CN104072456A - 一种高纯度丹酚酸b的制备方法 - Google Patents

一种高纯度丹酚酸b的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从丹参中分离纯化丹酚酸B的方法。丹参药材经过溶剂提取后，提取液浓缩回收溶剂。回收溶剂后的丹参提取物，经过一步大孔吸附树脂初步纯化，溶剂洗脱后，得到纯度超过80％的丹酚酸B样品。样品再次经过一步微球树脂纯化，最终得到纯度超过99％的丹酚酸B。该工艺操作简单，易于工业放大，适用于丹酚酸B高纯度样品的制备，最终丹酚酸B纯度超过99％，得率超过1.5％(按照干药材计算)。

Description

一种高纯度丹酚酸B的制备方法
技术领域
本发明涉及一种中药活性组分的分离纯化方法，尤其涉及一种从丹参中制备丹酚酸B的方法。
背景技术
丹参来源于唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza)的干燥根及根茎。丹参广泛的应用于心脑血管疾病、肝病、肾病、糖尿病并发症、神经系统疾病的治疗。丹参中主要的活性组分包括脂溶性菲醌类化合物(以丹参酮ⅡA为代表)和水溶性丹酚酸类化合物(以丹酚酸B为代表)。由于中药的使用方法以水煎煮为主，所以丹参的水溶性组分吸引了大家的广发注意。丹酚酸B是含量最高的丹参水溶性组
分，文献报道其具有抗氧化、清除自由基、对抗血小板凝集、抗炎、抗肿瘤等活性。丹参主要水溶性组分结构：
丹参水溶性组分结构相似、性质相近，很难通过常规的方法将其中各个单体有效分离，这严重限制了其作为新药开发的进展。很多人研究了丹酚酸B高纯度产品的制备工艺。中国专利(申请号200710166155.2)采用酸水提取丹参药材，提取物经过聚酰胺树脂纯化，纯化产物再次经过大孔吸附树脂纯化，然后经过溶剂法精制，产物最终经过Sephadex LH-20或者反相硅胶柱层析纯化，最终可以得到纯度超过98％的丹酚酸B样品。然而，该工艺步骤繁琐，操作复杂且成本较高，难以满足丹酚酸B纯品的大量工业制备。中国专利(200810041104.1)是目前报道的最适用于大量生产的丹酚酸B制备工艺。该工艺采用水提取丹参，提取物经过微生物降解其中的主要杂质迷迭香酸，然后再采用反相树脂纯化，最终可以得到纯度99％的丹酚酸B。该方法虽然得到的丹酚酸B纯度较高，但是其需要经过一步微生物降解的过程，增加了工艺的步骤。
目前，工业化制备高纯度的丹酚酸B(纯度≥99％，HPLC)仍然相当困难，严重阻碍了丹酚酸B注射剂的开发。因此，本领域的技术人员致力于开发一种操作简单、成本低廉、适用于高纯度丹酚酸B产品的大量制备工艺，以满足注射用制剂原料药的需求。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种从丹参中提取丹酚酸B的操作简单、成本低廉，适用于高纯度丹酚酸B产品的大量制备工艺。
为实现上述目的，发明人经过广泛而深入的研究，意外的发现，使用大孔吸附树脂和微球树脂，经过两步柱层析，能够获得纯度很高的丹酚酸B，而且丹酚酸B的回收率也很高。
具体地，本发明的一种高纯度丹酚酸B的制备方法，包括步骤：
(1)丹参药材的溶剂提取
采用水或者乙醇、甲醇或丙酮水溶液提取丹参药材得提取液；
(2)初步纯化
调节提取液pH1-4，采用，采用甲醇、乙醇或丙酮水溶液洗脱，洗脱液浓缩去除有机溶剂得浓缩液；
(3)精制
将步骤(2)制得的浓缩液调节pH至6-9，采用微球树脂吸附，洗脱剂洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥得精制的丹酚酸B。
优选地，步骤(1)中，提取温度为40-100℃，更优选地提取温度为50-80℃，最优选地提取温度为60-70℃。
优选地，步骤(1)中，采用10％-80％(v/v)的乙醇、甲醇或丙酮水溶液提取丹参药材。更优选地，采用30％-80％(v/v)的乙醇、甲醇或丙酮水溶液提取丹参药材。最优选地，采用40％-70％(v/v)的乙醇、甲醇或丙酮水溶液提取丹参药材。
优选地，步骤(1)中，提取时间为1-10h。更优选地，提取时间为2-8h，最优选地，提取时间为2-6h。
优选地，步骤(1)中，提取过程中维持pH为1-5。更优选地，步骤(1)中，提取过程中维持pH为2-4。最优选地，步骤(1)中，提取过程中维持pH为2.5-3.5。
优选地，步骤(2)中，调节提取液pH2-4，然后再采用大孔吸附树脂进行吸附。
优选地，步骤(2)中，所述大孔吸附树脂为聚苯乙烯-聚乙烯苯为骨架的低极性吸附树脂。
优选地，步骤(2)中，所述大孔吸附树脂为XAD2、XAD4、XAD16N、XAD16HP、XAD18、XAD1600N、HZ816或HP20树脂。
优选地，步骤(2)中，甲醇、乙醇或丙酮水溶液的浓度为20％-60％(v/v)。更优选地，步骤(2)中，甲醇、乙醇或丙酮水溶液的浓度为30％-55％(v/v)。更最选地，步骤(2)中，甲醇、乙醇或丙酮水溶液的浓度为40％-50％(v/v)。
优选地，步骤(3)中，浓缩液pH调节至6.5-8.5，然后再采用微球树脂吸附。更优选地，步骤(3)中，浓缩液pH调节至6.8-7.8，然后再采用微球树脂吸附。最优选地，步骤(3)中，浓缩液pH调节至6.8-7.5，然后再采用微球树脂吸附。在一些优选地实施方式中，浓缩液pH可以调节为6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。
优选地，步骤(3)中，微球树脂为聚苯乙烯-聚乙烯苯为骨架的粒径在30-500μm之间的低极性树脂。
优选地，步骤(3)中，微球树脂为微球1号、微球2号、UniPSTM30、UniPSTM40或UniPSTM50树脂。
优选地，步骤(3)中，洗脱剂为水、≤20％(v/v)的甲醇水溶液、≤15％(v/v)的乙醇水溶液或者≤15％(v/v)的丙酮水溶液。
本发明的优势特点：
(1)操作工艺简单，成本较低，易于放大至工业生产。本发明所采用的提取设备、树脂、浓缩设备、干燥设备等，均有相关的大生产设备销售，可以直接应用。本发明采用的树脂，价格较低，可以反复再生使用，有效降低成本。
(2)环境友好。本发明采用的溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮等，属于低毒或无毒溶剂，且皆可以回收重复利用，降低了污染物排放，有利于环境的保护。
(3)产物纯度高，得率高。本发明得到的丹酚酸B产品，HPLC纯度超过99％，可以作为一类新药注射制剂的原料药使用，在优化条件下能够将精制的丹酚酸B成品中的总杂质含量控制在0.5％(HPLC)以下、单杂质含量控制在0.1％(HPLC)以下。同时，本发明最终丹酚酸B得率可以达到50％以上(按照干药材含量3％(w/w)计算)，充分保证了该工艺的可实施性。
本发明中HPLC检测条件为：安捷伦高效液相色谱仪(HP1100)，采用C18色谱柱，流动相组成为(乙腈：1％甲酸水溶液＝30:70)，流动相流速0.8mL/min，检测波长286nm，进样体积5μL。
附图说明
图1是实施例1中丹参提取物的HPLC图谱；1，丹酚酸B；2，紫草酸；3，迷迭香酸。
图2是实施例1中丹参提取物经过大孔吸附树脂初步纯化后产物的HPLC图谱；1，丹酚酸B；2，紫草酸；3，迷迭香酸。
图3是实施例1中经过微球树脂精制后的丹酚酸B产品的HPLC图谱。
图4是实施例1中制备的丹酚酸B和标准品共进样的HPLC图谱。
图5是对比例1中制备的较低纯度的丹酚酸B产品的HPLC图谱。
本发明中丹酚酸B对照品购自上海同田生物技术有限公司，其他试剂及材料均可从市售渠道购买获得。微球1号、微球2号、HZ816树脂购自上海华震生物科技有限公司。XAD2、XAD4、XAD16N、XAD16HP、XAD18、XAD1600N购自罗门哈斯公司。HP20树脂购自日本三菱化学公司。UniPSTM30、UniPSTM40或UniPSTM50树脂购自苏州纳微科技有限公司。
具体实施方式
实施例1
步骤一、丹参药材100g，加入1L水，80℃搅拌提取两次，每次1小时，过滤，合并两次滤液，浓缩滤液至200mL。
步骤二、调节提取液pH至2，过100mL大孔吸附树脂XAD2柱(高径比8:1)，50％乙醇洗脱，分步收集50％乙醇洗脱液，HPLC检测，合并纯度超过80％样品。
步骤三、浓缩上述纯度大于的80％丹酚酸B乙醇溶液至无醇味，调节至pH7，过过100mL微球树脂微球1号树脂柱(高径比8:1)，水洗脱，分步收集，HPLC检测，合并纯度超过99％样品，纯度未达到99％样品再次过微球树脂纯化。冷冻干燥纯度99％丹酚酸B样品，最终得到99.6％丹酚酸B1.80g，HPLC图谱如图3所示。
实施例2
将实施例1步骤一中丹参药材的提取溶剂换为10％乙醇，步骤二中大孔吸附树脂替换为XAD4，其余不变，最终得到99.5％的丹酚酸B1.55g。
实施例3
将实施例1步骤一中丹参药材的提取溶剂换为80％乙醇，步骤二中大孔吸附树脂替换为XAD16HP，其余不变，最终得到99.4％的丹酚酸B1.85g。
实施例4
将实施例1步骤一中丹参药材的提取溶剂换为10％甲醇，步骤二中大孔吸附树脂替换为XAD16N，其余不变，最终得到99.6％的丹酚酸B1.52g。
实施例5
将实施例1步骤一中丹参药材的提取溶剂换为80％甲醇，步骤二中大孔吸附树脂替换为XAD18，其余不变，最终得到99.5％的丹酚酸B1.62g。
实施例6
将实施例1步骤一中丹参药材的提取溶剂换为10％丙酮，步骤二中大孔吸附树脂替换为XAD1600N其余不变，最终得到99.4％的丹酚酸B1.58g。
实施例7
将实施例1步骤一中丹参药材的提取溶剂换为80％丙酮，步骤三中微球树脂更换为UniPSTM30，其余不变，最终得到99.1％的丹酚酸B1.93g。
实施例8
将实施例1步骤二中过大孔吸附树脂前pH调节至1，步骤三中微球树脂更换为UniPSTM40，其余不变，最终得到99.8％的丹酚酸B1.50g。
实施例9
将实施例1步骤二中过大孔吸附树脂前pH调节至3，步骤三中微球树脂更换为UniPSTM50，其余不变，最终得到99.5％的丹酚酸B1.63g。
实施例10
将实施例1步骤二中大孔吸附树脂更换为HZ816树脂，步骤三中微球树脂更换为UniPSTM30，其余不变，最终得到99.0％的丹酚酸B1.70g。
实施例11
将实施例1步骤二中大孔吸附树脂更换为HP20树脂，步骤三中微球树脂更换为UniPSTM50，其余不变，最终得到99.2％的丹酚酸B1.55g。
实施例12
将实施例1步骤二中大孔吸附树脂替换为XAD18，大孔吸附树脂洗脱液更换为40％的甲醇，步骤三中微球树脂更换为UniPSTM50，其余不变，最终得到99.1％的丹酚酸B1.61g。
实施例13
将实施例1步骤二中大孔吸附树脂替换为XAD1600N，大孔吸附树脂洗脱液更换为80％的甲醇，步骤三中微球树脂更换为UniPSTM30，其余不变，最终得到99.1％的丹酚酸B1.51g。
实施例14
将实施例1步骤二中大孔吸附树脂洗脱液更换为30％的乙醇，其余不变，最终得到99.3％的丹酚酸B1.65g。
实施例15
将实施例1步骤二中大孔吸附树脂洗脱液更换为70％的乙醇，其余不变，最终得到99.0％的丹酚酸B1.55g。
实施例16
将实施例1步骤二中大孔吸附树脂洗脱液更换为30％的丙酮，其余不变，最终得到99.1％的丹酚酸B1.50g。
实施例17
将实施例1步骤二中大孔吸附树脂洗脱液更换为80％的丙酮，其余不变，最终得到99.1％的丹酚酸B1.59g。
实施例18
将实施例步骤三中上微球树脂柱前调节pH6，其余同实施例1，最终得到99.0％的丹酚酸B1.60g。
实施例19
将实施例步骤三中上微球树脂柱前调节pH9，其余同实施例1，最终得到99.1％的丹酚酸B1.50g。
实施例20
将实施例步骤三中微球树脂更换为微球2号，其余同实施例1，最终得到99.0％的丹酚酸B1.60g。
实施例21
将实施例步骤三中洗脱液更换为20％的甲醇，其余同实施例1，最终得到99.4％的丹酚酸B1.50g。
实施例22
将实施例步骤三中洗脱液更换为15％的乙醇，其余同实施例1，最终得到99.0％的丹酚酸B1.75g。
实施例23
将实施例步骤三中洗脱液更换为15％的丙酮，其余同实施例1，最终得到99.5％的丹酚酸B1.70g。
对比例1
将实施例1步骤二中大孔吸附树脂更换为微球1号树脂，其余条件不变，无法制得纯度大于99％的丹酚酸B，最终仅得到94.6％的丹酚酸B1.65g。
对比例2
将实施例10步骤二中大孔吸附树脂更换为UniPSTM30，其余条件不变，无法制得纯度大于99％的丹酚酸B，最终仅得到97.6％的丹酚酸B1.60g。
对比例3
将实施例11步骤二和步骤三的操作顺序颠倒，即先执行步骤三再执行步骤二，无法制得纯度大于99％的丹酚酸B，最终仅得到93.2％的丹酚酸B1.46g。
对比例4
将实施例12步骤三中微球树脂更换为XAD18，其余不变，无法制得纯度大于99％的丹酚酸B，最终仅得到94.3％的丹酚酸B1.64g。
对比例5
将实施例1步骤三中微球树脂更换为大孔吸附树脂XAD2，其余不变，无法制得纯度大于99％的丹酚酸B，最终仅得到89.6％的丹酚酸B1.45g。
对比例6
将实施例1步骤二中pH调节至6，其余不变，无法制得纯度大于99％的丹酚酸B，最终仅得到92.4％的丹酚酸B1.58g。
对比例7
将实施例2步骤三中pH调节至2，其余不变，无法制得纯度大于99％的丹酚酸B，最终仅得到91.3％的丹酚酸B1.42g。
对比例8
将实施例1步骤三中pH调节至10，其余不变，无法制得纯度大于99％的丹酚酸B，最终仅得到82.3％的丹酚酸B1.36g。该对比例中pH过高导致丹酚酸B破坏严重。
对比例9
将实施例1步骤三中洗脱剂换为25％的乙醇，其余不变，无法制得纯度大于99％的丹酚酸B，最终仅得到96.1％的丹酚酸B1.64g。由于乙醇浓度过高，杂质随丹酚酸B一起被洗脱下来。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种高纯度丹酚酸B的制备方法，包括以下步骤：
(1)丹参药材的溶剂提取
采用水或者乙醇、甲醇或丙酮水溶液提取丹参药材得提取液；
(2)初步纯化
调节提取液pH1-4，采用，采用甲醇、乙醇或丙酮水溶液洗脱，洗脱液浓缩去除有机溶剂得浓缩液；
(3)精制
将步骤(2)制得的浓缩液调节pH至6-9，采用微球树脂吸附，洗脱剂洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥得精制的丹酚酸B。
2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，提取温度为40-100℃，更优选地提取温度为50-80℃，最优选地提取温度为60-70℃。
3.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，采用10％-80％(v/v)的乙醇、甲醇或丙酮水溶液提取丹参药材。
4.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，所述大孔吸附树脂为聚苯乙烯-聚乙烯苯为骨架的低极性吸附树脂。
5.如权利要求4所述的方法，其中，步骤(2)中，调节提取液pH2-4，然后再采用大孔吸附树脂进行吸附。
6.如权利要求1所述的方法，其中，微球树脂为聚苯乙烯-聚乙烯苯为骨架的粒径在30-500μm之间的低极性树脂。
7.如权利要求6所述的方法，其中，步骤(3)中，浓缩液pH调节至6.5-8.5，然后再采用微球树脂吸附。
8.如权利要求6所述的方法，其中，步骤(3)中，浓缩液pH调节至6.8-7.8，然后再采用微球树脂吸附。
9.如权利要求6所述的方法，其中，步骤(3)中，微球树脂为微球1号、微球2号、UniPSTM30、UniPSTM40或UniPSTM50树脂。
10.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)中，洗脱剂为水、≤20％(v/v)的甲醇水溶液、≤15％(v/v)的乙醇水溶液或者≤15％(v/v)的丙酮水溶液。
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C04 Withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20141001