CN114869951B - 一种枸杞叶生物碱提取物的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枸杞叶生物碱提取物的制备方法及应用，涉及医药技术领域。本发明制备方法包括以下步骤：(1)以干燥枸杞叶为原料，加入乙醇水溶液浸泡，加热回流提取，滤过后合并滤液，浓缩得到浸膏；(2)将步骤(1)所述浸膏加水均匀混悬，用乙酸乙酯进行萃取，合并水溶液，浓缩得到水部位浸膏；(3)将步骤(2)所述水部位浸膏进行强阳离子交换柱层析，先以乙醇水溶液洗脱，得到非生物碱部分，弃用；继续以磷酸二氢钾溶液洗脱，得到生物碱部分，浓缩得到生物碱粗组分；(4)将步骤(3)所述生物碱粗组分进行反相硅胶柱层析，以去离子水洗脱除盐后，继续以乙醇水溶液进行洗脱得到生物碱提取物。

Description

一种枸杞叶生物碱提取物的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，更具体的说是涉及涉及一种枸杞叶生物碱提取物的制备方法，以及其作为药品、保健品或功能性食品在失眠、焦虑及抑郁等精神疾病的预防和治疗中的应用。

背景技术

失眠作为生活中较为常见的病症之一，与人们的生活工作息息相关。失眠病症的产生与年龄、性别和疾病等多种因素相关，而且失眠的患病率随着年龄的增加而增加。近年来，社会就业压力增大，经济需求日益增长，人们的生活习惯也随之变化，在这种社会环境下失眠症的发病率越来越高。失眠不仅会导致患者出现焦躁不安、抑郁等情绪，也会导致各种疾病的发生。

目前，治疗失眠的药物主要还是镇静催眠类药物，但现有的镇静催眠药多为化学合成药，其不良反应较多，长期服用会产生依赖性。而中药治疗失眠疗效较好，不良反应较少，越来越受到广泛关注。因此，开发寻找天然治疗失眠的药物变得尤为重要。

枸杞叶包括有果枸杞叶和无果枸杞叶，有果枸杞叶是茄科枸杞属植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.和中华枸杞Lycium chinense Mill.的新鲜叶片。无果枸杞叶是野生枸杞与茄科枸杞属植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.种间杂交选育的枸杞新品种后，又通过人工驯化和培育成为不开花、不结果的无果枸杞的新鲜芽叶。枸杞叶具有抗氧化、降血糖、预防肿瘤、保护肝脏以及提高人体免疫功能等效用。有文献报道称枸杞芽水提物具有促进睡眠作用，但其改善睡眠的具体有效部位和和具体的作用机制并不清楚。目前还没有关于枸杞叶生物碱提取物药理活性的任何报道。

因此，提供一种枸杞叶生物碱提取物的制备方法及应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种枸杞叶生物碱提取物的制备方法及应用；

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种枸杞叶生物碱提取物在制备药品、保健品或功能性食品中的应用，所述药品为预防或治疗失眠、焦虑及抑郁的药品；所述保健品、功能性食品具有改善失眠、焦虑及抑郁的保健功效。

一种枸杞叶生物碱提取物的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)以干燥枸杞叶为原料，加入乙醇水溶液浸泡，加热回流提取，滤过后合并滤液，浓缩得到浸膏；

(2)将步骤(1)所述浸膏加水均匀混悬，用乙酸乙酯进行萃取，合并水溶液，浓缩得到水部位浸膏；

(3)将步骤(2)所述水部位浸膏用乙醇水溶液溶解，进行强阳离子交换柱层析，先以乙醇水溶液洗脱，得到非生物碱部分，弃用；继续以磷酸二氢钾溶液洗脱，得到生物碱部分，浓缩得到生物碱粗组分；

(4)将步骤(3)所述生物碱粗组分用乙醇水溶液溶解，进行反相硅胶柱层析，以去离子水洗脱除盐后，继续以乙醇水溶液进行洗脱得到生物碱提取物。

进一步的，在步骤(1)中：所述乙醇水溶液体积浓度为70～95％；

所述干燥枸杞叶与所述乙醇水溶液的比例为质量(g)：体积(mL)＝1：10～20；

所述浸泡时间为0.5～1h；所述加热回流提取次数为1～3次，温度为80～90℃，提取时间为1～3h；所述浓缩为减压蒸干浓缩。

进一步的，在步骤(2)中：所述浸膏、水、乙酸乙酯的比例为质量(g)：体积(mL)：体积(mL)＝1：1：1。

进一步的，在步骤(3)中：所述乙醇水溶液体积浓度为70～95％；所述磷酸二氢钾溶液浓度为0.1～1M，pH为2～4；所述浓缩为减压蒸干浓缩。

进一步的，在步骤(4)中：所述乙醇水溶液体积浓度为50～70％。

一种药品，包括所述枸杞叶生物碱提取物，所述枸杞叶生物碱提取物的日应用剂量为10～100mg/kg。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种枸杞叶生物碱提取物的制备方法及应用，首次证实枸杞叶生物碱提取物具有镇静催眠作用，试验动物给予10～100mg/kg的剂量范围内，枸杞叶生物碱提取物可显著减少失眠小鼠活动次数，缩短其睡眠潜伏期，延长其睡眠时间，同时能够显著回调失眠小鼠脑组织中的5-HT、5-HIAA、GABA等神经递质指标水平，降低Glu/GABA值；以上均证实了枸杞叶生物碱提取物能够用于失眠、焦虑及抑郁等精神疾病的预防和治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为枸杞叶生物碱提取物的制备流程。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

取干燥枸杞叶(2kg)，加入95％乙醇水溶液(40L)，料液比(质量g：体积mL＝1：20)，浸泡1小时，80℃加热回流提取，提取3次，1.5小时/次，趁热过滤，合并滤液，滤液减压蒸干得浸膏(484g)。

将浸膏加入料液比(质量g：体积mL＝1：1)的水(484mL)使之均匀混悬，用等体积乙酸乙酯(484mL)进行萃取，收集水部位，减压蒸干得水部位浸膏(180g)。

将水部位浸膏用95％乙醇水溶液溶解，继续进行强阳离子交换柱层析，用90％乙醇(3L)进行洗脱除去非生物碱部分后，继续以0.1M磷酸二氢钾溶液5L(30％乙醇水为溶剂溶解，再以磷酸调节pH至2.5)洗脱得到生物碱馏分，减压蒸干得到生物碱粗组分(122g)。

将生物碱粗组分用95％乙醇水溶液溶解，继续进行反相C18柱层析，用水进行洗脱除盐后，以60％乙醇进行洗脱得到生物碱提取物(43g)，提取率为2.2％。

实施例2

取干燥枸杞叶(2kg)，加入70％乙醇水溶液(20L)，料液比(质量g：体积mL＝1：10)，浸泡0.5小时，85℃加热回流提取，提取1次，3小时/次，趁热过滤，滤液减压蒸干得浸膏(380g)。

将浸膏加入料液比(质量g：体积mL＝1：2)的水(760mL)使之均匀混悬，用等体积乙酸乙酯(760mL)进行萃取，收集水部位，减压蒸干得水部位浸膏(136g)。

将水部位浸膏用70％乙醇水溶液溶解，继续进行强阳离子交换柱层析，用70％乙醇(2.5L)进行洗脱除去非生物碱部分后，继续以1M磷酸二氢钾溶液3L(20％乙醇水为溶剂溶解，再以磷酸调节pH至2)洗脱得到生物碱馏分，减压蒸干得到生物碱粗组分(571g)。

将生物碱粗组分用70％乙醇水溶液溶解，继续进行反相C18柱层析，用水进行洗脱除盐后，以40％乙醇进行洗脱得到生物碱提取物(20g)，提取率为1.0％。

实施例3

取干燥枸杞叶(2kg)，加入90％乙醇水溶液(40L)，料液比(质量g：体积mL＝1：20)，浸泡1小时，90℃加热回流提取，提取2次，1小时/次，趁热过滤，合并滤液，滤液减压蒸干得浸膏(405g)。

将浸膏加入料液比(质量g：体积mL＝1：1)的水(405mL)使之均匀混悬，用等体积乙酸乙酯(405mL)进行萃取，收集水部位，减压蒸干得水部位浸膏(142g)。

将水部位浸膏用90％乙醇水溶液溶解，继续进行强阳离子交换柱层析，用80％乙醇(2.5L)进行洗脱除去非生物碱部分后，继续以0.5M磷酸二氢钾溶液4L(40％乙醇水为溶剂溶解，再以磷酸调节pH至4)洗脱得到生物碱馏分，减压蒸干得到生物碱粗组分(322g)。

将生物碱粗组分用90％乙醇水溶液溶解，继续进行反相C18柱层析，用水进行洗脱除盐后，以60％乙醇进行洗脱得到生物碱提取物(49g)，提取率为2.5％。

本发明的枸杞叶生物碱提取物的技术效果为：

动物实验设计

采用注射对氯苯丙氨酸(PCPA)致小鼠失眠模型对枸杞叶生物碱提取物进行改善睡眠作用药效学评价。通过小鼠自主活动次数记录、体重记录、戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验等评价方法，观察枸杞叶生物碱提取物对失眠小鼠的镇静催眠作用。取脑组织测定单胺类神经递质5-HT、5-HIAA水平和氨基酸类神经递质GABA、谷氨酸Glu水平，探讨枸杞叶生物碱提取物改善睡眠作用的可能机制。

实验过程

1、取健康的SPF级雄性ICR小鼠(18～22g)，由宁夏医科大学动物实验中心提供(实验动物许可证编号SCXK(宁夏医科大学)2020-0001)。适应性饲养于SPF级标准实验室，各组动物饲养条件相同：环境温度(25℃)、相对湿度(50％～60％)。自由进食、进水。

2、实验方法：ICR小鼠在接受造模前适应性喂养3天，在接受造模前一天随机分为正常对照组、模型组、阳性药组、枸杞叶生物碱提取物组(低剂量组1mg/kg/d、中剂量组10mg/kg/d、高剂量组100mg/kg/d)共6组，每组10只。其中枸杞叶生物碱提取物组使用实施例2制备的枸杞叶生物碱提取物。

在适应性喂养并分组后，连续造模2天，正常对照组给予生理盐水(0.1mL/10g/d)，其余各组腹腔注射PCPA混悬液(400mg/kg/d)。注射后28～30h内，白天持续活动，进食减少，攻击性增强，表明造模成功。

造模成功之后，正常对照组和模型组给予等体积生理盐水(0.1mL/10g/d)，阳性药组给药剂量为褪黑素10mg/kg/d，枸杞叶生物碱提取物给药剂量分别为1、10和100mg/kg/d。各组小鼠均在每日上午8:00～12:00依次给药，连续给药7天。

3、观察指标

(1)自主活动次数：按照上述分组后，分别在造模成功后和第7天给药后半个小时，记录小鼠在5min内的自主活动次数。每次记录前，先将小鼠放进设备中适应3min。

(2)体重：分别在造模前、造模后、给药第3天、给药第7天，记录每组小鼠体重，观察小鼠体重变化。

(3)翻正反射实验测定睡眠时间：在第7天给药后1h，每组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠混悬液(50mg/kg)，记录小鼠睡眠潜伏期和睡眠时间。(从腹腔注射结束到小鼠翻正反射消失1min以上开始记录睡眠潜伏期；从小鼠入睡到小鼠翻正反射恢复记为睡眠时间。)

4、神经递质水平测定

给药7天后，小鼠颈椎脱臼处死，在冰台上断头取脑，用组织匀浆器研磨均匀，加入生理盐水制成10％脑组织匀浆液。于4℃条件下3000r/min离心15min，收集上清液，采用ELISA法检测上清液中单胺类神经递质5-HT、5-HIAA水平和氨基酸类神经递质水平Glu、GABA水平。

5、数据处理

采用SPSS 18.0进行数据分析和统计，所得结果均以均值±标准差(X±S)表示，组间差异性比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行数据处理，差异性具有统计学意义以p<0.05作为标准。

结果表明：

1、对小鼠自主活动次数的影响

枸杞叶生物碱提取物对小鼠自主活动次数的影响结果见表1所示。

表1枸杞叶生物碱提取物对小鼠自主活动实验的影响

注：#表示给药前模型组与正常对照组比较，^###P<0.001；*表示末次给药后与对应给药前比较，^***P<0.001。

给药前，与正常对照组比较，PCPA致失眠组小鼠自主活动次数显著增加(p<0.001)。末次给药后，与给药前比较，正常对照组和模型组小鼠自主活动次数无明显变化，阳性药组和枸杞叶生物碱提取物高中低剂量组小鼠自主活动次数均显著降低(p<0.001)。

2、对小鼠体重的影响

枸杞叶生物碱提取物对小鼠体重的影响结果见表2所示。

表2枸杞叶生物碱提取物对小鼠体重的影响

注：与造模前比较，^##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01，***P<0.01。

造模后与造模前比较，随着实验的进行正常对照组小鼠体重逐渐增加(p<0.01)，而造模组小鼠体重基本无变化，无统计学差异。给药第3天，与正常对照组比较，模型组小鼠体重显著降低(p<0.001)；与模型组比较，阳性药组和枸杞叶生物碱提取物各剂量组小鼠体重均显著增加(p<0.01)。给药第7天，与正常对照组比较，模型组小鼠体重有一点程度的降低，但不具有统计学意义；与模型组比较，阳性药组和枸杞叶生物碱提取物高低剂量组小鼠体重均显著增加(p<0.01)。

3、对小鼠睡眠潜伏期和睡眠时间的影响

枸杞叶生物碱提取物对小鼠睡眠潜伏期和睡眠时间的影响结果见表3所示。

表3枸杞叶生物碱提取物对小鼠睡眠潜伏期和睡眠时间的影响

注：与正常对照组比较，^#P<0.01,^###P<0.001；与模型组比较，^**P<0.01，^***P<0.001。

结果显示，在睡眠潜伏时间指标水平方面，与正常对照组比较，模型组小鼠睡眠潜伏时间显著增加(p<0.001)，表明PCPA致小鼠失眠模型成功，使小鼠出现入睡困难现象。与模型组比较，阳性药和枸杞叶生物碱提取物各剂量组小鼠睡眠潜伏时间均显著缩短(p<0.001)，表明阳性药褪黑素和枸杞叶生物碱提取物均可以调节小鼠睡眠潜伏时间，对于PCPA致小鼠失眠具有改善作用。在睡眠时间指标水平方面，与正常对照组比较，模型组小鼠睡眠时间显著缩短(p＜0.05)，表明PCPA致小鼠失眠模型成功，使小鼠睡眠时间缩短。与模型组比较，阳性药和枸杞叶生物碱提取物各剂量组小鼠睡眠时间均显著增加(p＜0.01)，表明阳性药褪黑素和枸杞叶生物碱提取物均可以增加小鼠睡眠时间，对于PCPA致小鼠失眠具有改善作用。

综上，小鼠失眠后出现白天持续活动、进食和睡眠减少等现象，导致自主活动次数增多(p<0.001)、睡眠潜伏期延长(p<0.001)、睡眠时间缩短(p<0.05)，小鼠体重增长速率下降。枸杞叶生物碱提取物不同剂量组均能不同程度的降低失眠小鼠自主活动次数，缩短睡眠潜伏期，增加睡眠时间，改善PCPA致失眠小鼠体重增长速率下降。以上数据说明枸杞叶生物碱提取物具有显著的镇静催眠作用。

4、对小鼠单胺类神经递质水平的影响

枸杞叶生物碱提取物对单胺类神经递质水平的影响结果见表4所示。

表4枸杞叶生物碱提取物对小鼠单胺类神经递质的影响

注：与正常对照组组比较，^###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

与正常对照组比较，模型组小鼠脑组织中5-HT含量显著降低(p＜0.001)，表明PCPA致失眠小鼠模型成功。与模型组比较，阳性药组和枸杞叶生物碱提取物高低剂量组小鼠脑组织中5-HT含量均显著增加(p＜0.05)。同时，与正常对照组比较，模型组小鼠脑组织中5-HIAA含量显著降低(p＜0.001)，表明PCPA致失眠小鼠模型成功。与模型组比较，阳性药组和枸杞叶生物碱提取物高低剂量组小鼠脑组织中5-HIAA含量显著增加(p＜0.01)。

综上，小鼠失眠后，脑组织中5-HT和5-HIAA含量降低(p＜0.05)。枸杞叶生物碱提取物高低剂量组均能够不同程度的增加5-HT和5-HIAA的含量，推测枸杞叶生物碱提取物可能直接通过增加失眠小鼠脑组织中5-HT和5-HIAA的含量来改善睡眠。

5、对小鼠氨基酸类神经递质水平的影响

枸杞叶生物碱提取物对氨基酸类神经递质水平的影响结果见表5所示。

表5枸杞叶生物碱提取物对小鼠氨基酸类神经递质的影响

注：与正常对照组组比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

与正常对照组比较，模型组小鼠脑组织中GABA含量显著降低(p＜0.01)，表明PCPA致失眠小鼠脑组织中GABA含量降低。与模型组比较，阳性药组小鼠脑组织中GABA含量增加，但无统计学意义。枸杞叶生物碱提取物各剂量组小鼠脑组织中GABA含量均显著增加(p＜0.001)。与正常对照组比较，模型组小鼠脑组织中Glu含量显著增加(p＜0.05)，表明PCPA致失眠小鼠脑组织中Glu含量增加。与模型组比较，阳性药组小鼠脑组织中Glu含量显著降低(p＜0.001)，枸杞叶生物碱提取物各剂量组小鼠脑组织中Glu含量显明显变化。与正常对照组比较，模型组小鼠脑组织中Glu/GABA值显著增大(p＜0.01)。与模型组比较，阳性药组和枸杞叶生物碱提取物各剂量组小鼠脑组织中Glu/GABA值显著降低(p＜0.05)。

综上，小鼠失眠后，脑组织中GABA含量降低(p＜0.01)，Glu含量和Glu/GABA值增加(p＜0.05)。枸杞叶生物碱提取物高剂量能够显著增加失眠小鼠脑组织中GABA的含量，降低Glu/GABA值。推测枸杞叶生物碱提取物可能通过增加GABA含量，降低Glu/GABA值来改善睡眠。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (1)

1.一种枸杞叶生物碱提取物在制备药品中的应用，其特征在于，所述药品为预防或治疗失眠、焦虑及抑郁的药品；

所述枸杞叶生物碱提取物的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）以干燥枸杞叶为原料，加入乙醇水溶液浸泡，加热回流提取，滤过后合并滤液，浓缩得到浸膏；所述乙醇水溶液体积浓度为70~95%；所述干燥枸杞叶与所述乙醇水溶液的比例为质量：体积=1：10~20；所述浸泡时间为0.5~1h；所述加热回流提取次数为1~3次，温度为80~90℃，提取时间为1~3h；所述浓缩为减压蒸干浓缩；

（2）将步骤（1）所述浸膏加水均匀混悬，用乙酸乙酯进行萃取，合并水溶液，浓缩得到水部位浸膏；所述浸膏、水、乙酸乙酯的比例为质量：体积：体积=1：1：1；

（3）将步骤（2）所述水部位浸膏用乙醇水溶液溶解，进行强阳离子交换柱层析，先以乙醇水溶液洗脱，得到非生物碱部分，弃用；继续以磷酸二氢钾溶液洗脱，得到生物碱部分，浓缩得到生物碱粗组分；所述乙醇水溶液体积浓度为70~95%；所述磷酸二氢钾溶液浓度为0.1~1M，pH为2~4；所述浓缩为减压蒸干浓缩；

（4）将步骤（3）所述生物碱粗组分用乙醇水溶液溶解，进行反相C18硅胶柱层析，以去离子水洗脱除盐后，继续以乙醇水溶液进行洗脱得到生物碱提取物；

所述乙醇水溶液体积浓度为50~70%；

所述质量单位为g，所述体积单位为mL。