CN113559130A - 一种酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物及其制备方法和应用，属于发酵工程技术领域，包括以下步骤：1)制备枯草芽孢杆菌种子液培养基；2)培养枯草芽孢杆菌种子液；3)取酸枣仁粉末置于摇瓶中，加入蒸馏水，混匀，灭菌，制得酸枣仁培养基；4)将枯草芽孢杆菌种子液按照酸枣仁培养基质量的2‑10％接种于酸枣仁培养基中，放入摇床中，发酵18‑20h；5)将发酵产物冷冻干燥，粉碎过筛，即得酸枣仁‑枯草芽孢杆菌共发酵产物。本发明酸枣仁‑枯草芽孢杆菌共发酵产物提取物具有改善睡眠的功效。酸枣仁‑枯草芽孢杆菌共发酵产物可制备成用于治疗失眠的药品、改善睡眠的保健食品或功能性食品。

Description

一种酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物及其制备方法和应用。
背景技术
随着社会化进程的加速，人们面对的各种压力越来越大，接受的外界刺激越来越多，由此引发的失眠和抑郁症逐年上升。睡眠受中枢神经系统的主动调节，与中枢神经递质的作用密切相关。人类睡眠相关的神经递质主要有γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，GABA)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)等。GABA系统广泛分布于大脑和小脑，参与睡眠-觉醒周期的调节，是抑制性递质系统。5-HT递质系统位于大脑的特定部位，尤其是大脑边缘系统，参与情绪、行为、记忆等多种生理功能的调控。5-HT是褪黑激素的前体物质，可阻止或缩短REM睡眠(快速眼球运动(rapideyemovement，REM)睡眠)，增加慢波睡眠；GABA可延长NREM睡眠(非快速眼球运动(nonrapideyemovement，NREM)睡眠)，Ach能激发REM睡眠。而目前大多数用于治疗失眠的药物以GABA(A)受体为靶点，如苯二氮卓类药物、巴比妥类药物等。但是这些药物往往导致药物耐受、成瘾等不良反应，须按照《麻醉药品和精神药品管理条例》进行严格管控。
5-羟色胺可参与控制情绪、焦虑，调节睡眠、痛觉等。多种心理性因素引起脑内5-羟色胺含量降低，从而导致抑郁、焦虑等常见的心境障碍。当大脑5-羟色胺含量减少时可出现睡眠障碍，抑郁症状，注意力不集中，记忆力下降，自责和内疚，以及焦虑症状，并经常紧张、不安、心烦、易怒、恐惧、多虑等，因此，失眠往往是焦虑抑郁的表现症状。在西医治疗方面，对于抑郁症和失眠的治疗往往没有结合治疗，单纯针对失眠或者抑郁症治疗，只能是治标不治本。
酸枣仁的主要功效是养心安神和敛汗。相比于西药当中的安眠药，服用酸枣仁改善睡眠，既不会成瘾，也不会有依赖性。现在用的一般属于炒酸枣仁，炒酸枣仁相比于生酸枣仁，在熬中药的时候，能更好的煎煮出有效成分。酸枣仁既可以和其它的安神药合用，也可以单独使用。
专利CN109380723A公开了一种安神助眠食品及其制备方法，属于保健食品技术领域；原料包括：沙棘籽、酸枣仁、啤酒花、茯苓、桑葚、乳清酸镁、菌粉；将啤酒花有机提取物浸膏中加入茯苓后与沙棘籽和酸枣仁的有机提取物混合，加入桑葚和乳清酸镁，再次混合后加入菌粉进行发酵3-5d后干燥得到成品。但是，该食品原料昂贵，制作方法较复杂，同时得到的产品的助眠效果并不十分理想。
发明内容
本发明的目的在于提出一种酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物及其制备方法和应用，酸枣仁-枯草芽孢杆菌共发酵产物提取物具有改善睡眠的功效，酸枣仁-枯草芽孢杆菌共发酵产物可制备成用于治疗失眠的药品、改善睡眠的保健食品或功能性食品。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物的制备方法，包括以下步骤：
1)制备枯草芽孢杆菌种子液培养基；
2)培养枯草芽孢杆菌种子液；
3)取酸枣仁粉末置于摇瓶中，加入蒸馏水，混匀，灭菌，制得酸枣仁培养基；
4)将枯草芽孢杆菌种子液按照酸枣仁培养基质量的2-10％接种于酸枣仁培养基中，放入摇床中，于培养温度22-34℃，摇床转速120-240rpm，发酵18-20h；
5)将发酵产物冷冻干燥，粉碎过筛，即得酸枣仁-枯草芽孢杆菌共发酵产物。
作为本发明的进一步改进，步骤1)中所述枯草芽孢杆菌种子液培养基的制备方法如下：取蛋白胨10-20g，葡萄糖5-10g，黄豆酶解物2-5g，磷酸二氢钾0.5-1g，氯化钠3-7g，加水至1000mL，pH调至7.0-7.2，110-130℃灭菌10-20min，制得，备用。
作为本发明的进一步改进，所述黄豆酶解物由以下方法制备而成：
S1.将黄豆洗净、干燥、粉碎后，得到黄豆粉；
S2.将黄豆粉加入无菌水中，加入2-4wt％菠萝蛋白酶和1-3wt％木瓜蛋白酶进行酶解，35-40℃反应3-5h后，110-120℃灭酶5-10min，冷冻干燥，得到黄豆酶解物。
作为本发明的进一步改进，所述菠萝蛋白酶的酶活力为1000-1200U/g，所述木瓜蛋白酶的酶活力为700-1000U/g。
作为本发明的进一步改进，步骤2)中所述枯草芽孢杆菌种子液的培养条件如下：在温度为35-37℃，pH值为7.0-7.2条件下，振荡培养2-4h。
作为本发明的进一步改进，所述枯草芽孢杆菌种子液的含菌量为108cfu/mL。
作为本发明的进一步改进，步骤3)中所述酸枣仁粉末与蒸馏水的固液比为1：(5-10)g/mL，优选地，为1:7g/mL。
作为本发明的进一步改进，将酸枣仁-枯草芽孢杆菌共发酵产物加工成共发酵提取物,具体方法为：将酸枣仁-枯草芽孢杆菌共发酵产物按固液比1：(5-10)g/mL溶于蒸馏水中，经过离心、过滤，冷冻干燥，得到共发酵提取物。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物。
本发明进一步保护一种上述酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物在制备提高睡眠质量的食品、保健食品以及药品中的应用。
本发明具有如下有益效果：酸枣仁-枯草芽孢杆菌共发酵产物提取物具有改善睡眠的功效。酸枣仁-枯草芽孢杆菌共发酵产物可制备成用于治疗失眠的药品、改善睡眠的保健食品或功能性食品。
当人类深度睡眠时，GABA含量会升高，本发明酸枣仁-枯草芽孢杆菌共发酵产物及其提取物食用后，明显提高体内GABA含量，使得人体较易入眠深睡眠。进一步，本发明酸枣仁经过微生物的发酵后，产生的发酵产物食用后使得人体的5-羟色胺的含量也明显提高，可以明显降低睡眠障碍和抑郁症状，以及焦虑症状，在缓解了失眠症状的前提下，起到抗抑郁的效果，从根本上改善上述睡眠障碍、抑郁症和焦虑症状，所以，本产品对于失眠人群具有显著的改善和治疗作用。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物的制备方法，包括以下步骤：
1)制备枯草芽孢杆菌种子液培养基；
枯草芽孢杆菌种子液培养基的制备方法如下：取蛋白胨10g，葡萄糖5g，黄豆酶解物2g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钠3g，加水至1000mL，pH调至7.0，110℃灭菌10min，制得，备用。
黄豆酶解物由以下方法制备而成：
S1.将黄豆洗净、干燥、粉碎后，得到黄豆粉；
S2.将黄豆粉加入无菌水中，加入2wt％菠萝蛋白酶(酶活力为1000U/g)和1wt％木瓜蛋白酶(酶活力为700U/g)进行酶解，35℃反应3h后，110℃灭酶5min，冷冻干燥，得到黄豆酶解物。
2)在温度为35℃，pH值为7.0条件下，振荡培养2h，得到枯草芽孢杆菌种子液，含菌量为108cfu/mL；
3)取10g酸枣仁粉末置于摇瓶中，加入50mL蒸馏水，混匀，121℃灭菌5min，制得酸枣仁培养基；
4)将枯草芽孢杆菌种子液按照酸枣仁培养基质量的2％接种于酸枣仁培养基中，放入摇床中，于培养温度22℃，摇床转速120rpm，发酵18h；
5)将发酵产物经过离心、过滤，冷冻干燥，粉碎过筛，即得酸枣仁-枯草芽孢杆菌共发酵产物。
实施例2
本实施例提供一种酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物的制备方法，包括以下步骤：
2)制备枯草芽孢杆菌种子液培养基；
枯草芽孢杆菌种子液培养基的制备方法如下：取蛋白胨20g，葡萄糖10g，黄豆酶解物5g，磷酸二氢钾1g，氯化钠7g，加水至1000mL，pH调至7.2，130℃灭菌20min，制得，备用。
黄豆酶解物由以下方法制备而成：
S1.将黄豆洗净、干燥、粉碎后，得到黄豆粉；
S2.将黄豆粉加入无菌水中，加入4wt％菠萝蛋白酶(酶活力为1200U/g)和3wt％木瓜蛋白酶(酶活力为1000U/g)进行酶解，40℃反应5h后，120℃灭酶10min，冷冻干燥，得到黄豆酶解物。
2)在温度为37℃，pH值为7.2条件下，振荡培养4h，得到枯草芽孢杆菌种子液，含菌量为108cfu/mL；
3)取10g酸枣仁粉末置于摇瓶中，加入100mL蒸馏水，混匀，121℃灭菌5min，制得酸枣仁培养基；
4)将枯草芽孢杆菌种子液按照酸枣仁培养基质量的10％接种于酸枣仁培养基中，放入摇床中，于培养温度34℃，摇床转速240rpm，发酵20h；
5)将发酵产物经过离心、过滤，冷冻干燥，粉碎过筛，即得酸枣仁-枯草芽孢杆菌共发酵产物。
实施例3
本实施例提供一种酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物的制备方法，包括以下步骤：
3)制备枯草芽孢杆菌种子液培养基；
枯草芽孢杆菌种子液培养基的制备方法如下：取蛋白胨15g，葡萄糖7g，黄豆酶解物3.5g，磷酸二氢钾0.7g，氯化钠5g，加水至1000mL，pH调至7.1，121℃灭菌15min，制得，备用。
黄豆酶解物由以下方法制备而成：
S1.将黄豆洗净、干燥、粉碎后，得到黄豆粉；
S2.将黄豆粉加入无菌水中，加入3wt％菠萝蛋白酶(酶活力为1000U/g)和2wt％木瓜蛋白酶(酶活力为1000U/g)进行酶解，37℃反应4h后，115℃灭酶7min，冷冻干燥，得到黄豆酶解物。
2)在温度为36℃，pH值为7.1条件下，振荡培养3h，得到枯草芽孢杆菌种子液，含菌量为108cfu/mL；
3)取10g酸枣仁粉末置于摇瓶中，加入75mL蒸馏水，混匀，121℃灭菌5min，制得酸枣仁培养基；
4)将枯草芽孢杆菌种子液按照酸枣仁培养基质量的5％接种于酸枣仁培养基中，放入摇床中，于培养温度32℃，摇床转速200rpm，发酵19h；
5)将发酵产物经过离心、过滤，冷冻干燥，粉碎过筛，即得酸枣仁-枯草芽孢杆菌共发酵产物。
对比例1
与实施例3相比，枯草芽孢杆菌种子液培养基中未添加黄豆酶解物，其他条件均不改变。
枯草芽孢杆菌种子液培养基的制备方法如下：取蛋白胨18.5g，葡萄糖7g，磷酸二氢钾0.7g，氯化钠5g，加水至1000mL，pH调至7.1，121℃灭菌15min，制得，备用。
对比例2
与实施例3相比，黄豆酶解物制备中未添加菠萝蛋白酶，其他条件均不改变。
黄豆酶解物由以下方法制备而成：
S1.将黄豆洗净、干燥、粉碎后，得到黄豆粉；
S2.将黄豆粉加入无菌水中，加入5wt％木瓜蛋白酶(酶活力为1000U/g)进行酶解，37℃反应4h后，115℃灭酶7min，冷冻干燥，得到黄豆酶解物。
对比例3
与实施例3相比，黄豆酶解物制备中未添加木瓜蛋白酶，其他条件均不改变。
黄豆酶解物由以下方法制备而成：
S1.将黄豆洗净、干燥、粉碎后，得到黄豆粉；
S2.将黄豆粉加入无菌水中，加入3wt％菠萝蛋白酶(酶活力为1000U/g)和2wt％木瓜蛋白酶(酶活力为1000U/g)进行酶解，37℃反应4h后，115℃灭酶7min，冷冻干燥，得到黄豆酶解物。
对比例4
与实施例3相比，酸枣仁由等量葡萄糖替代，其他条件均不改变。
测试例1
1.材料
1.1动物
SPF小鼠，昆明种，体重20-22g，雌雄各半，武汉疾病预防控制中心，饲养室温度为(25.0±0.5)℃，采用全价营养颗粒鼠饲料，动物自由取食、饮水。
1.2药物
实施例3和对比例1-4制得的酸枣仁-枯草芽孢杆菌共发酵产物，艾司唑仑片，常州四药制药有限公司，批号20180912，戊巴比妥钠(山东西亚化学股份有限公司，批号F085。
2.分组与给药
将70只小鼠随机分为7组，分别为对照组、实施例3组、对比例1-4组、及阳性对照艾司唑仑组，每组10只，雌雄各半。对照组小鼠每只小鼠灌胃给予生理盐水0.4mL，实施例3组和对比例1-4组小鼠灌胃给予溶于生理盐水的酸枣仁-枯草芽孢杆菌共发酵产物1g/kg，艾司唑仑组小鼠ig给予2mg/kg的艾司唑仑，连续给药20d。
3.指标测定
各组小鼠分别在第7、20天给药30-40min后灌胃最大阈下剂量戊巴比妥钠(35mg/kg)，测定睡眠发生率(以翻正反射消失为进入睡眠)；分别在第8天给药30-40min后及第21天灌胃最小阈上剂量戊巴比妥钠(50mg/kg)，检测小鼠睡眠潜伏期(从注射戊巴比妥钠到小鼠翻正反射消失的时间段)和睡眠时长(翻正反射消失到翻正反射恢复的时间段)。
4.数据处理
采用SPASS10对数据进行分析，数据以X±s表示。组间比较方法采用T检验，P＜0.05具有统计学意义。
5.结果
结果见表1。
表1
Figure BDA0003187848500000101
注：*与对照组比较，P＜0.05。
由表可知，与对照组比较，连续给药7d后实施例3组小鼠睡眠发生率提高，睡眠潜伏期显著缩短，睡眠时长增加；连续给药20d后，天麻组小鼠睡眠发生率较给药7d增加，睡眠潜伏期进一步缩短，睡眠时长增加(P＜0.05)。可见，本发明实施例3制得的天麻中的酸枣仁-枯草芽孢杆菌共发酵产物有效成分发挥稳定的促进睡眠的效果，随着时间的推移逐步增强。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备枯草芽孢杆菌种子液培养基；
2)培养枯草芽孢杆菌种子液；
3)取酸枣仁粉末置于摇瓶中，加入蒸馏水，混匀，灭菌，制得酸枣仁培养基；
4)将枯草芽孢杆菌种子液按照酸枣仁培养基质量的2-10％接种于酸枣仁培养基中，放入摇床中，于培养温度22-34℃，摇床转速120-240rpm，发酵18-20h；
5)将发酵产物冷冻干燥，粉碎过筛，即得酸枣仁-枯草芽孢杆菌共发酵产物。
2.根据权利要求1所述酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述枯草芽孢杆菌种子液培养基的制备方法如下：取蛋白胨10-20g，葡萄糖5-10g，黄豆酶解物2-5g，磷酸二氢钾0.5-1g，氯化钠3-7g，加水至1000mL，pH调至7.0-7.2，110-130℃灭菌10-20min，制得，备用。
3.根据权利要求2所述酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物的制备方法，其特征在于，所述黄豆酶解物由以下方法制备而成：
S1.将黄豆洗净、干燥、粉碎后，得到黄豆粉；
S2.将黄豆粉加入无菌水中，加入2-4wt％菠萝蛋白酶和1-3wt％木瓜蛋白酶进行酶解，35-40℃反应3-5h后，110-120℃灭酶5-10min，冷冻干燥，得到黄豆酶解物。
4.根据权利要求3所述酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物的制备方法，其特征在于，所述菠萝蛋白酶的酶活力为1000-1200U/g，所述木瓜蛋白酶的酶活力为700-1000U/g。
5.根据权利要求1所述酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述枯草芽孢杆菌种子液的培养条件如下：在温度为35-37℃，pH值为7.0-7.2条件下，振荡培养2-4h。
6.根据权利要求1所述酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌种子液的含菌量为108cfu/mL。
7.根据权利要求1所述酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述酸枣仁粉末与蒸馏水的固液比为1：(5-10)g/mL，优选地，为1:7g/mL。
8.根据权利要求1所述酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物的制备方法，其特征在于，将酸枣仁-枯草芽孢杆菌共发酵产物加工成共发酵提取物,具体方法为：将酸枣仁-枯草芽孢杆菌共发酵产物按固液比1：(5-10)g/mL溶于蒸馏水中，经过离心、过滤，冷冻干燥，得到共发酵提取物。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物。
10.一种如权利要求9所述酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物在制备提高睡眠质量的食品、保健食品以及药品中的应用。
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