CN105535950A - 制备纤溶酶组合物的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备纤溶酶组合物的方法及其应用。本发明的方法首先将特定中草药的粉碎过筛制备中草药粉,制得的中草药粉作为成分添加到枯草芽孢杆菌发酵培养基中,通过枯草芽孢杆菌的中草药粉液体深层发酵产生具有溶栓功效的纤溶酶。发酵结束后,将发酵液离心去除菌体和残渣沉淀,上清液经过浓缩、冷冻干燥制备得到中草药纤溶酶组合物。本发明的方法工艺简单,周期短、利于工业化生产,并且中草药纤溶酶组合物进一步拓展了纤溶酶单一溶解血栓的功效,克服了通过枯草芽孢杆菌大豆固体发酵的传统方法制备纤溶酶的产量低和功效单一的缺陷。
Description
【技术领域】
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种制备纤溶酶组合物的方法及其应用。
【背景技术】
全球每年直接死于血栓型心脑疾病的人数就高达1800万,间接死亡人数超过3000万,接近世界总死亡人数的1/3,已经成为人类健康的头号杀手。我国人口众多,人口老龄化速度加快,心脑血管疾病的发病率和死亡率不断上升,每年因患心脑血管疾病死亡的人数高达700万人,心脑血管疾病患病人数已经超过3亿。仅我国整个心脑血管疾病相关市场已经超过1万亿元。心脑血管疾病背后主要致病原因是血栓的形成。而血栓性疾病常常伴随其他慢性疾病,其中最为严重和常见的是高血压和高血糖疾病。
溶栓疗法是目前认为治疗血栓栓塞性疾病最为有效并且可靠的手段,纤溶酶可以通过溶解血栓中的主体支撑结构纤维网状蛋白,达到瓦解血栓再通血管的目的,并且该药物安全有效。无任何出血性毒副作用。因此,纤溶酶被认为是目前最具应用前景的预防和治疗血栓性心脑血管疾病的药物。
然而,目前纤溶酶制备主要依靠传统的大豆固体发酵制备纳豆,纳豆中含有纤溶酶成分纳豆激酶。通过传统方法以大豆为原料制备的纳豆由于其具有氨臭味、色泽暗淡,很难在国内得到普及。并且通过大豆发酵的传统方法工艺复杂、周期长。传统方法制得纳豆中纳豆激酶含量低、活性低,功能单一,很难兼顾治疗血栓性疾病所伴有的其它慢性疾病,其中最为常见和严重的当属高血压和高血糖。而高血压和高血糖慢性疾病常常和血栓相伴而生,相互联系,相互影响,只治疗其中一种很难根除其它疾病,同时治疗才可起到更好的功效。
【发明内容】
本发明的目的在于克服目前传统技术方法中以大豆为原料制备纤溶酶所存在的工艺复杂、周期长,纤溶酶活性低伴随氨臭味,且功效单一的系列缺陷,提供一种制备纤溶酶组合物的方法及其应用。
为实现上述目的,本发明提供的制备纤溶酶组合物的方法,它包括如下步骤:
(1)中草药经过中草药粉碎机粉碎后,经过100~120目筛制备中草药粉;所选中草药原料选用黄芪、黄连、金银花和/或枸杞,以及选用丹参、葛根、三七和/或山楂;
(2)将步骤(1)中制得的中草药粉作为营养成分添加到枯草芽孢杆菌培养基中;所述枯草芽孢杆菌培养基包括如下成分:选取的所述中草药原料成分各5g/L、葡萄糖5g/L、Na2HPO4·12H2O5g/L、NaH2PO4·2H2O1.0g/L、MgSO40.5g/L、CaCL20.3g/L,培养基pH7.0~7.5;
(3)步骤(2)中的中草药粉在枯草芽孢杆菌的液体深层发酵;所述枯草芽孢杆菌的发酵条件为:发酵温度30~32℃,初始pH值7.2~7.5,最适接种量5%;生长周期24~25h,最适放罐时间为26~28h;
(4)步骤(3)中的发酵液经过5000rpm离心10~12min,去除沉淀,保留上清液;离心之后的发酵上清液经过冷冻干燥制得纤溶酶组合物。
作为优选方案,所述步骤(4)中的冷冻干燥方法为:将发酵上清液于~80℃冻结,然后放入真空冷冻干燥机中,于真空度为10Pa,冷阱温度~50℃条件下干燥30~32h。
上述枯草芽孢杆菌为BacillussubtilisQK,由中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为CCTCCNO:M203078。通过枯草芽孢杆菌的液体发酵,可以将中草药的保健治疗功效与纤溶酶的溶栓功效有机结合,既具有纤溶酶的溶解血栓功效,也具有中草药成分的相应治疗功效。
本发明还提供一种上述得到的纤溶酶组合物在制备溶解血栓、降血糖和降血压药物中的应用。本发明制得的纤溶酶组合物溶栓活性高达37828IU/g,并且具有治疗高血压和高血糖的功效。
本发明通过特定功效的中草药粉液体发酵枯草芽孢杆菌制备纤溶酶组合物,工艺简单、周期短,无氨臭味、并且中草药的降血糖和降血压功效与纤溶酶的溶解血栓功效通过枯草芽孢杆菌发酵有机结合,可以实现溶解血栓的同时达到治疗高血压和高血糖疾病的目的。此方法工艺简单、周期短、适合产业化生产,且纤溶酶组合物同时治疗三种疾病,应用前景广阔。具体具有如下优点:
(1)本发明的方法制备纤溶酶工艺简单、时间周期短、完全摆脱了氨臭味
(2)制得的纤溶酶组合物溶栓活性高达37828IU/g,显著高于传统技术制备得到的纳豆激酶活性。
(3)纤溶酶组合物不仅具有纤溶酶的溶解血栓功效,还具有治疗高血压和高血糖的功效,可以同时治疗血栓及其伴随的高血压和高血糖症状,治疗效果更显著,避免了疾病之间的相互影响。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述,但本发明不局限于实施例范围之内。
实施例一
(1)中草药粉制备
将降血糖功效中草药黄芪、黄连、金银花、枸杞和降血压功效中草药丹参、葛根、三七、山楂分别通过中草药粉碎机粉碎,并过100目筛制备中草药粉。
(2)发酵种子液制备
BacillussubtilisQK枯草芽孢杆菌培养条件为:以LB培养基为种子培养基,pH为7.2,三角瓶装液量为25ml/250ml,培养温度为37℃,摇床转速为180rpm,培养周期为16h。
(3)枯草芽孢杆菌液体发酵培养基制备
上述降血糖四种中草药成分或者降血压四种中草药成分各5g/L、葡萄糖5g/L、Na2HPO4·12H2O5g/L、NaH2PO4·2H2O1.0g/L、MgSO40.5g/L、CaCL20.3g/L,pH7.0~7.5。
(3)接种发酵
无菌条件下按5%接种BacillussubtilisQK枯草芽孢杆菌种子液,然后与发酵设备中进行发酵,发酵条件为发酵温度30℃,初始pH值7.2,最适接种量5%;生长周期24h,最适放罐时间为26h。
(4)纤溶酶组合物制备
上述发酵液经过5000rpm离心10min,去除沉淀,保留上清液。离心之后的发酵上清液~80℃冻结,然后放入真空冷冻干燥机中,于真空度为10Pa,冷阱温度~50℃条件下干燥30h。分别制备得到降血压纤溶酶组合物、降血糖纤溶酶组合物。
实施例二
具体方法步骤同实施例一,区别在于:(1)中草药粉制备:将降血糖功效中草药黄芪、黄连、金银花、枸杞和降血压功效中草药丹参、葛根、三七、山楂分别通过中草药粉碎机粉碎,并过110目筛制备中草药粉。(3)接种发酵:发酵温度31℃,初始pH值7.3,最适接种量5%;生长周期24.5h,最适放罐时间为27h;(4)纤溶酶组合物制备:发酵液经过5000rpm离心11min,去除沉淀;冷阱温度~50℃条件下干燥31h。
实施例三
具体方法步骤同实施例一,区别在于:(1)中草药粉制备:将降血糖功效中草药黄芪、黄连、金银花、枸杞和降血压功效中草药丹参、葛根、三七、山楂分别通过中草药粉碎机粉碎,并过120目筛制备中草药粉。(3)接种发酵:发酵温度32℃,初始pH值7.5,最适接种量5%;生长周期25h,最适放罐时间为28h;(4)纤溶酶组合物制备:发酵液经过5000rpm离心12min,去除沉淀;冷阱温度~50℃条件下干燥32h。
实施例四
纳豆激酶酶活的测定使用琼脂糖纤维蛋白平板法,将不同浓度的尿激酶配制成20、40、60、80、100、120、140、160IU/mL系列浓度,点样于平板上,置于37℃培养18h,测定纤溶圈面积,制作酶活~面积标准曲线。取纤溶酶组合物0.1g置于纤维蛋白平板37℃培养18h,测定纤溶圈面积,根据尿激酶活性标准曲线计算相应的酶活。
按照实施例一的方法,酶活测定结果显示,纤溶酶组合物的溶栓活性高达为37828IU/g,远高于传统大豆固体发酵纤溶酶活性。
实施例五
降血糖纤溶酶组合物的降血糖作用
(1)糖尿病小鼠模型建立
小鼠禁食不禁水12h,腹腔注射链脲佐菌素(STZ)30mg/kg体重,每天1次,连续5天。成模标准:本研究采用小鼠空腹血糖连续2天大于15.9mmol·L~1为造模成功标准。
(2)试验与分组
实验动物分组:小鼠,雄性,体重(18±2)g。取小鼠60只,抽签法随机分为6组:正常对照组(10只),模型组(10只),白玉纳豆冻干粉大、中、小剂量组(各10只),胰岛素组(10只)。降血糖纤溶酶组合物大、中、小剂量组给药分别为5g/kg体重、2.5g/kg体重、1g/kg体重。用血采用小鼠断尾取血法,测定血糖浓度。
(3)降血糖纤溶酶组合物的降血糖作用
表.降血糖纤溶酶组合物对糖尿病模型小鼠血糖的影响((mmol·L~1)
实施例六
降血压纤溶酶组合物的降血压作用
(1)大鼠分组及试验
自发性高血压大鼠30只,雌性,6~8周龄,体重160~200g。普通正常雌性大鼠6只,同性别,同周龄,动物在实验室适应1周后,根据所测基础血压及体重的大小,按随机区组设计分为6组,所有动物均单笼饲养,自由进食饮水,实验期共30d。降血压纤溶酶组合物大、中、小剂量组给药分别为5g/kg体重、2.5g/kg体重、1g/kg体重。以BP~98A血压记录仪从大鼠尾动脉记录血压,每10d测一次,共测3次
(2)降血压纤溶酶组合物的降血糖作用
表.降血糖纤溶酶组合物对自发性高血压大鼠血压的影响((mmHg)
Claims (3)
1.一种制备纤溶酶组合物的方法,它包括如下步骤:
(1)中草药经过中草药粉碎机粉碎后,经过100~120目筛制备中草药粉;所选中草药原料选用黄芪、黄连、金银花和/或枸杞,以及选用丹参、葛根、三七和/或山楂;
(2)将步骤(1)中制得的中草药粉作为营养成分添加到枯草芽孢杆菌培养基中;所述枯草芽孢杆菌培养基包括如下成分:选取的所述中草药原料成分各5g/L、葡萄糖5g/L、Na2HPO4·12H2O5g/L、NaH2PO4·2H2O1.0g/L、MgSO40.5g/L、CaCL20.3g/L,培养基pH7.0~7.5;
(3)步骤(2)中的中草药粉在枯草芽孢杆菌的液体深层发酵;所述枯草芽孢杆菌的发酵条件为:发酵温度30~32℃,初始pH值7.2~7.5,最适接种量5%;生长周期24~25h,最适放罐时间为26~28h;
(4)步骤(3)中的发酵液经过5000rpm离心10~12min,去除沉淀,保留上清液;离心之后的发酵上清液经过冷冻干燥制得纤溶酶组合物。
2.根据权利要求1所述的制备纤溶酶组合物的方法,其特征在于:所述步骤(4)中的冷冻干燥方法为:将发酵上清液于~80℃冻结,然后放入真空冷冻干燥机中,于真空度为10Pa,冷阱温度~50℃条件下干燥30~32h。
3.一种根据权利要求1或2得到的纤溶酶组合物在制备溶解血栓、降血糖和降血压药物中的应用。
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