CN105497123B - 丹参提取物、其制剂及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种低杂质含量的丹参提取物其制剂和用途，并公开了制备这种低杂质含量的丹参提取物的方法和检测丹参提取物中的HPLC方法。本发明的低杂质含量的丹参提取物基本去除了对照品中的两个含量较高的杂质，更好的保证了用药安全，实验证明，丹参提取物对急性脑缺血和/或脑部缺血性坏死具有良好的治疗效果。

Description

丹参提取物、其制剂及用途

技术领域

本发明属于中药天然药物领域，具体地说，本发明涉及丹参提取物、其制剂及用途。

背景技术

中药丹参来源于唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎。具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效，主要用于心脑血管疾病的治疗。研究表明，其中的活性成分具有抗血栓、抗血小板凝集、抗氧化、抗肿瘤等药理活性。

丹参的活性成分可以分为水溶性和脂溶性两部分，其中水溶性部分以酚酸类化合物为主；脂溶性活性成分以二萜菲醌类化合物为主。丹参水溶性成分的分离纯化工艺虽起步较晚，但发展迅速。主要方法有水提醇沉法、高速逆流色谱法、CO₂超临界萃取法等。这些方法工艺复杂，设备要求高，难以满足丹酚酸B药物开发的需求。

中国专利ZL200810041104.1，采用了生物转化步骤，虽然可以将丹酚酸B纯度提高至99％以上，但工艺过程繁琐，同时纯化中用到的反相树脂价格昂贵，不利于工业化生产。本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中得到含有高纯度丹酚酸B的丹参提取物，步骤繁琐的缺陷，开发一种工艺简单、稳定，有利于实现工业化生产，制备成本低的含有高纯度丹酚酸B的丹参提取物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种丹参提取物其制剂及用途。

本发明的第一方面，提供了一种丹参提取物，所述丹参提取物中含有丹酚酸B和杂质，所述杂质的HPLC含量＞0，并且所述杂质包括HPLC相对保留时间约为1.51的杂质I，所述杂质I的HPLC含量≤0.5％；优选地，所述杂质I的HPLC含量≤0.10％；更优选地，所述杂质I的HPLC含量≤0.05％；最优选地，所述杂质I的HPLC含量≤0.01％。

在另一优选例中，所述杂质的HPLC含量≤1.0％。

在另一优选例中，所述杂质I的HPLC含量大于或等于0。

在另一优选例中，所述丹酚酸B的HPLC含量≥98.0％；优选地，≥99.0％；更优选地≥99.5％。

在另一优选例中，所述杂质还包括HPLC相对保留时间约为1.48的杂质II，所述杂质II的HPLC含量≤0.25％；优选地，所述杂质II的HPLC含量≤0.1％；更优选地，所述杂质II的HPLC含量≤0.05％；更优选地，所述杂质II的HPLC含量≤0.01％。

在另一优选例中，所述杂质还包括HPLC相对保留时间约为0.55的杂质III，所述杂质III的HPLC含量＞0并且≤0.15％，优选地，所述杂质III的HPLC含量≤0.1％，更优选地，所述杂质III的HPLC含量≤0.05％；更优选地，所述杂质III的HPLC含量≤0.01％。

在另一优选例中，所述杂质还包括HPLC相对保留时间约为0.70的杂质IV，所述杂质IV的HPLC含量＞0并且≤0.2％，优选地，所述杂质IV的HPLC含量≤0.1％；更优选地，所述杂质IV的HPLC含量≤0.05％；更优选地，所述杂质IV的HPLC含量≤0.01％。

在另一优选例中，所述杂质还包括HPLC相对保留时间约为0.26的杂质V，所述杂质V的HPLC含量＞0并且≤0.3％，优选地，所述杂质V的HPLC含量≤0.2％；更优选地，所述杂质V的HPLC含量≤0.1％；更优选地，所述杂质V的HPLC含量≤0.05％。

在另一优选例中，所述杂质还包括HPLC相对保留时间约为1.1的杂质VI，所述杂质VI的HPLC含量＞0并且≤0.2％，优选地，所述杂质VI的HPLC含量≤0.1％；更优选地，所述杂质V的HPLC含量≤0.05％；更优选地，所述杂质V的HPLC含量≤0.01％。

在另一优选例中，所述HPLC的检测条件为：

C18柱(4.6*250mm，5μm)；流动相A，0.5％(v/v)甲酸溶液；流动相B，0.5％(v/v)甲酸溶液-乙腈(50:50)；柱温35℃；流速1ml/min；进样量：10μl；检测波长286nm；梯度洗脱，流动相梯度比例如下：

0-30min，流动相A:流动相B＝59:41；

30-45min，流动相A:59→10％，流动相B：41→90；

45-50min，流动相A:10→59％，流动相B：90→41；

50-55min，流动相A:流动相B＝59:41。

本发明的第二方面，提供了如本发明第一方面所述的丹参提取物的用途，其特征在于，所述丹参提取物用于制备药物，所述药物用于治疗或预防心脑血管疾病。

在另一优选例中，所述心脑血管疾病包括：

(1)急性脑缺血；和/或

(2)脑部缺血性坏死。

在另一优选例中，本发明第二方面所述的丹参提取物的用途，其中所述丹参提取物通过如下方法制备：

(1)制备丹参提取物中间体

丹参药材的提取液上第一树脂层析柱，洗脱液经乙酸乙酯萃取后，去除乙酸乙酯得丹参提取物中间体作为下一步中的上柱样品，所述丹参提取物中间体中丹酚酸BHPLC含量为10％以上，优选地为10％-70％；

(2)纯化制得丹参提取物

(2.1)将上柱样品加水溶解，上第二树脂层析柱，水洗脱，收集洗脱液，洗脱液经乙酸乙酯萃取后去除乙酸乙酯；

(2.2)重复步骤(2.1)至少一次，得到所述丹参提取物，所述丹参提取物中丹酚酸BHPLC含量为95％以上，优选地为98％-100％。

在另一优选例中，所述第一树脂层析柱为大孔吸附树脂层析柱。

在另一优选例中，所述第二树脂层析柱为微球树脂层析柱、反相树脂层析柱或大孔吸附树脂层析柱。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述所述丹参药材的提取液的制备方法包括：

将丹参干药材粉碎，加入3-10倍水浸泡0.5-4h，于20-90℃提取0.5-2h，过滤药渣取水提液，药渣重复提取1-4次，合并水提液，得所述丹参药材的提取液。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，上柱流速为0.5-6BV/h，然后用0.5-2BV水洗脱，再用4-12BV的5％-60％的乙醇洗脱，洗脱流速0.5-6BV/h，合并醇洗脱部分减压浓缩至无醇味。

在另一优选例中，所述步骤(2.1)中，取上柱样品加水溶解，以丹酚酸B计浓度为50-300g/L，调节pH1-7，上微球树脂层析柱，用2-10BV纯水洗脱，流速0.5-6BV/h，再用1-4BV的5％-60％乙醇洗脱，流速0.5-6BV/h，HPLC检测各洗脱部分丹酚酸B纯度。

在另一优选例中，所述步骤(2.2)中，将上一步中制得的丹酚酸B的HPLC纯度在60％以上的样品，作为上柱样品，重复步骤(2.1)，得到所述丹参提取物，所述丹参提取物中丹酚酸BHPLC含量为98％以上，优选地为99％以上。

在另一优选例中，制备所述丹参提取物的方法还包括步骤：

(3)将所得丹酚酸B提取物溶于水中，冷冻干燥得粉末状丹酚酸B提取物。

本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的丹参提取物和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：胶囊剂、片剂、颗粒剂、混悬剂、微囊制剂、注射剂、栓剂、粉剂、喷雾剂、贴片或软膏剂。

本发明的第四方面，提供了一种制备丹参提取物的方法，包括如下步骤：

(1)制备丹参提取物中间体

丹参药材的提取液上第一树脂层析柱，洗脱液经乙酸乙酯萃取后，去除乙酸乙酯，得丹参提取物中间体作为下一步中的上柱样品，所述丹参提取物中间体中丹酚酸B HPLC含量为10％以上，优选地为10％-70％；

(2)纯化制得丹参提取物

(2.1)将上柱样品加水溶解，上第二树脂层析柱，水洗脱，收集洗脱液，洗脱液经乙酸乙酯萃取后去除乙酸乙酯；

(2.2)重复步骤(2.1)至少一次，得到所述丹参提取物。所述丹参提取物中丹酚酸B的HPLC含量为95％以上，优选地为98％以上。

在另一优选例中，所述第一树脂层析柱为大孔吸附树脂层析柱。

在另一优选例中，所述第二树脂层析柱为微球树脂层析柱、反相树脂层析柱或大孔吸附树脂层析柱。

在另一优选例中，所述第一树脂层析柱中的大孔吸附树脂选自下组：HPD300、HPD400、HPD700、HPD-722、HZ-803、HZ-806、HZ-816、H103、AB-8。

在另一优选例中，所述微球树脂层析柱中的微球树脂平均粒径为1-500μm。

在另一优选例中，所述第二树脂层析柱中的吸附树脂选自下组：HP-21、HP20SS、XAD-4、XAD-16、XAD-1180N、XAD-1600、微球一号、微球二号、HZ-803、HZ-816。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述丹参药材的提取液的制备方法包括：

将丹参干药材粉碎，加入3-10倍水浸泡0.5-4h，于20-90℃提取0.5-2h，过滤药渣取水提液，药渣重复提取1-4次，合并水提液，得所述丹参药材的提取液。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，上柱流速为0.5-6BV/h，然后用0.5-2BV水洗脱，再用4-12BV的5％-60％(v/v)的乙醇洗脱，洗脱流速0.5-6BV/h，合并醇洗脱部分减压浓缩至无醇味；优选地，在所述步骤(1)中，合并醇洗脱部分后先调节合并液中乙醇浓度至70％－80％(v/v)，去除沉淀，然后再减压浓缩至无醇味。

在另一优选例中，所述步骤(2.1)中，取上柱样品加水溶解，以丹酚酸B计浓度为50-300g/L，调节pH1-7(优选地为2-7，更优选地为3-6.5)，上微球树脂层析柱，用2-10BV纯水洗脱，流速0.5-6BV/h，再用1-4BV的5％-60％乙醇洗脱，流速0.5-6BV/h，HPLC检测各洗脱部分丹酚酸B纯度。

在另一优选例中，所述步骤(2.2)中，将上一步中制得的丹酚酸B的HPLC纯度在60％以上的样品，作为上柱样品，重复步骤(2.1)，得到所述丹参提取物，所述丹参提取物中丹酚酸B的HPLC含量为98％以上，优选地为99％以上；优选地，重复步骤(2.1)至少2次，更优选地重复步骤(2.1)至少3次。

在另一优选例中，制备所述丹参提取物的方法还包括步骤：

(3)将所得丹酚酸B提取物溶于水中，冷冻干燥得粉末状丹酚酸B提取物。

在另一优选例中，所述丹参提取物为权利要求1所述的丹参提取物。

本发明的第五方面，提供了一种丹参提取物的HPLC分析方法，所述HPLC的检测条件为：

C18柱(4.6*250mm，5μm)；流动相A，0.5％(v/v)甲酸溶液；流动相B，0.5％(v/v)甲酸溶液-乙腈(50:50)；柱温35℃；流速1ml/min；进样量：10μl；检测波长286nm；梯度洗脱，流动相梯度比例如下：

0-30min，流动相A:流动相B＝59:41；

30-45min，流动相A:59→10％，流动相B：41→90；

45-50min，流动相A:10→59％，流动相B：90→41；

50-55min，流动相A:流动相B＝59:41。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了采用本发明的HPLC检测方法，检测丹酚酸B对照品的检测图谱。

图2显示了实施例1中制备的丹参提取物的HPLC检测图谱。

图3为图2的部分放大图。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种丹参提取物，该丹参提取物的杂质含量显著低于对照品，实验结果表明，所述丹参提取物对于急性脑缺血和/或脑部缺血性坏死具有显著的疗效。本发明还提供了该丹参提取物的制备方法以及一种HPLC分析丹参提取物的方法。

活性成份

丹参水溶性提取物中的主要活性成分为酚酸类物质，酚酸类化合物是指同一苯环上有若干酚性羟基的一类化合物，是很好的抗氧化剂。目前，结构明确的丹酚酸主要包括丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、咖啡酸、丹酚酸A、B、C、D、E、F。

本发明提供的丹参提取物，中含有丹酚酸B和杂质，所述杂质的HPLC含量＞0，并且所述杂质包括HPLC相对保留时间约为1.51的杂质I，所述杂质I的HPLC含量≤0.5％；优选地，所述杂质I的HPLC含量≤0.10％；更优选地，所述杂质I的HPLC含量≤0.05％；最优选地，所述杂质I的HPLC含量≤0.01％。

本发明的丹参提取物可以用于制备药物，所述药物用于治疗或预防心脑血管疾病，在本发明优选地实施方式中，所述心脑血管疾病包括冠心病、心绞痛、心肌梗塞、动脉粥样硬化、脑梗塞、脑梗塞后遗症(如，脑水肿)。

在本发明的优选实施方式中，所述心脑血管疾病为：

(1)急性脑缺血；和/或

(2)脑部缺血性坏死。

本文所用的术语“相对保留时间(RRT)”是指在一定HPLC条件下某峰相对于主峰的保留时间之比，例如，在一定HPLC条件下，主峰的保留时间是1分钟，而另一峰的保留时间是2分钟，则后者的相对保留时间(RRT)是2。相应地，本文所述RRT 1.51的杂质是指在本文所述HPLC条件下，相对保留时间为1.51的杂质。在本发明的HPLC检测条件下，在一个较佳的实施方式中，丹酚酸B的保留时间为27.677min、杂质I的保留时间为41.865min、杂质II的保留时间为40.981min，据此计算杂质I的RRT为1.51、杂质II的RRT为1.48。在本发明的另一个较佳的实施方式中，丹酚酸B的保留时间为26.763min，杂质III、IV、V的保留时间分别为14.680min、18.841min、6.914min。本领域技术人员应当理解，在不同批次的检测下，保留时间可以在一定的范围内浮动(比如±1min)，在浮动范围内应当视为与本发明中所述的保留时间一致,由此造成的相对保留时间的变化，也应当视为与本发明中的相对保留时间一致。

本发明中所述的丹参提取物包括其药学上可以接受的盐的形式。

制备方法

本发明提供了上述丹参提取物的制备方法，利用大孔吸附树脂对丹参药材的水提取液进行富集，获得含量大于50％的丹酚酸B中间体，调节中间体溶液pH成酸性或中性，由微球树脂吸附后，用水进行洗脱，制得所述丹参提取物，该丹参提取物中丹酚酸B含量很高。

本发明提供丹参提取物的制备方法，包括步骤：

(1)将丹参干药材粉碎，加入3-10倍水浸泡0.5-4h，于20-90℃提取0.5-2h，过滤药渣取水提液，任选地，可以重复提取1-4次；

(2)合并水提液上第一树脂层析柱，上柱流速0.5-6BV/h，然后用0.5-2BV水洗脱，再用4-12BV的5％-60％的乙醇洗脱，洗脱流速0.5-6BV/h，合并醇洗脱部分减压浓缩至无醇味；

(3)调节(2)中已除醇的洗脱液pH1-5，用0.5-3倍体积的乙酸乙酯萃取1-4次，合并酯相去除乙酸乙酯，得到丹酚酸B中间体，其中丹酚酸B含量为10％-70％；

(4)取丹酚酸B中间体加水溶解，以丹酚酸B计浓度为50-300g/L，调节pH1-7，上第二树脂层析柱，用2-10BV纯水洗脱，流速0.5-6BV/h，再用1-4BV的5％-60％乙醇洗脱，流速0.5-6BV/h，HPLC检测各洗脱部分丹酚酸B纯度；

(5)合并(4)中丹酚酸B的HPLC纯度>60％的洗脱液，浓缩后重复1-3次(4)中的操作，将纯度99％以上的洗脱液合并；

(6)将(4)或(5)中丹酚酸B的HPLC纯度99％以上的丹酚酸B洗脱液浓缩后调节pH1-4以0.5-3倍体积的乙酸乙酯萃取1-4次除盐，合并酯相回收乙酸乙酯，以水溶解旋干的丹酚酸B，冻干，得到高纯度丹酚酸B样品。

其中步骤(1)中丹参干药材粉碎程度视工程上能达到的条件决定，优选过1-4号药筛，最优选过3号药筛。

其中步骤(2)中大孔吸附树脂为弱极性或非极性大孔吸附树脂，其参数如下：

粒径0.2-1.25mm；水份：50-75％；湿视密度：0.65-0.85g/ml；湿真密度：1.0-1.1g/ml；表观密度：0.1-0.4g/ml；平均孔径：

优选地大孔吸附树脂选自：HPD300、HPD400、HPD700、HPD-722、HZ-803、HZ-806、HZ-816、H103、AB-8。

其中步骤(4)中第二树脂层析柱中可以使用微球树脂、反相树脂或大孔吸附树脂，其中微球树脂一般为高分子材料(如聚苯乙烯/二乙烯基苯、聚丙烯酸及它们的衍生物等)聚合而成的微球(microsphere，也称之为聚合物微球、纳米聚合物微球)，其平均粒径在1-500μm，较佳地在50-300μm，更佳地在100-200μm。可以应用于本发明中的微球树脂种类很多包括但不限于Amberchrom^TM CG系列的产品(陶氏－罗门哈斯)、

HP20SS(三菱化学)树脂及其衍生树脂，和其它与该些产品性能(如材质、粒径)相似的微球树脂产品。

通常情况下微球树脂的孔径在

孔容：0.5-3.0ml/g；比表面积：400-2000m²/g。与普通大孔吸附树脂相比，微球树脂的粒径更小且更均一；在本发明中第二树脂层析柱中的树脂也可以选自下组：HP-21、XAD-4、XAD-16、XAD-1180N、XAD-1600、微球一号、微球二号、HZ-803、HZ-816。本发明人实验发现，使用上述树脂不仅能够替代Amberchrom^TMCG微球树脂，同样能够达到本发明的效果，但是生产成本显著降低。

其中步骤(5)中收集丹酚酸B的HPLC纯度>70％的洗脱液浓缩后重复1-3次步骤(4)的操作，即重复1-4次上第二树脂层析柱分离纯化，具体次数视收集的洗脱液的纯度以及转移率(丹酚酸B收率)而定，直到获得相当量的高纯度的丹酚酸B洗脱液为止。纯度未达标的洗脱液可合并回收，累积到一定量时可套用重复上第二树脂层析柱分离。

本发明中所述树脂均可从市售渠道获得，其中HPD系列树脂可以获自沧州宝恩吸附材料科技有限公司，HZ系列树脂、微球一号树脂、微球二号树脂可以获自上海华震科技有限公司，XAD系列树脂、微球树脂可以获自罗门哈斯公司。

本发明人通过柱色谱法将丹酚酸B的纯度提高到99％以上，与中国专利“一种高纯度丹酚酸B的制备方法”(ZL200810041104.1)相比，省去了生物转化步骤，本发明制备的丹参提取物中不含微生物成分，避免了微生物核酸、蛋白物质的污染，同时优化了树脂填料，用更便宜的填料即可以达到优于纯化效果，大大节省了材料费，为以后工业化生产提供了更大的可行性。

材料和检测方法

本发明实施例中所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

丹参药材：购自河南。

丹酚酸B对照品：购自中国食品药品检定研究院，HPLC纯度≥95％。

本发明人经过深入的研究，开发出了一种更为科学准确的检测丹参提取物的HPLC检测方法，与现有的检测方法相比，该检测方法能够检测出更多的杂质。

本发明的HPLC纯度检测条件为：

C18柱(4.6*250mm，5μm)；流动相A，0.5％甲酸溶液；流动相B，0.5％甲酸溶液-乙腈(50:50)；柱温35℃；流速1ml/min；进样量：10μl；检测波长286nm；梯度洗脱，流动相梯度比例如下：

0-30min，流动相A:流动相B＝59:41

30-45min，流动相A:59→10％，流动相B：41→90

45-50min，流动相A:10→59％，流动相B：90→41

50-55min，流动相A:流动相B＝59:41。

在上述检测条件下，丹酚酸B的保留时间约为27min，该检测条件可用于制备过程中各部分洗脱液中丹酚酸B纯度的检测(归一化法)。采用上述HPLC方法检测丹酚酸B对照品的检测谱图如图1所示，丹酚酸B的HPLC含量为95％，从图中可以看出，在保留时间41.865min(杂质I)和40.981(杂质II)处有两个明显的杂质峰，杂质I、II的HPLC含量分别为0.68％、0.25％。而采用2010版中国药典第二增补本中丹酚酸B的HPLC检测方法，无法检测出这两个杂质峰。

药材及丹参提取物成品中丹酚酸B的质量百分含量按照《中华人民共和国药典》2010年版第二增补本中关于丹参药材中丹酚酸B含量测定的方法测得(外标法)。与现有的对照品(设定对照品中丹酚酸B的质量百分含量为100％)相比，经本发明方法制备的丹参提取物中丹酚酸B的质量百分含量为105％左右，说明本发明的丹参提取物的纯度要显著优于对照品。

药物组合物和施用方法

本发明的丹参提取物对急性脑缺血和/或脑部缺血性坏死具有良好的治疗效果。

一方面，本发明提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明丹参提取物或其药学上可接受的盐；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明丹参提取物的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至100毫克/千克，较佳地15毫克/千克至45毫克/千克体重的本发明丹参提取物。此外，本发明的丹参提取物可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、皮下、皮内或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地为注射剂。

这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。

当本发明的药物组合物被用于预防或治疗时，作为活性成分的本发明的丹参提取物或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待预防或治疗的每个对象(病人)的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的丹参提取物中去除了现有技术中尚未发现的杂质，质量标准更高，作为药物使用能够降低潜在的安全风险。

(2)本发明的丹参提取物对急性脑缺血和/或脑部缺血性坏死具有良好的治疗效果，有效率达到50％以上。

(3)本发明的制备丹参提取物的方法，工艺操作简单，易于放大生产，成本较低且产品质量稳定，适用于千克级及以上的丹酚酸B样品的制备，完全能够满足丹酚酸B药物开发、生产的需求；

(4)本发明开发出了新的HPLC检测丹参提取物的方法，该方法能够分析出现有检测方法中检测不到的杂质。

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

称取丹参干药材1500g(丹酚酸B含量5％)粉碎后过3号筛，加入6L水浸泡2小时后40℃提取0.5h，过滤，药渣同前法再提取2次，合并水提液上大孔吸附树脂(HPD300)，纯水洗脱2BV，再用50％乙醇洗脱6BV。合并醇洗脱部分浓缩，加入95％乙醇或无水乙醇至终浓度75％，离心取上清液并减压浓缩至无醇味，调节pH2，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相并减压浓缩回收乙酸乙酯，旋干即得丹酚酸B中间体。丹酚酸B中间体加水溶解，调节pH2，上第二树脂层析柱(HZ-816)，树脂体积2L，用8BV水洗脱，后以10％的乙醇洗脱4BV；合并纯度>60％的丹酚酸B洗脱液浓缩，调节pH2，再上之前的第二树脂层析柱，洗脱方式同前，合并纯度>90％的丹酚酸B洗脱液浓缩，调节pH2，上第二树脂层析柱，洗脱方式同前，合并纯度>99％的丹酚酸B洗脱液，浓缩后调节至pH2以乙酸乙酯萃取除盐，回收乙酸乙酯后以水溶解丹酚酸B，冻干，得到高纯度丹酚酸B样品约10.2g，采用本发明的检测方法，HPLC检测丹酚酸B纯度99.69％，检测图谱如图2所示，图3为图2的放大图，从图中可以看出，本实施例中制备的丹参提取物中，基本不含有杂质I、II(未检出)，杂质III、IV、V、VI的含量分别为0.04％、0.11％、0.10％、0.04％。与对照品(100％)相比，丹酚酸B的质量百分含量为105％。

实施例2

称取丹参干药材500g(丹酚酸B含量5.8％)粉碎，加入2L水浸泡3小时后50℃提取1h，过滤，药渣同前法再提取4次，合并水提液上大孔吸附树脂(HPD400)，用纯水洗脱1.5BV后用60％乙醇洗脱4BV。合并醇洗脱部分浓缩，加入95％乙醇或无水乙醇至终浓度80％，离心取上清液并减压浓缩至无醇味，调节pH3，用等体积的乙酸乙酯萃取4次，合并酯相并减压浓缩回收乙酸乙酯，旋干即得丹酚酸B中间体。丹酚酸B中间体加水溶解，调节pH6，上第二树脂层析柱(HZ-803)，树脂体积500ml，用7BV水洗脱，后以10％的乙醇洗脱2BV，合并纯度>80％的丹酚酸B洗脱液浓缩，调节pH6，再上第二树脂层析柱，用7BV水洗脱，后以10％的乙醇洗脱2BV，合并纯度>99％的丹酚酸B洗脱液，浓缩后调节至pH2后以乙酸乙酯萃取除盐，回收乙酸乙酯后以水溶解丹酚酸B，冻干，得到高纯度丹酚酸B样品约5.2g，采用本发明的检测方法，HPLC检测丹酚酸B纯度99.62％，其中杂质I、II、III、IV、V、VI的含量分别为0.01％、0.01％、0.1％、0.08％、0.06％、0.03％。

实施例3

称取丹参干药材8000g(丹酚酸B含量5.4％)粉碎，加入80L水浸泡3小时后90℃提取2h，过滤，药渣同前法再提取1次，合并水提液上大孔吸附树脂(HPD700)，用纯水洗脱2BV后用40％乙醇洗脱7BV。合并醇洗脱部分浓缩，加入95％乙醇或无水乙醇至终浓度80％，离心取上清液并减压浓缩至无醇味，调节pH4，加入等体积的乙酸乙酯萃取2次，合并酯相并减压浓缩回收乙酸乙酯，旋干即得丹酚酸B中间体。丹酚酸B中间体加水溶解，调节pH5，上第二树脂层析柱(微球二号)，树脂体积10L，用8BV水洗脱，后以30％的乙醇洗脱4BV；合并纯度>85％的丹酚酸B洗脱液浓缩；调节pH6，再上第二树脂层析柱，洗脱方式同前；合并纯度>95％的丹酚酸B洗脱液浓缩，调节pH6.5，再上第二树脂层析柱，洗脱方式同前；合并纯度>98％的丹酚酸B洗脱液浓缩，调节pH7.0，再上第二树脂层析柱，用8BV水洗脱，合并纯度>99％的丹酚酸B洗脱液，浓缩后调节至pH3后以乙酸乙酯萃取除盐，回收乙酸乙酯后以水溶解丹酚酸B，冻干，得到高纯度丹酚酸B样品约172.8g，采用本发明的检测方法，HPLC检测丹酚酸B纯度99.53％，其中杂质I、II、III、IV、V、VI的含量分别为0.01％、0.02％、0.13％、0.05％、0.18％、0.06％。

实施例4

称取丹参干药材300g(丹酚酸B含量5.5％)粉碎，加入2L水浸泡3小时后70℃提取1h，过滤，药渣同前法再提取2次，合并水提液上大孔吸附树脂(HPD-722)，用纯水洗脱1BV后用30％乙醇洗脱9BV。合并醇洗脱部分浓缩，加入95％乙醇或无水乙醇至终浓度80％，离心取上清液并减压浓缩至无醇味，调节pH3，加入等体积的乙酸乙酯萃取4次，合并酯相并减压浓缩回收乙酸乙酯，旋干即得丹酚酸B中间体。丹酚酸B中间体加水溶解，调节pH5.5，上第二树脂层析柱(微球一号)，用8BV水洗脱，后以50％的乙醇洗脱2BV，合并纯度>90％的丹酚酸B洗脱液浓缩，调节pH4，上第二树脂层析柱，用6BV水洗脱，后以60％的乙醇洗脱4BV，合并纯度>99％的丹酚酸B洗脱液，浓缩后调节至pH3后以乙酸乙酯萃取除盐，回收乙酸乙酯后以水溶解丹酚酸B，冻干，得到高纯度丹酚酸B样品约2.9g，采用本发明的检测方法，HPLC检测丹酚酸B纯度99.68％，其中杂质I、II、III、IV、V、VI的含量分别为0.01％、0.03％、0.11％、0.04％、0.08％、0.03％。

实施例5

称取丹参干药材1500g(丹酚酸B含量5％)粉碎后过3号筛，加入6L水浸泡2小时后40℃提取0.5h，过滤，药渣同前法再提取2次，合并水提液上大孔吸附树脂(HPD300)，纯水洗脱2BV，再用50％乙醇洗脱6BV。合并醇洗脱部分浓缩，加入95％乙醇或无水乙醇至终浓度75％，离心取上清液并减压浓缩至无醇味，调节pH2，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相并减压浓缩回收乙酸乙酯，旋干即得丹酚酸B中间体。丹酚酸B中间体加水溶解，调节pH6.5，上第二树脂层析柱(CG161c微球树脂)，树脂体积2L，用8BV水洗脱，后以10％的乙醇洗脱4BV；合并纯度>60％的丹酚酸B洗脱液浓缩，调节pH4.5，再上之前的第二树脂层析柱，洗脱方式同前，合并纯度>90％的丹酚酸B洗脱液浓缩，调节pH5.5，上第二树脂层析柱，洗脱方式同前，合并纯度>99％的丹酚酸B洗脱液，浓缩后调节至pH2以乙酸乙酯萃取除盐，回收乙酸乙酯后以水溶解丹酚酸B，冻干，得到高纯度丹酚酸B样品约10.8g，采用本发明的检测方法，HPLC检测丹酚酸B纯度99.72％，其中杂质I、II、III、IV、V、VI的含量分别为0.01％、0、0.06％、0.09％、0.08％、0.02％。

实施例6

称取丹参干药材1500g(丹酚酸B含量5％)粉碎后过3号筛，加入6L水浸泡2小时后40℃提取0.5h，过滤，药渣同前法再提取2次，合并水提液上大孔吸附树脂(HPD300)，纯水洗脱2BV，再用50％乙醇洗脱6BV。合并醇洗脱部分浓缩，加入95％乙醇或无水乙醇至终浓度75％，离心取上清液并减压浓缩至无醇味，调节pH2，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相并减压浓缩回收乙酸乙酯，旋干即得丹酚酸B中间体。丹酚酸B中间体加水溶解，调节pH6.0，上第二树脂层析柱(HP20SS微球树脂)，树脂体积2L，用8BV水洗脱，后以10％的乙醇洗脱4BV；合并纯度>60％的丹酚酸B洗脱液浓缩，调节pH 6.5，再上之前的第二树脂层析柱，洗脱方式同前，合并纯度>90％的丹酚酸B洗脱液浓缩，调节pH 4.5，上第二树脂层析柱，洗脱方式同前，合并纯度>99％的丹酚酸B洗脱液，浓缩后调节至pH2以乙酸乙酯萃取除盐，回收乙酸乙酯后以水溶解丹酚酸B，冻干，得到高纯度丹酚酸B样品约11.4g，采用本发明的检测方法，HPLC检测丹酚酸B纯度99.70％，其中杂质I、II、III、IV、V、VI的含量分别为0、0、0.07％、0.10％、0.06％、0.03％。

实施例7 药效活性检测

用电凝法制作大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)引起的的急性脑缺血模型，阻断大脑中动脉后立即静脉注射给药。24小时后处死大鼠取出大脑切片做TTC染色，梗死脑组织不能着色，呈白色；正常脑组织被染成红色，染色后经计算机软件测量梗死面积与同侧正常脑组织面积的比例。

实验结果如表1所示，实验从3.75mg/kg的剂量开始，将治疗组脑梗死面积与模型组脑梗面积进行比较，向上增加剂量到7.5mg/kg和15mg/kg时，脑梗面积并没有相应增加，三个剂量的脑梗死面积均在30％左右。当剂量增加到30mg/kg时，脑梗死面积缩小非常明显，为24.4％；继续增加剂量至45mg/kg，脑梗死面积为18.1％，再向上增加剂量到60mg/kg时，脑梗死的面积并没有进一步明显缩小，为17.9％。

上述实验结果表明：

1、本发明的丹参提取物静脉注射给药对大鼠急性脑缺血引起的脑梗死有非常明显的治疗作用；药物的剂量与效应关系明显。

2、本发明的丹参提取物静脉注射给药用于治疗大鼠急性脑缺血的最低剂量应设定为15mg/kg、最高剂量为45mg/kg、中间设置30mg/kg为中剂量。

表1 静脉注射对大鼠MCAO致急性脑缺血的量效关系研究(

n＝10)

与溶剂对照组比较***P<0.001

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (17)

1.一种丹参提取物，其特征在于，所述丹参提取物中含有丹酚酸B和杂质，所述杂质的HPLC含量＞0，并且所述杂质包括HPLC相对保留时间约为1.51的杂质I，所述杂质I的HPLC含量≤0.5％；所述丹酚酸B的HPLC含量为99.62-99.72％；和

其中，所述HPLC的检测条件为：

C18柱；流动相A，0.5％(v/v)甲酸溶液；流动相B，0.5％(v/v)甲酸溶液-乙腈50:50；柱温35℃；流速1ml/min；进样量：10μl；检测波长286nm；梯度洗脱，流动相梯度比例如下：

0-30min，流动相A:流动相B＝59:41；

30-45min，流动相A:59→10％，流动相B：41→90；

45-50min，流动相A:10→59％，流动相B：90→41；

50-55min，流动相A:流动相B＝59:41；且

所述丹参提取物通过如下方法制备：

(1)将丹参干药材粉碎，加入3-10倍水浸泡0.5-4h，于20-90℃提取0.5-2h，过滤药渣取水提液，任选地，可以重复提取1-4次；

(2)合并水提液上第一树脂层析柱，上柱流速0.5-6BV/h，然后用0.5-2BV水洗脱，再用4-12BV的5％-60％的乙醇洗脱，洗脱流速0.5-6BV/h，合并醇洗脱部分减压浓缩至无醇味；

(3)调节(2)中已除醇的洗脱液pH1-5，用0.5-3倍体积的乙酸乙酯萃取1-4次，合并酯相去除乙酸乙酯，得到丹酚酸B中间体，其中丹酚酸B含量为10％-70％；

(4)取丹酚酸B中间体加水溶解，以丹酚酸B计浓度为50-300g/L，调节pH1-7，上第二树脂层析柱，用2-10BV纯水洗脱，流速0.5-6BV/h，再用1-4BV的5％-60％乙醇洗脱，流速0.5-6BV/h，HPLC检测各洗脱部分丹酚酸B纯度；

(5)合并(4)中丹酚酸B的HPLC纯度>60％的洗脱液，浓缩后重复1-3次(4)中的操作，将纯度99％以上的洗脱液合并；

(6)将(4)或(5)中丹酚酸B的HPLC纯度99％以上的丹酚酸B洗脱液浓缩后调节pH1-4以0.5-3倍体积的乙酸乙酯萃取1-4次除盐，合并酯相回收乙酸乙酯，以水溶解旋干的丹酚酸B，冻干，得到所述丹参提取物；

其中，所述第一树脂层析柱为大孔吸附树脂层析柱；

所述第二树脂层析柱为微球树脂层析柱、反相树脂层析柱或大孔吸附树脂层析柱；和

步骤(2)中，合并醇洗脱部分后先调节合并液中乙醇浓度至70％－80％(v/v)，去除沉淀，然后再减压浓缩至无醇味。

2.如权利要求1所述的丹参提取物，其特征在于，所述杂质I的HPLC含量≤0.10％。

3.如权利要求1所述的丹参提取物，其特征在于，所述杂质I的HPLC含量≤0.05％。

4.如权利要求1所述的丹参提取物，其特征在于，所述杂质还包括HPLC相对保留时间约为1.48的杂质II，所述杂质II的HPLC含量≤0.2％。

5.如权利要求1所述的丹参提取物，其特征在于，所述杂质还包括HPLC相对保留时间约为0.55的杂质III，所述杂质III的HPLC含量＞0并且≤0.15％。

6.如权利要求1所述的丹参提取物，其特征在于，所述杂质还包括HPLC相对保留时间约为0.70的杂质IV，所述杂质IV的HPLC含量＞0并且≤0.2％。

7.如权利要求1所述的丹参提取物，其特征在于，所述杂质还包括HPLC相对保留时间约为0.26的杂质V，所述杂质V的HPLC含量＞0并且≤0.3％。

8.如权利要求1所述的丹参提取物，其特征在于，所述杂质还包括HPLC相对保留时间约为1.1的杂质VI，所述杂质VI的HPLC含量＞0并且≤0.2％。

9.如权利要求1所述丹参提取物的用途，其特征在于，所述丹参提取物用于制备药物，所述药物用于治疗或预防心脑血管疾病。

10.如权利要求9所述的丹参提取物的用途，其特征在于，所述心脑血管疾病包括：

(1)急性脑缺血；和/或

(2)脑部缺血性坏死。

11.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的丹参提取物和药学上可接受的载体。

12.如权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型选自下组：胶囊剂、片剂、颗粒剂、混悬剂、微囊制剂、注射剂、栓剂、粉剂、喷雾剂、贴片或软膏剂。

13.一种制备丹参提取物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将丹参干药材粉碎，加入3-10倍水浸泡0.5-4h，于20-90℃提取0.5-2h，过滤药渣取水提液，任选地，可以重复提取1-4次；

(2)合并水提液上第一树脂层析柱，上柱流速0.5-6BV/h，然后用0.5-2BV水洗脱，再用4-12BV的5％-60％的乙醇洗脱，洗脱流速0.5-6BV/h，合并醇洗脱部分减压浓缩至无醇味；

(3)调节(2)中已除醇的洗脱液pH1-5，用0.5-3倍体积的乙酸乙酯萃取1-4次，合并酯相去除乙酸乙酯，得到丹酚酸B中间体，其中丹酚酸B含量为10％-70％；

(4)取丹酚酸B中间体加水溶解，以丹酚酸B计浓度为50-300g/L，调节pH1-7，上第二树脂层析柱，用2-10BV纯水洗脱，流速0.5-6BV/h，再用1-4BV的5％-60％乙醇洗脱，流速0.5-6BV/h，HPLC检测各洗脱部分丹酚酸B纯度；

(5)合并(4)中丹酚酸B的HPLC纯度>60％的洗脱液，浓缩后重复1-3次(4)中的操作，将纯度99％以上的洗脱液合并；

(6)将(4)或(5)中丹酚酸B的HPLC纯度99％以上的丹酚酸B洗脱液浓缩后调节pH1-4以0.5-3倍体积的乙酸乙酯萃取1-4次除盐，合并酯相回收乙酸乙酯，以水溶解旋干的丹酚酸B，冻干，得到所述丹参提取物；

其中，所述第一树脂层析柱为大孔吸附树脂层析柱；

所述第二树脂层析柱为微球树脂层析柱、反相树脂层析柱或大孔吸附树脂层析柱；和

步骤(2)中，合并醇洗脱部分后先调节合并液中乙醇浓度至70％－80％(v/v)，去除沉淀，然后再减压浓缩至无醇味。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述第一树脂层析柱为弱极性或非极性大孔吸附树脂，其参数如下：

粒径0.2-1.25mm；水份：50-75％；湿视密度：0.65-0.85g/ml；湿真密度：1.0-1.1g/ml；表观密度：0.1-0.4g/ml；平均孔径：

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述第一树脂层析柱中的大孔吸附树脂选自下组：HPD300、HPD400、HPD700、HPD-722、HZ-803、HZ-806、HZ-816、H103、AB-8；和/或

所述第二树脂层析柱中的吸附树脂选自下组：HP20SS、HP-21、XAD-4、XAD-16、XAD-1180N、XAD-1600、微球一号、微球二号、HZ-803、HZ-816。

16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述丹参提取物为权利要求1所述的丹参提取物。

17.一种如权利要求1所述的丹参提取物的HPLC分析方法，其特征在于，所述HPLC的检测条件为：

C18柱；流动相A，0.5％(v/v)甲酸溶液；流动相B，0.5％(v/v)甲酸溶液-乙腈50:50；柱温35℃；流速1ml/min；进样量：10μl；检测波长286nm；梯度洗脱，流动相梯度比例如下：

0-30min，流动相A:流动相B＝59:41；

30-45min，流动相A:59→10％，流动相B：41→90；

45-50min，流动相A:10→59％，流动相B：90→41；

50-55min，流动相A:流动相B＝59:41。

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