A作为药物开发尤其是注射制剂开发的需求。中国专利CN101130498A中采用蛋白质吸附丹参提取物中的丹酚酸A，用丙酮解吸附后采用有机溶剂萃取，可以得到纯度大于90％的丹酚酸A样品。但是，本工艺采用蛋白质吸附丹酚酸A，其蛋白质无法回收利用，这无疑会大大增加丹酚酸A的生产成本，并且也会带来较大的环境问题。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种简单、高效、成本低廉、环境友好的丹酚酸A制备工艺，用来满足丹酚酸A新药开发，尤其是注射制剂开发的原料药生产工艺。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种丹酚酸A提取工艺简单、产物纯度高、低成本、环境友好的丹酚酸A制备方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种制备丹酚酸A的方法，包括以下步骤：
步骤一、制备丹参提取液
向丹参药材中加入提取剂，经过加热提取后，提取液经过滤浓缩，得丹参提取液，所述提取剂为水、甲醇水溶液或乙醇水溶液；
步骤二、制备丹酚酸A粗品溶液
调节丹参提取液的pH至4-8，减压浓缩至丹参提取液原体积的10％-30％得浓缩丹参提取液，浓缩丹参提取液中加入水滑石后在70-100℃下加热反应5-40h，得丹酚酸A粗品溶液；
步骤三、丹酚酸A的分离纯化
调节丹酚酸A粗品溶液pH至6-8，经过反相树脂吸附后，先用水洗脱，然后再用甲醇水溶液或乙醇水溶液洗脱，分步收集洗脱液，HPLC检测，合并丹酚酸A纯度超过97％的样品溶液；
步骤四、浓缩干燥
纯度超过97％的丹酚酸A样品溶液经过浓缩干燥，得到丹酚酸A粉末。
优选地，步骤一中提取剂为水时，提取温度为80-100℃；或者
提取剂为体积分数10-90％的甲醇或乙醇水溶液时，提取温度为50-70℃。提取物的固液分离，选择过滤、抽滤或者离心的方法。优选提取剂为体积分数50-80％的乙醇水溶液。
步骤二中的减压浓缩工艺，不仅能够减少丹参提取液的体积，便于操作，而且当采用甲醇水溶液或乙醇水溶液作为提取剂时，还能起到将丹参提取液中的甲醇或乙醇蒸馏去除的作用，解除了丹参提取液中的醇对丹酚酸A转化的影响。
优选地，步骤二中调节pH采用盐酸、醋酸、氢氧化钠、氢氧化钾等常见非氧化性酸、碱的水溶液。
优选地，步骤三选用聚苯乙烯骨架的反相吸附树脂，首先采用水洗脱，然后采用甲醇或乙醇水溶液洗脱。
优选地，步骤三中采用柱层析的方式进行分离纯化，选用高径比为3-15:1。
优选地，步骤三中水洗脱的洗脱体积为5-20倍柱体积。
步骤三树脂柱经过水洗脱后，采用甲醇、乙醇、丙酮或乙腈水溶液的浓度为10-90％，分步收集，HPLC检测，直至洗脱流出物中没有丹酚酸A为止。
步骤四中纯度超过97％的丹酚酸A样品溶液，经过浓缩干燥，得到丹酚酸A粉末。浓缩方法可以是常压、低压真空浓缩、喷雾干燥法、冷冻干燥法中单一的方法或者是这几种方法的混合。
在研究过程中，申请人意外地发现，浓缩丹参提取液中加入水滑石(Mg6Al2(CO3)(OH)16·4(H2O))能够显著缩短加热反应的时间，优选地，水滑石加入量为1％-10％(W/V)，即每100ml浓缩丹参提取液中加入水滑石1-10g。更优选地，水滑石加入量为4％-8％(W/V)。浓缩丹参提取液中加入水滑石后，70-100℃反应温度下，反应5-15h，即可达到不加水滑石条件下20-40h的反应效果。
本方法克服了已有丹酚酸A纯化方法中产物纯度低、产量小、生产工艺复杂、生产成本高等缺点。最终提取的丹酚酸A可达0.8％以上(以药材计)，纯度超过97％。
本发明中HPLC检测条件为：安捷伦高效液相色谱仪(HP1100)，采用C18色谱柱，流动相组成为(乙腈：1％甲酸水溶液＝30:70)，流动相流速0.8mL/min，检测波长286nm，进样体积5μL。
附图说明
图1是实施例1中丹参水提取物的HPLC图谱：1，丹酚酸B；2，紫草酸；3，迷迭香酸；
图2是实施例1中步骤二丹参提取物加热转化生成丹酚酸A的HPLC图谱：A，丹参水提取物；B，加热转化12小时；C，加热转化24小时；D，加热转化36小时；1，丹酚酸B；2，紫草酸；3，迷迭香酸；4，丹酚酸A；5，原紫草酸；6，丹参素；
图3是实施例1中纯化得到丹酚酸A样品的HPLC图谱，丹酚酸A纯度97.2％。
图4是实施例1中纯化得到的丹酚酸A样品和丹酚酸A对照品共进样(摩尔比1:1)后得到的HPLC图谱，证明本发明中所制备的成品确实为丹酚酸A。
图5为实施例34中纯化得到的丹酚酸A样品和丹酚酸A对照品共进样后得到的HPLC图谱，证明本发明中所制备的成品确实为丹酚酸A。
本发明中丹酚酸A对照品购自上海同田生物技术有限公司，其他试剂及材料均可从市售渠道购买获得。
具体实施方式
如图所示，
实施例1
步骤一、取丹参药材100g,加入1.2L 70％乙醇，100℃加热提取1小时，过滤提取液。滤渣加入1.2L 70％乙醇，100℃加热提取2小时，过滤提取液。
步骤二、合并两次提取液，减压浓缩至300mL。以盐酸和氢氧化钠调节至pH5,90℃加热回流36小时，得丹酚酸A粗品溶液。
步骤三、100mL大孔吸附树脂XAD-2，填充于玻璃色谱柱中，高径比5:1。丹酚酸A粗品溶液，调节至pH8，流经色谱柱，流速200mL/小时。1L去离子水洗脱树脂柱，流速200mL/小时。然后采用30％乙醇洗脱树脂柱，分步收集，50mL/瓶，HPLC检测，至无丹酚酸A流出为止。合并纯度大于97％的丹酚酸A样品瓶。
步骤四、减压浓缩回收乙醇，真空冷冻干燥，得97.2％纯度的丹酚酸A 0.93g。
实施例2
将实施例1中提取丹参药材的溶剂换为水，其余同实施例1，最终得到97.1％的丹酚酸A 0.82g。
实施例3
将实施例1中提取丹参药材的溶剂换为10％的乙醇，其余同实施例1，最终得到97％的丹酚酸A 0.88g。
实施例4
将实施例1中提取丹参药材的溶剂换为90％的乙醇，其余同实施例1，最终得到96.8％的丹酚酸A 0.92g。
实施例5
将实施例1中提取丹参药材的溶剂换为10％的甲醇，其余同实施例1，最终得到96.6％的丹酚酸A 0.8g。
实施例6
将实施例1中提取丹参药材的溶剂换为90％的甲醇，其余同实施例1，最终得到97.1％的丹酚酸A 0.78g。
实施例7
将实施例1中提取丹参药材的溶剂换为4倍重量的70％乙醇，其余同实施例1，最终得到97％的丹酚酸A 0.55g。
实施例8
将实施例1中提取丹参药材的溶剂换为20倍重量的70％乙醇，其余同实施例1，最终得到97.2％的丹酚酸A 0.92g。
实施例9
将实施例1中提取丹参药材的温度换为50℃，其余同实施例1，最终得到97.2％的丹酚酸A 0.72g。
实施例10
将实施例1中提取丹参药材的温度换为70℃，其余同实施例1，最终得到96.3％的丹酚酸A 0.76g。
实施例11
将实施例1中步骤二加热丹参提取物前调节至pH4，其余同实施例1，最终得到97.3％的丹酚酸A 0.58g。
实施例12
将实施例1中步骤二加热丹参提取物前调节至pH8，其余同实施例1，最终得到96.7％的丹酚酸A 0.71g。
实施例13
将实施例1中步骤二加热丹参提取物温度设置为70℃，其余同实施例1，最终得到97.5％的丹酚酸A 0.65g。
实施例14
将实施例1中步骤二加热丹参提取物温度设置为100℃，其余同实施例1，最终得到97.1％的丹酚酸A 0.85g。
实施例15
将实施例1中步骤二加热丹参提取物时间设置为5小时，其余同实施例1，最终得到97.1％的丹酚酸A 0.45g。
实施例16
将实施例1中步骤二加热丹参提取物时间设置为40小时，其余同实施例1，最终得到97.2％的丹酚酸A 0.75g。
实施例17
将实施例1步骤三中的反相吸附树脂更换为上海华震科技有限公司生产的Hz816大孔吸附树脂，其余同实施例1，最终得到96.8％的丹酚酸A 0.88g。
实施例18
将实施例步1骤三中的反相吸附树脂更换为上海华震科技有限公司生产的微球一号大孔吸附树脂，其余同实施例1，最终得到97.8％的丹酚酸A 0.98g。
实施例19
将实施例1步骤三中的反相吸附树脂更换为上海华震科技有限公司生产的Hz803大孔吸附树脂，其余同实施例1，最终得到96.3％的丹酚酸A 0.75g。
实施例20
将实施例1步骤三中反相树脂的高径比调节至3，其余同实施例1，最终得到96.2％的丹酚酸A 0.73g。
实施例21
将实施例1步骤三中反相树脂的高径比调节至15，其余同实施例1，最终得到97.2％的丹酚酸A 0.92g。
实施例22
将实施例1步骤三中上柱吸附前pH调节至pH6，其余同实施例1，最终得到97.2％的丹酚酸A 0.55g。
实施例23
将实施例1步骤三中上柱吸附前pH调节至pH10，其余同实施例1，最终得到95.1％的丹酚酸A 0.51g。
实施例24
将实施例1步骤三中洗脱液水的量调节至5倍柱体积，其余同实施例1，最终得到96.8％的丹酚酸A 0.77g。
实施例25
将实施例1步骤三中洗脱液水的量调节至20倍柱体积，其余同实施例1，最终得到97％的丹酚酸A 0.95g。
实施例26
将实施例1步骤三中洗脱液乙醇的浓度设置为10％，其余同实施例1，最终得到96.5％的丹酚酸A 0.75g。
实施例27
将实施例1步骤三中洗脱液乙醇的浓度设置为60％，其余同实施例1，最终得到96.3％的丹酚酸A 0.85g。
实施例28
将实施例1步骤三中洗脱液更换为甲醇的浓度设置为20％，其余同实施例1，最终得到96.2％的丹酚酸A 0.55g。
实施例29
将实施例1步骤三中洗脱液更换为甲醇的浓度设置为90％，其余同实施例1，最终得到96.2％的丹酚酸A 0.75g。
实施例30
将实施例1步骤三中洗脱液更换为丙酮的浓度设置为10％，其余同实施例1，最终得到95.2％的丹酚酸A 0.85g。
实施例31
将实施例1步骤三中洗脱液更换为丙酮的浓度设置为70％，其余同实施例1，最终得到97.2％的丹酚酸A 0.55g。
实施例32
将实施例1步骤三中洗脱液更换为乙腈的浓度设置为30％，其余同实施例1，最终得到96.2％的丹酚酸A 0.55g。
实施例33
将实施例1步骤三中洗脱液更换为乙腈的浓度设置为80％，其余同实施例1，最终得到96.8％的丹酚酸A 0.75g。
实施例34
在实施例1步骤二中减压浓缩后的丹参提取液中加入6％(W/V)的水滑石，90℃加热回流6小时，其余同实施例1，最终得到97.5％的丹酚酸A 0.87g。
实施例35
在实施例1步骤二中减压浓缩后的丹参提取液中加入10％(W/V)的水滑石，70℃加热回流15小时，其余同实施例1，最终得到96.8％的丹酚酸A 0.91g。
实施例36
在实施例1步骤二中减压浓缩后的丹参提取液中加入2％(W/V)的水滑石，80℃加热回流12小时，其余同实施例1，最终得到97.3％的丹酚酸A 0.92g。
从表1中可以看出，在反应体系中加入水滑石以后，在保证丹酚酸A纯度和得率的前提下，可以大幅缩短反应时间，甚至可以适当降低反应温度。丹酚酸A得率计算方式为每100g丹参药材中，获得的丹酚酸A样品量。
表1
图4和图5分别为实施例1和实施例34中制备的丹酚酸A样品和标准品共同进样HPLC图谱，证明了通过本发明的方法制备的样品为丹酚酸A。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种丹酚酸A的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤一、制备丹参提取液
向丹参药材中加入提取剂，经过加热提取后，提取液经过滤浓缩，得丹参提取液，所述提取剂为水、甲醇水溶液或乙醇水溶液；
步骤二、制备丹酚酸A粗品溶液
调节丹参提取液的pH至4-8，减压浓缩至丹参提取液原体积的10％-30％得浓缩丹参提取液，浓缩丹参提取液中加入水滑石后在70-100℃下加热反应5-40h，得丹酚酸A粗品溶液；
步骤三、丹酚酸A的分离纯化
调节丹酚酸A粗品溶液pH至6-8，经过反相树脂吸附后，先用水洗脱，然后再用甲醇水溶液或乙醇水溶液洗脱，分步收集洗脱液，HPLC检测，合并丹酚酸A纯度超过97％的样品溶液；
步骤四、浓缩干燥
纯度超过97％的丹酚酸A样品溶液经过浓缩干燥，得到丹酚酸A粉末。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤一中加入的提取剂为体积分数50-80％的乙醇水溶液。
3.如权利要求1所述的方法，其中步骤一中加热的提取温度为50-100℃。
4.如权利要求1所述的方法，其中步骤二中pH范围为pH 5-7，加热反应温度为90℃，反应时间为10-40h。
5.如权利要求1所述的方法，其中步骤三中反相吸附树脂为采用以聚苯乙烯为基本骨架的反相吸附树脂。
6.如权利要求1所述的方法，其中步骤三中柱层析时，色谱柱的高径比为3-15：1。
7.如权利要求1所述的方法，其中步骤三水洗脱中水的用量为5-20倍柱体积，甲醇水溶液或乙醇水溶液洗脱中，甲醇水溶液或乙醇水溶液浓度为30-80％。
8.如权利要求1所述的方法，其中水滑石加入量为1％-10％W/V，反应条件为70-100℃反应温度下，反应5-15h。
9.如权利要求8所述的方法，其中水滑石加入量为4％-8％W/V。
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