CN110538268A

CN110538268A - 一种含有枯草芽孢杆菌的助眠组合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110538268A
Application number: CN201910600596.1A
Authority: CN
Inventors: 王业富; 胡坤坤; 胡定邦; 范宇鹏; 李靖
Original assignee: Hubei Zhen Fu Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Hubei Zhen Fu Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-07-04
Filing date: 2019-07-04
Publication date: 2019-12-06

Abstract

本发明提供了一种含有枯草芽孢杆菌的助眠组合物及其制备方法和应用，所述助眠组合物按质量百分比包括以下组分：枯草芽孢杆菌50％～60％、黄精5％～8％、五味子25％～30％和丹参10％～15％；所述助眠组合物的百分比之和不超过100％。本发明的助眠组合物将益生菌与中药成分相组合，以筛选得到的枯草芽孢杆菌为主要成分，与黄精、五味子和丹参按特定比例相互协同，具有明显的助眠效果，显著提高了小鼠的入睡率，配方简洁，无毒副作用，具有广阔的应用前景。

Description

一种含有枯草芽孢杆菌的助眠组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，涉及一种含有枯草芽孢杆菌的助眠组合物及其制备方法和应用。

背景技术

失眠是临床最为常见的睡眠障碍类型，长期失眠对于人的正常生活和工作会产生严重的负面影响，甚至会导致恶性意外事故的发生。从中医角度，失眠主要是因为邪扰心神或者心神失养而导致阳不交阴或神不守舍。另有理论认为，失眠病机多为湿食生痰，郁痰生热而扰动心神所致。

临床上常用的治疗失眠的西药，主要有苯二氮类，如安定、硝基安定，巴比妥类，如苯巴比妥、司可巴比妥，二苯甲烷类，如安泰乐，其他类，如唑吡坦、三唑仑、唑吡酮等。西药虽然疗效确切，见效快，但也存在诸多问题：首先，服用西药容易产生依赖性和耐药性，过量或长期服用容易造成不良后果；其次，西药一般为抗生素类药物，毒性较强，长期服用会影响肝肾功能，甚至会导致脏器功能紊乱、失调，表现出恶心、食欲减退、腹胀、便秘、口干、口苦、头晕、眼花等不适症状。

临床上常用的治疗失眠的中成药，如天王补心丹、牛黄清心丸、同仁柏子养心丸、安神补心丸、朱砂安神丸等，一般是针对特定类型的失眠，比如天王补心丹针对的是阴虚血少的失眠，而牛黄清心丸针对的是心火旺盛的失眠。但是，许多睡眠障碍的人难以被确定为上述特定类型。另外，中药改善睡眠质量不明显，效果较缓慢。

为了减低药物的不良反应，许多有睡眠障碍的人选择保健品期待予以替代药物，但是很难达到良好的效果。

CN103393725A公开了枯草芽孢杆菌杆菌BS01在改善睡眠中的应用，但是所述枯草芽孢杆菌需要与玉米淀粉、微晶纤维素、甘露醇、柠檬酸、麦芽糊精、低聚果糖和甜味素等7种成分组合发挥作用。

CN103361290A公开了枯草芽孢杆菌BS01与灵芝孢子粉的组合物在改善睡眠中的应用，所述药物包括枯草芽孢杆菌、灵芝孢子粉、玉米淀粉、微晶纤维素、甘露醇、柠檬酸、麦芽糊精、低聚果糖和甜味素共9种成分。

以上的药物虽然具有改善睡眠的作用，但是成分众多较为复杂，容易引起过敏等副作用的发生。

基于此，有必要提供一种安全性高、无毒副作用、疗效显著、成分简单的助眠组合物，改善失眠人群的睡眠问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种含有枯草芽孢杆菌的助眠组合物及其制备方法和应用，所述助眠组合物以筛选得到的枯草芽孢杆菌 Subtilisin-QK为主要成分，辅以中药成分，能够显著改善小鼠睡眠。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种含有枯草芽孢杆菌的助眠组合物，所述助眠组合物按质量百分比包括以下组分：

枯草芽孢杆菌 50％～60％

黄精 5％～8％

五味子 25％～30％

丹参 10％～15％；

所述助眠组合物的百分比之和不超过100％。

本发明中的各组分的功效如下：

枯草芽孢杆菌Subtilisin-QK通过分泌蛋白酶、α-淀粉酶等酶类，在消化道内同人体消化酶共同作用，进一步将黄精、五味子和丹参中的化合物分解为小分子化合物，促进人体的吸收；同时，在枯草芽孢杆菌培养基中添加部分的黄精、五味子和丹参能够促进枯草芽孢杆菌Subtilisin-QK的生长，枯草芽孢杆菌和黄精、五味子和丹参能够起到互相促进的功效。

黄精味甘、性平，归脾、肺、肾经，根状茎含甾体皂甙，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾之功效，常用于治疗脾胃气虚、体倦乏力、胃阴不足、口干食少、肺虚燥咳、劳嗽咳血、精血不足、腰膝酸软、须发早白、内热消渴；

五味子味酸、甘，性温，归肺、心、肾经，果实含维生素C、树脂、鞣质及少量糖类，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心之功效，常用于治疗久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗盗汗、津伤口渴、内热消渴、心悸失眠；

丹参味苦、微寒，归心、肝经，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈之功效，常用于治疗胸痹心痛、脘腹胁痛、症瘕积聚、热痹疼痛、心烦不眠、月经不调、痛经经闭、疮疡肿痛。

本发明的助眠组合物将益生菌与中药成分相组合，以筛选得到的枯草芽孢杆菌Subtilisin-QK为主要成分，辅以黄精、五味子和丹参组成的中药组合物，按特定比例相互配合，产生协同作用，具有促进睡眠、缓解神经疲劳等作用，有效延长了睡眠时间，提高了入睡率。

本株枯草芽孢杆菌Subtilisin-QK自身能够分泌蛋白酶、α-淀粉酶等酶类，在消化道内同人体消化酶共同作用；同时，枯草芽孢杆菌产生的酶类可以进一步将黄精、五味子和丹参中的化合物分解为小分子化合物，促进人体的吸收；进一步的研究发现，在枯草芽孢杆菌培养基中添加部分的黄精、五味子和丹参能够促进枯草芽孢杆菌的生长，枯草芽孢杆菌和黄精、五味子和丹参能够起到互相促进的功效。

优选地，所述枯草芽孢杆菌的重量百分比为50％～60％，例如可以是50％、 51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％。

优选地，所述黄精的重量百分比为5％～8％，例如可以是5％、6％、7％或8。

优选地，所述五味子的重量百分比为25％～30％，例如可以是25％、26％、 27％、28％、29％或30％。

优选地，所述丹参的重量百分比为10％～15％，例如可以是10％、11％、12％、13％、14％或15％。

本发明中，助眠组合物中的各组分在特定比例下协同增效，枯草芽孢杆菌Subtilisin-QK作为主要成分，质量百分比占各组分质量之和的50％～60％，枯草芽孢杆菌过少不利于与中药成分共同配合发挥安神效果，枯草芽孢杆菌过多则有可能产生毒副作用，降低安全性，同时提高了制备成本。

优选地，所述枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Subtilisin-QK，保藏于国家典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M203078，保藏日期为2003年11月17日。

本发明中，发明人在长期科研实践中，筛选得到一株新型的枯草芽孢杆菌Subtilisin-QK，所述枯草芽孢杆菌较普通的枯草芽孢杆菌在改善睡眠、提高免疫力等方面表现出优良功效，枯草芽孢杆菌Subtilisin-QK原始种子批的原始种子从发酵的大豆中由武汉大学王业富教授实验室分离得到，该菌种己保存于国家典型培养物保藏中心，菌种编号为CCTCCNO：M203078。

优选地，所述枯草芽孢杆菌中的活菌数不小于2×10¹¹cfu/g。

本发明中，所述枯草芽孢杆菌中的活菌数需要限定在不小于2×10¹¹cfu/g的范围，才能有效发挥助眠功效。

第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的助眠组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

将枯草芽孢杆菌、黄精、五味子和丹参研磨成粉，过筛后按比例混合，得到所述助眠组合物。

优选地，所述过筛的目数为80～100目，例如可以是80目、85目、90目、 95目或100目。

优选地，所述混合采用混合机、优选为采用三维混合机进行。

作为优选技术方案，本发明提供了一种助眠组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

将枯草芽孢杆菌、黄精、五味子和丹参研磨成粉，过80～100目筛后采用三维混合机按比例混合，得到所述助眠组合物。

第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的助眠组合物在制备改善睡眠、安神或缓解神经衰弱药物中的应用。

第四方面，本发明提供了一种药物，所述药物包括如第一方面所述的助眠组合物。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的助眠组合物将益生菌与中药成分相组合，以筛选得到的枯草芽孢杆菌为主要成分，辅以黄精、五味子和丹参组成的中药组合物，按特定比例相互配合，产生协同作用，具有促进睡眠、缓解神经疲劳等作用，有效延长了小鼠的睡眠时间至88min，将小鼠的阈下催眠入睡率提高到95％；

(2)本发明的助眠组合物配方简单合理，将枯草芽孢杆菌的质量百分比限定在50％～60％，无毒副作用，安全性好，具有优良的促进睡眠的功效。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1枯草芽孢杆菌的获取和形态学鉴定

(1)菌株获取

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Subtilisin-QK原始种子批的原始种子从发酵的大豆中由武汉大学王业富教授实验室分离得到，经历了样品采集→微生物分离→培养→筛选鉴定→阳性结果→菌种鉴定和保藏→生产出发菌等步骤。

(2)菌株形态学鉴定

将分离的菌株接种于NA固体培养基，在30℃下培养48h，单菌落浅白不透明，表面不光滑，边缘不整齐、无光泽，质地均一；将菌落接种于LB液体培养基，30℃恒温振荡培养18-24小时，培养基变浑浊，表面没有菌膜生成。

革兰氏染色后的镜检结果显示，菌体为革兰氏阳性杆菌，多单生，菌株形成椭圆形芽孢。

实施例2枯草芽孢杆菌的分子鉴定

菌株通过平板划线得到单菌落，挑取单菌落于含有2mL TSB的摇菌管中，置于28℃振荡培养至浑浊；取1mL菌液于离心管中，10000rpm离心3min后弃上清，加入50μL无菌水，振匀后于95℃保温处理2min，置于0℃冰箱中备用；

根据文献记载选择通用引物27F和1492R进行菌株基因组的PCR扩增，反应条件为94℃预变性3min，35循环(94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸100s)，72℃延伸7min，PCR扩增引物如下：

27F(SEQ ID NO:1)：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’；

1492R(SEQ ID NO:2)：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’.

取5μL扩增产物，加入1μL上样缓冲液，混匀后进行琼脂糖凝胶电泳45 min；使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒回收DNA片段；

将回收的片段进行测序，测序结果在GenBank中通过BLAST比对该菌的 16S rRNA序列片段，结果显示其与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis序列的相似度 (maxidentity)为100％，比对序列覆盖范围(query cover)为100％，E值为0，因此鉴定菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，并命名为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)Subtilisin-QK，鉴定结果可信。

实施例3菌株保藏

本实施例采用甘油冷冻保存法进行菌株保藏，具体步骤如下：

(1)用火焰灭菌的接种环取斜面菌种在LB培养基平皿上划线分离单菌落；

(2)平皿倒置于37℃恒温培养箱，培养24-48小时，至单菌落的大小为 3mm左右；

(3)挑取一个单菌落，接种于一个装50mLLB培养基的250mL三角瓶中 37℃振荡培养16小时，至菌密度OD₆₀₀为3-5；

(4)用火焰灭菌的接种环取少量种子液，涂片后，作革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的形态，及是否有杂菌；

(5)按1:1加入900μL50％无菌甘油和900μL培养好的种子液，混合后分装至事先灭菌的菌种保存管(2mL/管)-80℃冰箱保存，在保种管上标明批号。

实施例4菌株测序

将筛选得到的枯草芽孢杆菌与普通枯草芽孢杆菌进行比对分析；

(1)本发明所述枯草芽孢杆菌的筛选过程如下：

(2)本发明所述枯草芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的比对结果：

根据测序结果整理出待检菌的16SrDNA序列(共1514bp)，如SEQ ID NO: 3所示：

AGAGTTTGATCATGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATAC ATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGG ACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCG GGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACA TAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCT AGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAG AGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGG AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAA CGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGG AAGAACAAGTGCCGTTCGAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAG AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCA AGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAA GTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTG GGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGA AATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGT CTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGA TACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTT CCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTA CGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCT TGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAG TGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTT AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTG GGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGA CGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGG ACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATC TGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAAT CGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG TACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGA GGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTG AAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA.

将上述测序得到的16SrDNA序列提交到NCBI，比对结果发现，待检菌与已经公布的枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis序列一致。

对该株枯草芽孢杆菌进行基因测序，结果如SEQ ID NO:4所示，为一株新的枯草芽孢杆菌，将该株枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Subtilisin-QK。

SEQ ID NO:4：

GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTT AATCTTTACGATGGCGTTCAGCAACATGTCTGCGCAGGCTGCCGGAAAAA GCAGTACAGAAAAGAAATACATTGTTGGATTTAAACAGACAATGAGTGCC ATGAGTTCCGCCAAGAAAAAGGATGTTATTTCTGAAAAAGGCGGAAAGGT TCAAAAGCAGTTTAAGTATGTTAACGCAGCCGCAGCAACATTGGATGAAA AAGCTGTAAAAGAATTGAAACAAGATCCGAGCGTTGCATATGTGGAAGAA GATCATATTGCACATGAATATGCGCAATCTGTTCCTTACGGCATTTCTCAAA TTAAAGCGCCGGCTCTTCACTCTCAAGGCTACACAGGCTCTAACGTAAAA GTAGCTGTTATCGACAGCGGAATTGACTCTTCTCATCCTGACTTAAACGTC AGAGGCGGAGCAAGCTTCGTACCTTCTGAAACAAACCCATACCAGGACG GCAGTTCTCACGGCACACACGTAGCCGGTACGATTGCCGCTCTTAATAACA CAATCGGTGTTCTGGGCGTAGCGCCAAACGCATCGTTATATGCAGTAAAAG TTCTTGACTCAACAGGAAGCGGCCAATACAGCTGGATTATTAACGGCATTG AGTGGGCTATTTCCAACAATATGGATGTTATCAACATGAGCCTTGGCGGAC CTTCTGGATCTACAGCTCTGAAAACAGTCGTTGATAAAGCAGTTTCCAGC GGTATCGTCGTTGCTGCCGCTGCCGGAAACGAAGGTTCATCGGGCAGCAC AAGCACAGTCGGCTACCCTGCAAAATATCCTTCTACCATTGCGGTAGGTGC GGTAAACAGCAGCAACCAAAGAGCTTCATTCTCAAGCGCAGGTTCTGAGC TTGATGTAATGGCTCCTGGCGTGTCCATCCAAAGCACACTTCCTGGAGGCA CTTACGGTGCTTACAACGGAACGTCAATGGCGACTCCTCACGTTGCCGGA GCAGCAGCGCTAATTCTTTCTAAGCATCCGACTTGGACAAACGCGCAAGT CCGTGATCGTTTAGAAAGCACTGCAACATATCTTGGAAACTCTTTCTACTA TGGAAAAGGGTTAATCAACGTACAAGCAGCTGCACAATAATAG.

实施例5

采用筛选得到的枯草芽孢杆菌制备助眠组合物，所述助眠组合物按质量百分比包括50％枯草芽孢杆菌、5％黄精、30％五味子和15％丹参，其中，枯草芽孢杆菌的活菌数为3×10¹¹cfu/g。

助眠组合物的制备方法为：

将枯草芽孢杆菌、黄精、五味子和丹参研磨成粉，过80目筛后采用三维混合机按质量百分比进行混合，得到所述助眠组合物。

实施例6

助眠组合物按质量百分比包括60％枯草芽孢杆菌、5％黄精、15％五味子和 10％丹参，其中，枯草芽孢杆菌的活菌数为2×10¹¹cfu/g。

将枯草芽孢杆菌、黄精、五味子和丹参研磨成粉，过100目筛后采用三维混合机按质量百分比进行混合，得到所述助眠组合物。

实施例7

与实施例5相比，枯草芽孢杆菌的活菌浓度为1×10¹¹cfu/g，其他条件与实施例5相同。

对比例1

与实施例5相比，采用市售的活菌数不小于2×10¹¹cfu/g的枯草芽孢杆菌制备助眠组合物，所述助眠组合物的组成为50％市售枯草芽孢杆菌、5％黄精、30％五味子和15％丹参。

对比例2

与实施例5相比，助眠组合物不包括枯草芽孢杆菌，组成为20％黄精、45％五味子和35％丹参。

对比例3

与实施例5相比，助眠组合物不包括黄精，组成为50％枯草芽孢杆菌、30％五味子和20％丹参。

对比例4

与实施例5相比，助眠组合物不包括五味子，组成为50％枯草芽孢杆菌、 20％黄精和30％丹参。

对比例5

与实施例5相比，助眠组合物不包括丹参，组成为50％枯草芽孢杆菌、20％黄精和30％五味子。

对比例6

与实施例5相比，助眠组合物按质量百分数包括70％枯草芽孢杆菌、5％黄精、15％五味子和10％丹参。

对比例7

与实施例5相比，助眠组合物按质量百分数包括40％枯草芽孢杆菌、10％黄精、30％五味子和20％丹参。

助眠组合物对小鼠睡眠作用的影响

选取100只体重约为20g的雌性昆明小鼠，采用常规饲料预饲一周，随机分为10组，每组10只。采用实施例5-7和对比例1-7的助眠组合物进行灌胃，浓度为0.5g/kg，并设置空白对照组采用等量的生理盐水进行灌胃，连续灌胃7 天，末次给药后2h，每组的小鼠以30mg/kg(阈下剂量)腹腔注射戊巴比妥钠，以小鼠翻正反射消失1min以上为入睡指标，以小鼠翻正反射回复为苏醒标志，翻正反射消失至恢复这段时间为小鼠的睡眠时间，记录入睡小鼠的数量及睡眠时间，计算入睡率，结果如表1所示。

表1

编号	阈下催眠入睡率(％)	睡眠时间(min)
			实施例5	95	88.38
实施例6	91	85.62
			实施例7	77	80.14
对比例1	46	23.51
			对比例2	40	15.67
对比例3	68	32.15
			对比例4	62	28.94
对比例5	58	26.85
			对比例6	75	76.21
对比例7	56	33.67
			空白对照	25	12.68

可以看出，实施例5-6的助眠组合物可以显著提高小鼠的入睡率，延长小鼠的睡眠时间；实施例7的助眠组合物对入睡率的提高和睡眠时间的延长也具有作用，但不及实施例5-6的助眠组合物，原因在于枯草芽孢杆菌的活菌数较低；对比例1的助眠组合物中的市售枯草芽孢杆菌的助眠效果差，与黄精、五味子和丹参配合后也不能显著提高入睡率，对比例2的助眠组合物不包括枯草芽孢杆菌，助眠效果也较差；对比例3-5的助眠组合物分别缺少黄精、五味子或丹参中的一种，效果进一步减弱；对比例6-7的助眠组合物具有一定的功效，但枯草芽孢杆菌的质量百分比过高或过低，助眠功效不及实施例。

综上所述，本发明的助眠组合物中以筛选得到的枯草芽孢杆菌为主要成分，辅以黄精、五味子和丹参组成的中药组合物，按特定比例协同增效，具有促进睡眠、缓解神经疲劳等作用，有效延长了小鼠的睡眠时间至88min，将小鼠的阈下催眠入睡率提高到95％，所述助眠组合物配方简单合理，无毒副作用，安全性好，应用前景广阔。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 湖北真福医药有限公司

<120> 一种含有枯草芽孢杆菌的助眠组合物及其制备方法和应用

<130> 20190618

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 1

tacggytacc ttgttacgac tt 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 2

tacggytacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1514

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 3

agagtttgat catggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga 180

accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240

cattagctag ttggtgaggt aatggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag 300

ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360

gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420

cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcgaatagg gcggcacctt 480

gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540

gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600

gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660

gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720

agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840

tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900

aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960

ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag 1020

gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080

agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140

tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200

atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg 1260

aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320

tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1380

tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440

gaggtaacct tttaggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500

acaaggtagc cgta 1514

<210> 4

<211> 1149

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 4

gtgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt taacgttaat ctttacgatg 60

gcgttcagca acatgtctgc gcaggctgcc ggaaaaagca gtacagaaaa gaaatacatt 120

gttggattta aacagacaat gagtgccatg agttccgcca agaaaaagga tgttatttct 180

gaaaaaggcg gaaaggttca aaagcagttt aagtatgtta acgcagccgc agcaacattg 240

gatgaaaaag ctgtaaaaga attgaaacaa gatccgagcg ttgcatatgt ggaagaagat 300

catattgcac atgaatatgc gcaatctgtt ccttacggca tttctcaaat taaagcgccg 360

gctcttcact ctcaaggcta cacaggctct aacgtaaaag tagctgttat cgacagcgga 420

attgactctt ctcatcctga cttaaacgtc agaggcggag caagcttcgt accttctgaa 480

acaaacccat accaggacgg cagttctcac ggcacacacg tagccggtac gattgccgct 540

cttaataaca caatcggtgt tctgggcgta gcgccaaacg catcgttata tgcagtaaaa 600

gttcttgact caacaggaag cggccaatac agctggatta ttaacggcat tgagtgggct 660

atttccaaca atatggatgt tatcaacatg agccttggcg gaccttctgg atctacagct 720

ctgaaaacag tcgttgataa agcagtttcc agcggtatcg tcgttgctgc cgctgccgga 780

aacgaaggtt catcgggcag cacaagcaca gtcggctacc ctgcaaaata tccttctacc 840

attgcggtag gtgcggtaaa cagcagcaac caaagagctt cattctcaag cgcaggttct 900

gagcttgatg taatggctcc tggcgtgtcc atccaaagca cacttcctgg aggcacttac 960

ggtgcttaca acggaacgtc aatggcgact cctcacgttg ccggagcagc agcgctaatt 1020

ctttctaagc atccgacttg gacaaacgcg caagtccgtg atcgtttaga aagcactgca 1080

acatatcttg gaaactcttt ctactatgga aaagggttaa tcaacgtaca agcagctgca 1140

caataatag 1149

Claims

1.一种含有枯草芽孢杆菌的助眠组合物，其特征在于，所述助眠组合物按质量百分比包括以下组分：

枯草芽孢杆菌 50％～60％

黄精 5％～8％

五味子 25％～30％

丹参 10％～15％；

所述助眠组合物的百分比之和不超过100％。

2.根据权利要求1所述的助眠组合物，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Subtilisin-QK，保藏于国家典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M203078，保藏日期为2003年7月8日。

3.根据权利要求1或2所述的助眠组合物，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌中的活菌数不小于2×10¹¹cfu/g。

4.一种如权利要求1-3任一项所述的助眠组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述过筛的目数为80～100目。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述混合采用混合机、优选为采用三维混合机进行。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

8.一种如权利要求1-3任一项所述的助眠组合物在制备改善睡眠、安神或缓解神经衰弱药物中的应用。

9.一种药物，其特征在于，所述药物包括如权利要求1-3任一项所述的助眠组合物。

10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。