CN104829474B - 一种从枸杞叶中制备甜菜碱化学对照品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从枸杞叶中制备甜菜碱化学对照品的方法，该方法包括以下步骤：⑴水提取：枸杞叶阴干、粉碎后加入分析纯水进行提取，经过滤、减压干燥至膏状，即得棕黑色固体状枸杞叶水提物；⑵硅胶柱富集：将枸杞叶水提物经硅胶柱色谱分离后，洗脱，按每份1000~2000 mL收集馏分，并经薄层色谱检测，合并Rf值为0.1~0.2的馏分；Rf值为0.1~0.2的馏分经减压干燥即得棕黄色粉末状的甜菜碱粗品；⑶亲水液相制备色谱精制：甜菜碱粗品用乙醇溶液溶解，然后过滤、亲水液相制备色谱分离，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于99%的白色粉末状的对照品。本发明工艺简单、易规模化。

Description

一种从枸杞叶中制备甜菜碱化学对照品的方法

技术领域

本发明涉及一种甜菜碱（Betaine）化学对照品的制备方法，尤其涉及一种从枸杞叶中制备甜菜碱化学对照品的方法。

背景技术

枸杞叶系属茄科（Solanaceae）枸杞属（Lycium）植物宁夏枸杞（Lycium barbarumL.）的叶。宁夏枸杞植物嫩茎叶或嫩芽俗称天精草，《本草纲目》中记载：天精草能“除烦益智，补五劳七伤，壮心气，去皮肤骨节间风，消热毒，散疮肿”。甜菜碱是枸杞叶中含量较高的一个季胺类生物碱，现代药理学研究表明，甜菜碱具有增强免疫力、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、促进脂肪代谢、抗脂肪肝、保护肾脏、降压、缓和应激、增进食欲等多种药理活性，有望在以后的中国药典中将其作为天精草的质控指标成分。由于该化合物极性非常大，获取高纯度对照品主要依赖合成、离子交换树脂纯化及反复结晶的方法，生产量逐渐难以满足日益增长的需求；枸杞叶资源包括野生资源及种植资源，现阶段，少量用于天精茶的制作过程，而绝大多数还处于荒废不被利用；这些严重影响了枸杞叶资源的质量评价及其新药研发的步伐。因此，发展高纯度甜菜碱的高效制备方法，尤其规模化制备技术具有重要意义。

目前，从植物中制备甜菜碱的报道较少，中国专利（101863784B）报道采用合成法8~10步得到纯度约为98%的无水甜菜碱，过程较繁琐且结晶过程损失量较大。从植物中规模化获取甜菜碱的制备研究未见文献报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、易规模化的从枸杞叶中制备甜菜碱化学对照品的方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种从枸杞叶中制备甜菜碱化学对照品的方法，包括以下步骤：

⑴水提取：

枸杞叶阴干、粉碎后加入其质量4~10倍的分析纯水，在60~95℃下提取1~3次，每次1~3 h，过滤、合并滤液A，该滤液A经减压干燥至膏状，即得棕黑色固体状枸杞叶水提物；

⑵硅胶柱富集：

将所述枸杞叶水提物经硅胶柱色谱分离后，用8~20倍柱体积的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，按每份1000~2000 mL收集馏分，并经薄层色谱检测，其中展开剂为氯仿-甲醇-水混合溶剂，显色剂为碘蒸汽，合并Rf值为0.1~0.2的馏分；所述Rf值为0.1~0.2的馏分经减压干燥即得棕黄色粉末状的甜菜碱粗品；

⑶亲水液相制备色谱精制：

所述甜菜碱粗品用其质量2~5倍的体积分数为30%~100%的乙醇溶液溶解，然后配制样品浓度为80.0~200.0 mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B，该滤液B经亲水液相制备色谱分离，经检测波长为200 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于99%的白色粉末状的对照品。

所述步骤⑴、所述步骤⑵和所述步骤⑶中减压干燥的条件均是指真空度为0.06~0.09 MPa，温度为50~70 ℃。

所述步骤⑵中硅胶柱色谱的条件是指硅胶柱尺寸为20~80cm×60~100cm。

所述步骤⑵中氯仿-甲醇-水混合溶剂是指将氯仿、甲醇、水按8：2：0.2~6：4：1体积比混合均匀而得。

所述步骤⑶中亲水液相制备色谱分离的工作参数是指色谱柱柱长250 mm、直径20~100 mm，亲水制备柱固定相为10 μm酰胺柱（XAmide）或两性离子柱（Click XIon），流动相为体积分数5~10%正庚烷-乙醇溶液或10~15%正己烷-乙醇溶液，进样体积为5~40mL，流速为15~265 mL/min。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明工艺简单、回收率高。

第一步采用分析纯水提取，可直接将枸杞叶中水溶性成分提取出来；第二步采用硅胶柱富集，可直接将枸杞叶中多糖及大部分色素吸附于硅胶上（参见图1），同时，将枸杞叶中含甜菜碱的组分洗脱下来。第三步采用亲水液相制备色谱制备，可获取高纯度对照品，且收率较高（参见图2）。

2、本发明采用的技术手段非常适宜放大进行规模化生产。

原料要求不高、成本低廉，一般种植的枸杞叶或野生的枸杞叶即可，易于批量备料；第一步水提，易于操作；第二步采用硅胶柱富集，该硅胶价格低廉，易于规模化；第三步精制中采用亲水液相制备色谱制备，为快速的等度方法，也非常适宜放大规模生产。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明经硅胶柱富集后甜菜碱的HPLC分析图谱（200 nm）。

图2为本发明高纯度甜菜碱的HPLC分析图谱（200 nm）。

具体实施方式

实施例1 一种从枸杞叶中制备甜菜碱化学对照品的方法，包括以下步骤：

⑴水提取：

1.0 Kg枸杞叶阴干、粉碎后加入其质量4倍的分析纯水，在60℃下提取1次，每次2h，过滤、合并滤液A，该滤液A经减压干燥至膏状，即得棕黑色固体状枸杞叶水提物。

其中：减压干燥的条件是指真空度为0.06 MPa，温度为70 ℃。

⑵硅胶柱富集：

将枸杞叶水提物经硅胶柱色谱分离后，用20倍柱体积的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，按每份1000 mL收集馏分，并经薄层色谱检测，其中展开剂为氯仿-甲醇-水混合溶剂，显色剂为碘蒸汽，合并Rf值为0.1~0.2的馏分；所述Rf值为0.1~0.2的馏分经减压干燥即得棕黄色粉末状的甜菜碱粗品34.8 g。

其中：

减压干燥的条件是指真空度为0.06 MPa，温度为70 ℃。

硅胶柱色谱的条件是指硅胶柱尺寸为20cm×60cm。

氯仿-甲醇-水混合溶剂是指将氯仿、甲醇、水按8：2：0.2体积比（mL/ mL）混合均匀而得。

⑶亲水液相制备色谱精制：

甜菜碱粗品用其质量5倍的体积分数为100%的乙醇溶液溶解，然后配制样品浓度为120.0 mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B，该滤液B经亲水液相制备色谱分离，经检测波长为200 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于99%的白色粉末状的对照品30.0 g，收率为86.2%。

其中：

减压干燥的条件是指真空度为0.06 MPa，温度为70 ℃。

亲水液相制备色谱分离的工作参数是指色谱柱柱长250 mm、直径50 mm，亲水制备柱固定相为10 μm酰胺柱（XAmide），流动相为体积分数5%正庚烷-乙醇溶液，进样体积为5mL，流速为60 mL/min。

实施例2 一种从枸杞叶中制备甜菜碱化学对照品的方法，包括以下步骤：

⑴水提取：

10.0 Kg枸杞叶阴干、粉碎后加入其质量10倍的分析纯水，在90℃下提取3次，每次1 h，过滤、合并滤液A，该滤液A经减压干燥至膏状，即得棕黑色固体状枸杞叶水提物。

其中：减压干燥的条件是指真空度为0.09 MPa，温度为50 ℃。

⑵硅胶柱富集：

将枸杞叶水提物经硅胶柱色谱分离后，用8倍柱体积的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，按每份2000 mL收集馏分，并经薄层色谱检测，其中展开剂为氯仿-甲醇-水混合溶剂，显色剂为碘蒸汽，合并Rf值为0.1~0.2的馏分；所述Rf值为0.1~0.2的馏分经减压干燥即得棕黄色粉末状的甜菜碱粗品294.0 g。

其中：

减压干燥的条件是指真空度为0.09 MPa，温度为50 ℃。

硅胶柱色谱的条件是指硅胶柱尺寸为80cm×100cm。

氯仿-甲醇-水混合溶剂是指将氯仿、甲醇、水按6：4：1体积比（mL/ mL）混合均匀而得。

⑶亲水液相制备色谱精制：

甜菜碱粗品用其质量2倍的体积分数为30%的乙醇溶液溶解，然后配制样品浓度为200.0 mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B，该滤液B经亲水液相制备色谱分离，经检测波长为200 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于99%的白色粉末状的对照品256.1 g，收率为87.1%。

其中：

减压干燥的条件是指真空度为0.09 MPa，温度为50 ℃。

亲水液相制备色谱分离的工作参数是指色谱柱柱长250 mm、直径100 mm，亲水制备柱固定相为10 μm两性离子柱（Click XIon），流动相为体积分数15%正己烷-乙醇溶液，进样体积为40mL，流速为265 mL/min。

实施例3 一种从枸杞叶中制备甜菜碱化学对照品的方法，包括以下步骤：

⑴水提取：

5.0 Kg枸杞叶阴干、粉碎后加入其质量7倍的分析纯水，在75℃下提取2次，每次3h，过滤、合并滤液A，该滤液A经减压干燥至膏状，即得棕黑色固体状枸杞叶水提物。

其中：减压干燥的条件是指真空度为0.08 MPa，温度为60 ℃。

⑵硅胶柱富集：

将枸杞叶水提物经硅胶柱色谱分离后，用10倍柱体积的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，按每份1000 mL收集馏分，并经薄层色谱检测，其中展开剂为氯仿-甲醇-水混合溶剂，显色剂为碘蒸汽，合并Rf值为0.1~0.2的馏分；所述Rf值为0.1~0.2的馏分经减压干燥即得棕黄色粉末状的甜菜碱粗品148.6 g。

其中：

减压干燥的条件是指真空度为0.08 MPa，温度为60 ℃。

硅胶柱色谱的条件是指硅胶柱尺寸为30cm×100cm。

氯仿-甲醇-水混合溶剂是指将氯仿、甲醇、水按7：3：0.5体积比（mL/ mL）混合均匀而得。

⑶亲水液相制备色谱精制：

甜菜碱粗品用其质量5倍的体积分数为50%的乙醇溶液溶解，然后配制样品浓度为100.0 mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B，该滤液B经亲水液相制备色谱分离，经检测波长为200 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于99%的白色粉末状的对照品131.1 g，收率为88.2%。

其中：

减压干燥的条件是指真空度为0.08 MPa，温度为60 ℃。

亲水液相制备色谱分离的工作参数是指色谱柱柱长250 mm、直径100 mm，亲水制备柱固定相为10 μm酰胺柱（XAmide），流动相为体积分数10%正庚烷-乙醇溶液，进样体积为40mL，流速为265 mL/min。

实施例4 一种从枸杞叶中制备甜菜碱化学对照品的方法，包括以下步骤：

⑴水提取：

100.0 g枸杞叶阴干、粉碎后加入其质量6倍的分析纯水，在80℃下提取3次，每次1h，过滤、合并滤液A，该滤液A经减压干燥至膏状，即得棕黑色固体状枸杞叶水提物。

其中：减压干燥的条件是指真空度为0.07 MPa，温度为55 ℃。

⑵硅胶柱富集：

将枸杞叶水提物经硅胶柱色谱分离后，用8倍柱体积的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，按每份1000 mL收集馏分，并经薄层色谱检测，其中展开剂为氯仿-甲醇-水混合溶剂，显色剂为碘蒸汽，合并Rf值为0.1~0.2的馏分；所述Rf值为0.1~0.2的馏分经减压干燥即得棕黄色粉末状的甜菜碱粗品3.5 g。

其中：

减压干燥的条件是指真空度为0.07 MPa，温度为55 ℃。

硅胶柱色谱的条件是指硅胶柱尺寸为80cm×100cm。

氯仿-甲醇-水混合溶剂是指将氯仿、甲醇、水按7：2.5：0.2体积比（mL/ mL）混合均匀而得。

⑶亲水液相制备色谱精制：

甜菜碱粗品用其质量2倍的体积分数为80%的乙醇溶液溶解，然后配制样品浓度为80.0 mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B，该滤液B经亲水液相制备色谱分离，经检测波长为200 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于99%的白色粉末状的对照品3.0 g，收率为85.7%。

其中：

减压干燥的条件是指真空度为0.07 MPa，温度为55 ℃。

亲水液相制备色谱分离的工作参数是指色谱柱柱长250 mm、直径20 mm，亲水制备柱固定相为10 μm两性离子柱（Click XIon），流动相为体积分数10%正己烷-乙醇溶液，进样体积为40mL，流速为15 mL/min。

实施例5 一种从枸杞叶中制备甜菜碱化学对照品的方法，包括以下步骤：

⑴水提取：

5.0 Kg枸杞叶阴干、粉碎后加入其质量5倍的分析纯水，在95℃下提取2次，每次3h，过滤、合并滤液A，该滤液A经减压干燥至膏状，即得棕黑色固体状枸杞叶水提物。

其中：减压干燥的条件是指真空度为0.06 MPa，温度为65 ℃。

⑵硅胶柱富集：

将枸杞叶水提物经硅胶柱色谱分离后，用15倍柱体积的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，按每份1500 mL收集馏分，并经薄层色谱检测，其中展开剂为氯仿-甲醇-水混合溶剂，显色剂为碘蒸汽，合并Rf值为0.1~0.2的馏分；所述Rf值为0.1~0.2的馏分经减压干燥即得棕黄色粉末状的甜菜碱粗品152.2 g。

其中：

减压干燥的条件是指真空度为0.06 MPa，温度为65 ℃。

硅胶柱色谱的条件是指硅胶柱尺寸为60cm×80cm。

氯仿-甲醇-水混合溶剂是指将氯仿、甲醇、水按7：3：0.5体积比（mL/ mL）混合均匀而得。

⑶亲水液相制备色谱精制：

甜菜碱粗品用其质量4倍的体积分数为40%的乙醇溶液溶解，然后配制样品浓度为150.0 mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B，该滤液B经亲水液相制备色谱分离，经检测波长为200 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于99%的白色粉末状的对照品134.9 g，收率为88.6%。

其中：

减压干燥的条件是指真空度为0.06 MPa，温度为65 ℃。

亲水液相制备色谱分离的工作参数是指色谱柱柱长250 mm、直径100 mm，亲水制备柱固定相为10 μm酰胺柱（XAmide），流动相为体积分数8%正庚烷-乙醇溶液，进样体积为20mL，流速为125 mL/min。

实施例6 一种从枸杞叶中制备甜菜碱化学对照品的方法，包括以下步骤：

⑴水提取：

100.0 Kg枸杞叶阴干、粉碎后加入其质量8倍的分析纯水，在70℃下提取3次，每次1 h，过滤、合并滤液A，该滤液A经减压干燥至膏状，即得棕黑色固体状枸杞叶水提物。

其中：减压干燥的条件是指真空度为0.07 MPa，温度为60 ℃。

⑵硅胶柱富集：

将枸杞叶水提物经硅胶柱色谱分离后，用16倍柱体积的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，按每份1000 mL收集馏分，并经薄层色谱检测，其中展开剂为氯仿-甲醇-水混合溶剂，显色剂为碘蒸汽，合并Rf值为0.1~0.2的馏分；所述Rf值为0.1~0.2的馏分经减压干燥即得棕黄色粉末状的甜菜碱粗品106.4 g。

其中：

减压干燥的条件是指真空度为0.07 MPa，温度为60 ℃。

硅胶柱色谱的条件是指硅胶柱尺寸为80cm×100cm。

氯仿-甲醇-水混合溶剂是指将氯仿、甲醇、水按7：2.5：0.2体积比（mL/ mL）混合均匀而得。

⑶亲水液相制备色谱精制：

甜菜碱粗品用其质量3倍的体积分数为80%的乙醇溶液溶解，然后配制样品浓度为140.0 mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B，该滤液B经亲水液相制备色谱分离，经检测波长为200 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于99%的白色粉末状的对照品91.6 g，收率为86.1%。

其中：

减压干燥的条件是指真空度为0.07 MPa，温度为60 ℃。

亲水液相制备色谱分离的工作参数是指色谱柱柱长250 mm、直径20 mm，亲水制备柱固定相为10 μm两性离子柱（Click XIon），流动相为体积分数12%正己烷-乙醇溶液，进样体积为30mL，流速为200 mL/min。

Claims (2)

1.一种从枸杞叶中制备甜菜碱化学对照品的方法，包括以下步骤：

⑴水提取：

枸杞叶阴干、粉碎后加入其质量4~10倍的分析纯水，在60~95℃下提取1~3次，每次1~3h，过滤、合并滤液A，该滤液A经减压干燥至膏状，即得棕黑色固体状枸杞叶水提物；

⑵硅胶柱富集：

将所述枸杞叶水提物经硅胶柱色谱分离后，用8~20倍柱体积的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，按每份1000~2000 mL收集馏分，并经薄层色谱检测，其中展开剂为氯仿-甲醇-水混合溶剂，显色剂为碘蒸汽，合并Rf值为0.1~0.2的馏分；所述Rf值为0.1~0.2的馏分经减压干燥即得棕黄色粉末状的甜菜碱粗品；所述硅胶柱色谱的条件是指硅胶柱尺寸为20~80cm×60~100cm；所述氯仿-甲醇-水混合溶剂是指将氯仿、甲醇、水按8：2：0.2~6：4：1体积比混合均匀而得；

⑶亲水液相制备色谱精制：

所述甜菜碱粗品用其质量2~5倍的体积分数为30%~100%的乙醇溶液溶解，然后配制样品浓度为80.0~200.0 mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B，该滤液B经亲水液相制备色谱分离，经检测波长为200 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于99%的白色粉末状的对照品；所述亲水液相制备色谱分离的工作参数是指色谱柱柱长250 mm、直径20~100 mm，亲水制备柱固定相为10 μm酰胺柱或两性离子柱，流动相为体积分数5~10%正庚烷-乙醇溶液或10~15%正己烷-乙醇溶液，进样体积为5~40mL，流速为15~265 mL/min。

2.如权利要求1所述的一种从枸杞叶中制备甜菜碱化学对照品的方法，其特征在于：所述步骤⑴、所述步骤⑵和所述步骤⑶中减压干燥的条件均是指真空度为0.06~0.09 MPa，温度为50~70 ℃。