CN106916859A - 一种从甘草废渣中快速提取甘草素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药提取领域，尤其涉及一种从甘草废渣中快速提取甘草素的方法。以碱提酸沉法提取甘草酸后的剩余废渣为原料，超声提取后，降温酶解；酶解液真空抽滤，滤液浓缩至干后，用乙醇溶解，得到浓缩液；将浓缩液注射于CHEETAH中高压快速制备液相色谱柱，分析色谱检测含甘草素浓度最大的馏分及前、后两侧共三个馏分合并，减压浓缩干燥后，得到高纯度甘草素产品。从甘草废渣中快速提取甘草素的方法，该方法操作简单、环保无污染、得到的产品纯度高。
Description
技术领域
本发明属于中药提取领域，尤其涉及一种从甘草废渣中快速提取甘草素的方法。
背景技术
甘草为豆科甘草属植物，其根茎是常用的中草药和经济植物。甘草中含有大量活性成分，具有抗炎、抗变态反应、抗溃疡、抗HIV病毒、抗SARS病毒、抗氧化和抗癌等药理活性；从甘草中提取活性成分甘草酸等萜类产品后，剩余物中主要含有黄酮类化合物，早期作为废渣丢弃。近年来，随着对中药的深入研究，人们发现黄酮类成分也具有重要的药理作用，而甘草黄酮类化合物中主要的活性成分有甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素等。
甘草素是甘草苷的苷元，为白色针状晶体，分子式为C15H12O4，分子量256.25。据研究报道，甘草中甘草苷含量约为3.6%，而甘草素的含量仅为0.1%左右，有些甘草甚至检测不出该成分，从甘草中直接分离提取高纯度的甘草素十分困难，并且现有技术中公开的提取方法，均存在提取率较低的问题。例如，中国专利CN102112142A，用于提高甘草或甘草提取物中甘草素含量的提取方法，是先用水或有机溶剂提取，配合酸水解提高甘草素含量，不仅提取效率低，而且产物中甘草素的含量较低；中国专利CN102391232B，从甘草中提取甘草素，使用聚酰胺和大孔树脂的混合柱，在一定程度上提高了甘草素的纯度，但纯化后需经两次8小时的析晶过程，才能得到甘草素产品，该操作过程比较繁琐，对工艺参数要求比较严格，不易控制。
综上所述，研究一种可以高效率提取甘草素的提取方法，对于其药物应用十分有必要。
发明内容
针对上述问题，本发明提供从甘草废渣中快速提取甘草素的方法，该方法操作简单、环保无污染、得到的产品纯度高。
为了实现上述目的，本发明提供的从甘草废渣中快速提取甘草素的方法，包括以下步骤。
步骤1、以碱提酸沉法提取甘草酸后的剩余废渣为原料，加入5-10倍体积的蒸馏水，混合均匀后，90℃条件下超声提取2小时；降温至50-60℃后加入原料重量的2-5%的纤维素酶酶解。
步骤2、将酶解液真空抽滤，取滤渣重复步骤1操作两次，将酶解液真空抽滤；合并三次抽滤得到的滤液，浓缩至干后，用1-2倍体积的95%乙醇溶解两次，得到浓缩液。
步骤3、将浓缩液注射于CHEETAH中高压快速制备液相色谱柱，该制备液相色谱配有二元溶剂混合系统、监测系统和馏分自动收集系统，可在不超过10Mpa压力下操作，洗脱流速设定范围为0-100mL/min；本发明所用色谱柱内填充YWG C18和MCI混合固定相，进样体积为3.5-7mL，设定制备色谱仪的检测波长为276nm，洗脱流速5mL/min，洗脱流动相为30%-70%乙醇溶剂，每20分钟自动收集一个馏分，将通过分析色谱检测含甘草素浓度最大的馏分及前、后两侧共三个馏分合并，减压浓缩在60℃下干燥30min-1h后，得到高纯度甘草素产品。
所述步骤1中酶解得温度为50-60℃，酶解时间为4小时。
所述步骤2中浓缩为真空旋转蒸发浓缩，浓缩温度为60℃。
所述步骤3中色谱柱的规格为40g，结构为上粗下细台柱型结构；所述的YWG C18和MCI混合固定相为两种填料顺序填充至色谱柱，体积比为1:2-4，其中YWG C18填料的颗粒粒径为15 μm，MCI颗粒粒径为10 μm。
所述的顺序填充是指先填充YWG C18固定相，再填充MCI固定相，且两种固定相的体积比为1:2或1:3或1:4。
本发明的有益效果。
本发明从提取甘草酸剩余废渣中提取甘草素，不仅避免了原料资源的浪费，而且甘草总黄酮得到了富集，更有利于利用酶解和色谱分离方法，得到更多具有更高纯度的甘草素产品；本发明使用碱提酸沉法提取甘草酸后的剩余废渣为原料，提高了甘草资源的利用率，碱提酸沉法提取甘草酸及萜类等比较彻底，得到的总黄酮含量更高，也更利于制备甘草素，并且如前所述从甘草中直接分离提取高纯度的甘草素十分困难，如果直接以甘草为原料进行提取，杂质含量过高，色谱分离中容易产生过载效应和谱峰重叠现象，很难得到具有一定质量和较高纯度的甘草素产品；提取和制备过程中使用水-乙醇为溶剂，并且严格控制乙醇的用量，避免了诸如甲醇、三氯甲烷等毒性有机试剂的应用，工艺绿色，无有机溶剂残留，属于环保型提取方法；本发明采用纤维素酶对原料进行酶解，使得甘草总黄酮中的苷类水解生成苷元甘草素，因而甘草素含量大大提高，从原料含量的3%提高到30%，降低了甘草素分离纯化的难度。
本发明在提取过程中在CHEETAH中高压快速纯化制备色谱仪器，采用成熟的工业部件，全自动的软件控制，操作人员只需要输入建立的方法，系统自动实现从溶剂注入到馏分收集，制备过程自动化程度高，直接提高了提取效率。
本发明经快速制备得到的甘草素产品纯度高（90%-100%），最高可制得甘草素纯品。色谱柱采用顺序混合制备填料，相比完全采用C18固定相，生产成本降低了1/3，甘草素的纯度提高了近1.2倍；而相比两种填料完全混合后填充色谱柱再进行分离纯化，甘草素的纯度提高超过1.5倍，同时该工艺简单，可实现大规模生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1。
取100g提取甘草酸后的剩余废渣原料，加入5倍量蒸馏水，混匀，90℃超声提取2小时，降温至50℃，加入5%重量的纤维素酶酶解，酶解4小时。将酶解液真空抽滤，滤渣重复上述操作两次，合并滤液，在60℃下真空旋转蒸发浓缩至干，用少量95%乙醇溶解。取溶解液4mL注射入CHEETAH制备色谱仪的色谱柱端口，色谱柱内固定相是顺序填充的体积比为1:4的YWG C18和MCI混合填料。设定制备检测波长为276nm，流动相流速5mL/min，用30%乙醇水流动相洗脱，收集目标馏分，在60℃下减压浓缩得纯化后甘草素产品。甘草素纯度为95.4%。
实施例2。
取100g提取甘草酸后的剩余废渣原料，加入6倍量蒸馏水，混匀，90℃超声提取2小时，降温至50℃，加入5%重量的纤维素酶酶解，酶解4小时。将酶解液真空抽滤，滤渣重复上述操作两次，合并滤液，在60℃下真空旋转蒸发浓缩至干，用少量95%乙醇溶解。取溶解液4mL注射入CHEETAH制备色谱仪的色谱柱端口，色谱柱内固定相是顺序填充的体积比为1:4的YWG C18和MCI混合填料。设定制备检测波长为276nm，流动相流速5mL/min，用45%乙醇水流动相洗脱，收集目标馏分，在60℃下减压浓缩得纯化后甘草素产品。甘草素纯度为92.1%。
实施例3。
取100g提取甘草酸后的剩余废渣原料，加入5倍量蒸馏水，混匀，90℃超声提取2小时，降温至50℃，加入5%重量的纤维素酶酶解，酶解4小时。将酶解液真空抽滤，滤渣重复上述操作两次，合并滤液，在60℃下真空旋转蒸发浓缩至干，用少量95%乙醇溶解。取溶解液3.5mL注射入CHEETAH制备色谱仪的色谱柱端口，色谱柱内固定相是顺序填充的体积比为1:2的YWG C18和MCI混合填料。设定制备检测波长为276nm，流动相流速5mL/min，用30%乙醇水流动相洗脱，收集目标馏分，在60℃下减压浓缩得纯化后甘草素产品。甘草素纯度为89.4%。
实施例4。
取100g提取甘草酸后的剩余废渣原料，加入5倍量蒸馏水，混匀，90℃超声提取2小时，降温至50℃，加入5%重量的纤维素酶酶解，酶解4小时。将酶解液真空抽滤，滤渣重复上述操作两次，合并滤液，在60℃下真空旋转蒸发浓缩至干，用少量95%乙醇溶解。取溶解液7mL注射入CHEETAH制备色谱仪的色谱柱端口，色谱柱内固定相是顺序填充的体积比为1:2的YWG C18和MCI混合填料。设定制备检测波长为276nm，流动相流速5mL/min，用45%乙醇水流动相洗脱30min后换70%乙醇水流动相继续洗脱，收集目标馏分，在60℃下减压浓缩得纯化后甘草素产品。甘草素纯度为100%。
对比例。
实施例5。
取100g提取甘草酸后的剩余废渣原料，加入5倍量蒸馏水，混匀，90℃超声提取2小时，降温至50℃，加入5%重量的纤维素酶酶解，酶解4小时。将酶解液真空抽滤，滤渣重复上述操作两次，合并滤液，在60℃下真空旋转蒸发浓缩至干，用少量95%乙醇溶解。取溶解液4mL注射入CHEETAH制备色谱仪的色谱柱端口，色谱柱内固定相是YWG C18填料。设定制备检测波长为276nm，流动相流速5mL/min，用40%乙醇水流动相洗脱，收集目标馏分，在60℃下减压浓缩得纯化后甘草素产品。甘草素纯度为77%。
实施例6。
取100g提取甘草酸后的剩余废渣原料，加入5倍量蒸馏水，混匀，90℃超声提取2小时，降温至50℃，加入5%重量的纤维素酶酶解，酶解4小时。将酶解液真空抽滤，滤渣重复上述操作两次，合并滤液，在60℃下真空旋转蒸发浓缩至干，用少量95%乙醇溶解。取溶解液3mL注射入CHEETAH制备色谱仪的色谱柱端口，色谱柱内固定相是正相硅胶填料（40μm）。设定制备检测波长为276nm，流动相流速3mL/min，用体积比为1:1的正己烷-乙醇流动相洗脱，收集目标馏分，在60℃下减压浓缩得纯化后甘草素产品。甘草素纯度为39%。
实施例7。
取100g提取甘草酸后的剩余废渣原料，加入5倍量蒸馏水，混匀，90℃超声提取2小时，降温至50℃，加入5%重量的纤维素酶酶解，酶解4小时。将酶解液真空抽滤，滤渣重复上述操作两次，合并滤液，在60℃下真空旋转蒸发浓缩至干，用少量95%乙醇溶解。取溶解液3.5mL注射入CHEETAH制备色谱仪的色谱柱端口，色谱柱内固定相是体积比1:2的YWG C18和MCI完全混合后填充而成。设定制备检测波长为276nm，流动相流速5mL/min，用45%乙醇作为流动相洗脱，收集目标馏分，在60℃下减压浓缩得纯化后甘草素产品。甘草素纯度为59%。
由上述7个实施例可以看出：采用正相硅胶填料分离纯化甘草素，效果较差；完全采用YWG C18固定相分离纯化甘草素不仅成本高，且分离纯化效果一般；将YWG C18和MCI两种填料完全混合后用其分离甘草素，效果也较差；而将YWG C18和MCI两种填料按一定次序和比例进行混合，填充于色谱柱中，再进行甘草素的分离纯化则可获得较佳的分离效果，甚至得到100%纯度的甘草素产品。
上述实施例不作为对本发明的限定，凡在本发明的范围内所作的任何修改、等同替换、改进等，均属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种从甘草废渣中快速提取甘草素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、超声提取和酶解处理；
步骤2、酶解液真空抽滤并浓缩；
步骤3、将浓缩液注射于CHEETAH中高压快速制备液相色谱柱，将通过分析色谱检测含甘草素浓度最大的馏分及前、后两侧共三个馏分合并，减压浓缩在60℃下干燥30min-1h后，得到高纯度甘草素产品。
2.如权利要求1所述的从甘草废渣中快速提取甘草素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、以酸提酸沉法提取甘草酸后的剩余废渣为原料，加入5-10倍体积的蒸馏水，混合均匀后，90℃条件下超声提取2小时；降温至50-60℃后加入原料重量的2-5%的纤维素酶酶解；
步骤2、将酶解液真空抽滤，取滤渣重复步骤1操作两次，将酶解液真空抽滤；合并三次抽滤得到的滤液，浓缩至干后，用1-2倍的95%乙醇溶解两次，得到浓缩液；
步骤3、将浓缩液注射于CHEETAH中高压快速制备液相色谱柱，该制备液相色谱配有二元溶剂混合系统、监测系统和馏分自动收集系统，可在不超过10pa压力下操作，洗脱流速设定范围为0-100mL/min；所用色谱柱内填充YWG C18和MCI混合固定相，进样体积为3.5-7mL，设定制备色谱仪的检测波长为276nm，洗脱流速5mL/min，洗脱流动相为30%-70%乙醇溶剂，每20分钟自动收集一个馏分，将通过分析色谱检测含甘草素浓度最大的馏分及前、后两侧共三个馏分合并，减压浓缩在60度下干燥30min-1h后，得到高纯度甘草素产品。
3.如权利要求1所述快速提取甘草素的方法，其特征在于，所述步骤2中酶解得温度为50-60度，酶解时间为4小时。
4.如权利要求1所述快速提取甘草素的方法，其特征在于，所述步骤2中浓缩为真空旋转蒸发浓缩，浓缩温度为60度。
5.如权利要求1所述快速提取甘草素的方法，其特征在于，所述步骤3中色谱柱的规格为40g，结构为上细下粗台柱型结构；所述的YWG C18和MCI混合固定相为两种填料顺序填充至色谱柱，重量比为1:2-4，其中YWG C18填料的颗粒粒径为15 μm，MCI颗粒粒径为10 μm。
6.如权利要求5所述快速提取甘草素的方法，其特征在于，所述的顺序填充是指先填充YWG C18固定相，再填充MCI固定相，且两种固定相的体积比为1:2、1:3和1:4。
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