CN101766671A - 一种防治冠状动脉支架置入术后再狭窄的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治冠状动脉狭窄及支架置入术后再狭窄的药物组合物及其制备方法，该药物组合物以黑豆、葛根和三七为原料，该组合物的制备方法为：黑豆高温蒸煮，接种纳豆枯草芽孢杆菌发酵后，逆流提取、纯化、干燥得纳豆激酶干粉；葛根80℃乙醇回流提取后，浓缩干燥得葛根总黄酮干粉；三七粉经10倍70％乙醇回流提取后，浓缩干燥得到三七总皂苷干粉，将三个组分混合装缓释胶囊抛光即得本品。本发明有显著溶栓抗凝、抑制血管平滑肌增殖的作用，可以有效的防治冠脉支架置入术后的再狭窄，且价格低廉，作用迅速、时间持久，毒副作用小，生产工艺相对简单、成本低廉，能耗低，适用于工业化生产。

Description

一种防治冠状动脉支架置入术后再狭窄的药物组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及到一种药物组合，特别涉及到一种防治冠状动脉狭窄及支架置入术后再狭窄的药物组合及其制备方法。

背景资料

冠状动脉性心脏病(CHD)简称冠心病，是指因冠状动脉狭窄、供血不足而引起的心肌机能障碍和(或)器质性病变，故又称缺血性心肌病(IHD)。目前我国冠心病的发病率为6～7％，全国有近八千万患者，近年发病率呈快速增长趋势，每年死于各种冠心病的人数超过100万。冠状动脉支架置入术(ICS)的产生成功挽救了众多冠心病患者的生命，我国一些大医院，支架的使用率达到60％～90％，个别医院甚至高达100％。而ICS术后的再狭窄是其最大的不足，影响了其远期疗效。再狭窄主要是由于支架置入时损伤了血管内皮细胞并引发机体免疫反应而导致血管平滑肌迅速增殖和血栓的形成，同时支架的置入并没有改善患者病理生理状态，原有的病因仍然存在，增加了血栓形成的危险性，因此ICS术后必须长期服用药物防治再狭窄。

目前临床预防以抗凝药和血小板抑制药联合应用为主，但这只能起到抗凝、抑制血小板集聚而防止血栓形成，对血管内皮损伤、血管平滑肌增殖作用较小。因此当前临床尚无有效防治ICS术后再狭窄的药物可使用。而且术后防治再狭窄药多为进口，其价格昂贵，多为国产药品的几倍。支架后患者每年服用国产防治再狭窄药物费用在1万元以上，进口药在3万以上，给患者家庭及社会造成较大负担。

目前我国中药具有溶栓抗凝作用的药物研发刚起步，制剂以水丸和注射剂为主，胶囊剂比较少。中药制剂一般具有疗效较好、毒副作用较小，受到专家和患者的普遍好评，但是中药制剂的制备工艺低下，生物利用度较低，因而达到一定疗效所服剂量比较大，临床服用不方便，所以临床迫切需要一种疗效确切，安全性好，服用剂量小，方便的药物问世。

发明内容

本发明目的在于提供一种防治冠状动脉狭窄及支架置入术后再狭窄的药物组合；本发明的另一个目的在于提供一种防治冠状动脉狭窄及支架术后再狭窄的药物组合的制备方法。

本发明药物组合物原料药组成为：

黑豆600～1200重量份  葛根重量70～200份  三七8～20重量份

本发明药物组合物原料药组成优选为：

黑豆800重量份  葛根90重量份  三七20重量份

本发明药物组合物原料药组成还可以优选为：

黑豆1200重量份  葛根重量份100  三七10重量份

本发明药物组合物原料药组成还可以优选为：

黑豆1000重量份  葛根150重量份  三七10重量份

本发明药物组合物原料药组成还可以优选为：

黑豆1100重量份  葛根140重量份  三七12重量份

本发明药物组合物原料药组成还可以优选为：

黑豆1200重量份  葛根200重量份  三七8重量份

本发明药物组合物原料药组成还可以优选为：

黑豆600重量份  葛根200重量份  三七20重量份

本发明药物组合物原料药组成还可以优选为：

黑豆850重量份  葛根130重量份  三七20重量份

本发明上述药物组合物的原料药，经常规工艺提取有效组分后，加入常规辅料制成肠溶型片剂、胶囊剂、丸剂、膜剂和口服液体制剂。

本发明药物组合物制备方法包括如下步骤(本发明所述的重量份/体积份对应关系是g/ml)

黑豆的制备：

A、选取上述重量份的黑豆，蒸馏水清洗干净，20～30℃浸泡1～3小时后，120～140℃高压蒸煮灭菌0.5～1.5小时，冷却到30～40℃，干燥为豆渣；

B、按以下比例配置各种培养基：

斜面培养基(体积份分数)：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂2％，pH值控制在7.2～7.4，总体积为1000体积份；

种子培养基(体积分数)：葡萄糖1％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，pH值控制在7.2～7.4，总体积为5000体积份；

固体培养基：步骤A制备获得的所有豆渣，加入一定量PH值为7.0～8.0的水，使固体培养基的含水量为65～75％，115～125℃灭菌15～30min待用；

C、将1.5～3.0体积份纳豆枯草芽孢杆菌(10⁶个/ml)接种到步骤B配置的斜面培养基中，28～35℃培养12～20h，取一环的活化菌种，接入步骤B配置的种子培养基中，28～35℃，200r/min摇瓶培养12～20h；

D、取10％的上述种子培养液接种于步骤B所配置的固体培养基中，28～35℃培养90～120h，间时拍打，使其均匀生长。固体发酵培养物中按1∶12～18的体积加入0.9％的生理盐水，4℃浸提20～30h，5000r/min，离心8～15min，取上清液，先加入硫酸铵使饱和度至20％，离心除去杂蛋白，再加入硫酸铵使饱和度至60％，搅拌溶解后冷处静置过夜，离心收集沉淀，沉淀用10mmol/LpH6.4的硫酸缓冲液溶解，后经硫酸铵盐析分离，进行Superdex75凝胶层析，收集活性部分进行SP SepharoseFast Flow离子交换层析，采用梯度洗脱方法进行洗脱，最后得到高纯度的纳豆激酶回收液，经喷雾干燥后得高纯度纳豆激酶干粉；

葛根的制备：

E、选取上述重量份的葛根粉碎机粉碎，过筛，制成葛根粉，60-80％的(体积份数)乙醇溶液浸泡，使固液比为1∶10-14，70-85℃加热回流提取110-130min，回收乙醇后，浓缩得到葛根总黄酮组分的干粉；三七的制备：

F、选取上述重量份的三七粉碎过8目-40目的药筛，7-12倍量60-80％的乙醇55-70℃回流提取2-3次，每次1-2h，回收乙醇后得水蛭素等组分的干粉；

药物组合的制备：

H、将黑豆、葛根和三七分别提取所得的各组分干粉混合均匀，备用。

上述黑豆、葛根和三七分别提取所得的各组分干粉混合可以按常规的制剂工艺制成药剂学可接受的任意常规剂型，包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、凝胶剂、缓释剂、口服液。

为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料(范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社1997年12月第1版中各剂型记载的辅料)。

本发明药物组合物制备方法中黑豆也可以采用如下方法(液体发酵)制备：

1、精选600～1200重量份黑豆，蒸馏水清洗干净，20-30℃浸泡1-3h后，120-140℃高压蒸煮灭菌0.5-1.5h，冷却到30-40℃，干燥为豆渣，作为配置各种培养基的原料；

2、按以下比例配置各种培养基：

斜面培养基(体积份分数)：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂2％，pH值控制在7.0-7.4，总体积为1000体积份；

种子培养基(体积分数)：葡萄糖1％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，pH值控制在7.0-7.4，总体积为5000体积份；

基础发酵培养基：麦芽糖2％，蛋白胨2％，NaCl 0.5％(或者CaCl 20.5％)，pH7.0-7.4，总体积为10000体积份；

3、将2体积份纳豆枯草芽孢杆菌(10⁶个/ml)接种到步骤2配置的斜面培养基中，30-37℃培养14-24h。取一环活化菌种，接入步骤2配置的种子培养基中，30-37℃，200r/min摇瓶培养14-24h，制成种子培养液；取2体积分数的种子培养液加入到步骤2配置的基础发酵培养基中，30-37℃，200r/min摇瓶培养3d，收集发酵液5000r/min离心10min，收集上清液。

4、收集的上清液中加入硫酸铵使饱和度至20％，离心除去杂蛋白，再加入硫酸铵使饱和度至60％，搅拌溶解后冷处静置过夜，离心收集沉淀，沉淀用10mmol/LpH6.4的硫酸缓冲液溶解，后经硫酸铵盐析分离，进行Superdex75凝胶层析，收集活性部分进行SP Sepharose Fast Flow离子交换层析，采用梯度洗脱方法进行洗脱，最后得到高纯度的纳豆激酶回收液，经喷雾干燥后得高纯度纳豆激酶干粉；

本发明药物组合物制备方法中葛根也可以采用如下方法制备：

精选70-200g葛根，50-70％的乙醇回流提取，固液比为1g/25ml，600-800W微波间歇辐射2-4次，每次30-50s；大孔树脂吸附后，60-80％乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇，浓缩干燥得高纯度葛根总黄酮。

本发明药物组合物制备方法优选如为：

1、精选1000重量份黑豆，蒸馏水清洗干净，25℃浸泡2h后，120℃高压蒸煮灭菌1h，冷却到37℃，干燥为豆渣；

2、按以下比例配置各种培养基：

斜面培养基(体积分数)：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂2％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为1000体积份；

种子培养基(体积分数)：葡萄糖1％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为5000体积份；

固体培养基：步骤1制备获得的所有豆渣，加入一定量PH值为8.0的水，使固体培养基的含水量为70％，121℃灭菌20min待用。

3、将2体积份纳豆枯草芽孢杆菌(10⁶个/ml)接种到步骤2配置的斜面培养基中，30℃培养14h。取一环活化菌种，接入步骤2配置的种子培养基中，30℃，200r/min摇瓶培养14h。

4、取10％的上述种子培养液接种于步骤2所配置的固体培养基中，30℃培养96h，间时拍打，使其均匀生长。固体发酵培养物中按1∶15的体积加入0.9％的生理盐水，4℃浸提24h，5000r/min，离心10min，取上清夜，先加入硫酸铵使饱和度至20％，离心除去杂蛋白，再加入硫酸铵使饱和度至60％，搅拌溶解后冷处静置过夜，离心收集沉淀，沉淀用10mmol/LpH6.4的硫酸缓冲液溶解，后经硫酸铵盐析分离，进行Superdex75凝胶层析，收集活性部分进行SP Sepharose Fast Flow离子交换层析，采用梯度洗脱方法进行洗脱，最后得到高纯度的纳豆激酶回收液，经喷雾干燥后得高纯度纳豆激酶干粉；

5、精选葛根150重量份，粉碎机粉碎，过80目筛，制成葛根粉，65％的(体积分数)乙醇溶液浸泡，使固液比为1∶12，80℃加热回流提取120min，回收乙醇后，浓缩得到葛根总黄酮组分的干粉。

6、精选三七10重量份，粉碎过8目-40目的药筛，8倍量85％的乙醇60℃回流提取2次，每次1.5h，回收乙醇后得三七总皂苷组分的干粉。

7、将黑豆、葛根和三七分别提取所得的各组分干粉混合均匀，备用。

本发明药物组合物制备方法还可以优选如下步骤：

1、精选900重量份黑豆，蒸馏水清洗干净，25℃浸泡2h后，115℃高压蒸煮灭菌1h，冷却到37℃，干燥为豆渣；

2、按以下比例配置各种培养基：

斜面培养基(体积分数)：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂2％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为1000体积份；

种子培养基(体积分数)：葡萄糖1％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为5000体积份；

固体培养基：步骤1制备获得的所有豆渣，加入一定量PH值为8.0的水，使固体培养基的含水量为70％，121℃灭菌20min待用。

3、将2体积份纳豆枯草芽孢杆菌(10⁶个/ml)接种到步骤2配置的斜面培养基中，30℃培养14h。取一环活化菌种，接入步骤2配置的种子培养基中，30℃，200r/min摇瓶培养14h。

4、取10％的上述种子培养液接种于步骤2所配置的固体培养基中，30℃培养96h，间时拍打，使其均匀生长。固体发酵培养物中按1∶15的体积加入0.9％的生理盐水，4℃浸提24h，5000r/min，离心10min，取上清夜，先加入硫酸铵使饱和度至20％，离心除去杂蛋白，再加入硫酸铵使饱和度至60％，搅拌溶解后冷处静置过夜，离心收集沉淀，沉淀用10mmol/LpH6.4的硫酸缓冲液溶解，后经硫酸铵盐析分离，进行Superdex75凝胶层析，收集活性部分进行SP Sepharose Fast Flow离子交换层析，采用梯度洗脱方法进行洗脱，最后得到高纯度的纳豆激酶回收液，经喷雾干燥后得高纯度纳豆激酶干粉；

5、精选葛根120重量份，粉碎机粉碎，过80目筛，制成葛根粉，70％的(体积分数)乙醇溶液浸泡，使固液比为1∶12，80℃加热回流提取120min，回收乙醇后，浓缩得到葛根总黄酮组分的干粉。

6、精选三七12重量份，粉碎过8目-40目的药筛，9倍量90％的乙醇60℃回流提取2次，每次1.5h，回收乙醇后得三七总皂苷组分的干粉。

7、将黑豆、葛根和三七分别提取所得的各组分干粉混合均匀，备用。

本发明药物组合物制备方法还可以优选如下步骤：

1、精选900重量份黑豆，蒸馏水清洗干净，25℃浸泡2h后，120℃高压蒸煮灭菌1h，冷却到37℃，干燥为豆渣；

2、按以下比例配置各种培养基：

斜面培养基(体积分数)：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂2％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为1000体积份；

种子培养基(体积分数)：葡萄糖1％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为5000体积份；

固体培养基：步骤1制备获得的所有豆渣，加入一定量PH值为8.0的水，使固体培养基的含水量为70％，121℃灭菌20min待用。

3、将2体积份纳豆枯草芽孢杆菌(10⁶个/ml)接种到步骤2配置的斜面培养基中，30℃培养14h。取一环活化菌种，接入步骤2配置的种子培养基中，30℃，200r/min摇瓶培养14h。

4、取10％的上述种子培养液接种于步骤2所配置的固体培养基中，30℃培养96h，间时拍打，使其均匀生长。固体发酵培养物中按1∶15的体积加入0.9％的生理盐水，4℃浸提24h，5000r/min，离心10min，取上清夜，先加入硫酸铵使饱和度至20％，离心除去杂蛋白，再加入硫酸铵使饱和度至60％，搅拌溶解后冷处静置过夜，离心收集沉淀，沉淀用10mmol/LpH6.4的硫酸缓冲液溶解，后经硫酸铵盐析分离，进行Superdex75凝胶层析，收集活性部分进行SP Sepharose Fast Flow离子交换层析，采用梯度洗脱方法进行洗脱，最后得到高纯度的纳豆激酶回收液，经喷雾干燥后得高纯度纳豆激酶干粉；

5、精选葛根100重量份，粉碎机粉碎，过80目筛，制成葛根粉，72％的(体积分数)乙醇溶液浸泡，使固液比为1∶12，80℃加热回流提取120min，回收乙醇后，浓缩得到葛根总黄酮组分的干粉。

6、精选三七13.5重量份，粉碎过8目-40目的药筛，9倍量80％的乙醇60℃回流提取2次，每次1.5h，回收乙醇后得三七总皂苷组分的干粉。

7、将黑豆、葛根和三七分别提取所得的各组分干粉混合均匀，备用。

本发明药物组合物制备方法还可以优选如下步骤：

1、精选950重量份黑豆，蒸馏水清洗干净，25℃浸泡2h后，120℃高压蒸煮灭菌1h，冷却到37℃，干燥为豆渣；

2、按以下比例配置各种培养基：

斜面培养基(体积分数)：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂2％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为1000体积份；

种子培养基(体积分数)：葡萄糖1％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为5000体积份；

固体培养基：步骤1制备获得的所有豆渣，加入一定量PH值为8.0的水，使固体培养基的含水量为70％，121℃灭菌20min待用。

3、将2体积份纳豆枯草芽孢杆菌(10⁶个/ml)接种到步骤2配置的斜面培养基中，30℃培养14h。取一环活化菌种，接入步骤2配置的种子培养基中，30℃，200r/min摇瓶培养14h。

4、取10％的上述种子培养液接种于步骤2所配置的固体培养基中，30℃培养96h，间时拍打，使其均匀生长。固体发酵培养物中按1∶15的体积加入0.9％的生理盐水，4℃浸提24h，5000r/min，离心10min，取上清夜，先加入硫酸铵使饱和度至20％，离心除去杂蛋白，再加入硫酸铵使饱和度至60％，搅拌溶解后冷处静置过夜，离心收集沉淀，沉淀用10mmol/LpH6.4的硫酸缓冲液溶解，后经硫酸铵盐析分离，进行Superdex75凝胶层析，收集活性部分进行SP Sepharose Fast Flow离子交换层析，采用梯度洗脱方法进行洗脱，最后得到高纯度的纳豆激酶回收液，经喷雾干燥后得高纯度纳豆激酶干粉；

5、精选葛根140重量份，粉碎机粉碎，过80目筛，制成葛根粉，72％的(体积分数)乙醇溶液浸泡，使固液比为1∶12，80℃加热回流提取120min，回收乙醇后，浓缩得到葛根总黄酮组分的干粉。

6、精选三七10.5重量份，粉碎过8目-40目的药筛，9倍量80％的乙醇60℃回流提取2次，每次1.5h，回收乙醇后得三七总皂苷组分的干粉。

7、将黑豆、葛根和三七分别提取所得的各组分干粉混合均匀，备用。

本发明药物组合物制备方法还可以优选如下步骤：

1、精选850重量份黑豆，蒸馏水清洗干净，25℃浸泡2h后，115℃高压蒸煮灭菌1h，冷却到37℃，干燥为豆渣；

2、按以下比例配置各种培养基：

斜面培养基(体积分数)：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂2％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为1000体积份；

种子培养基(体积分数)：葡萄糖1％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为5000体积份；

固体培养基：步骤1制备获得的所有豆渣，加入一定量PH值为8.0的水，使固体培养基的含水量为70％，121℃灭菌20min待用。

3、将2体积份纳豆枯草芽孢杆菌(10⁶个/ml)接种到步骤2配置的斜面培养基中，30℃培养14h。取一环活化菌种，接入步骤2配置的种子培养基中，30℃，200r/min摇瓶培养14h。

4、取10％的上述种子培养液接种于步骤2所配置的固体培养基中，30℃培养96h，间时拍打，使其均匀生长。固体发酵培养物中按1∶15的体积加入0.9％的生理盐水，4℃浸提24h，5000r/min，离心10min，取上清夜，先加入硫酸铵使饱和度至20％，离心除去杂蛋白，再加入硫酸铵使饱和度至60％，搅拌溶解后冷处静置过夜，离心收集沉淀，沉淀用10mmol/LpH6.4的硫酸缓冲液溶解，后经硫酸铵盐析分离，进行Superdex75凝胶层析，收集活性部分进行SP Sepharose Fast Flow离子交换层析，采用梯度洗脱方法进行洗脱，最后得到高纯度的纳豆激酶回收液，经喷雾干燥后得高纯度纳豆激酶干粉；

5、精选葛根130重量份，粉碎机粉碎，过80目筛，制成葛根粉，70％的(体积分数)乙醇溶液浸泡，使固液比为1∶12，80℃加热回流提取120min，回收乙醇后，浓缩得到葛根总黄酮组分的干粉。

6、精选三七12重量份，粉碎过8目-40目的药筛，9倍量90％的乙醇60℃回流提取2次，每次1.5h，回收乙醇后得水蛭素等组分的干粉。

7、将黑豆、葛根和三七分别提取所得的各组分干粉混合均匀，备用。

本发明所述的具有溶栓抗凝、抑制血管平滑肌增殖作用药物组合物，可以采用原料药提取物来投料制备而成，所述原料药组成为：

黑豆提取物280～350重量份  葛根提取物72～120重量份三七提取物4～10重量份。

本发明以黑豆、葛根和三七提取组分为主，具有明显的溶栓抗凝、抑制血管平滑肌增殖作用，可以有效抑制和逆转冠脉支架置入术后再狭窄动物模型的血管狭窄状态，疗效确切，价格适中，作用迅速、时间持久，毒副作用小，并且本发明工艺简单、成本低廉，能耗低，适用于工业化生产。小样本临床研究显示其治疗冠状动脉支架置入术后再狭窄的长期效应优于阿司匹林、尿激酶、链激酶，基本不存在副作用，非常适合患者的长期服用。

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1：药理试验

1、试验方法：

取2月龄的乌克坦小型猪27只，随机分为正常组(9只)、阴性对照组(9只)和治疗组(9只)，三组均在GLP实验室饲养，其中正常组正常饲料饲养，其余两组高胆固醇、高脂肪饲料饲养，饲养时间为310±12d。经形态学显示，两组小型猪冠状动脉管径小于正常小型猪管径70％为冠状动脉狭窄动物模型造膜成功。根据冠脉狭窄情况对阴性对照组和治疗组进行支架置入术治疗，术前及术中接受常规同等处置。术后，治疗组接受实施例1方法制备得到的本发明药物组合物灌胃，其它两组等体积蒸馏水灌胃，治疗15周，发现治疗前后：①治疗前后对模型猪血液高凝状态的改善情况：阴性对照组的CT2.2±0.27min、PT11.1±0.38s、APTT27.5±0.37s、TT14.2±0.12s，治疗组的CT3.4±0.19min、PT12.7±0.27s、APTT33.5±0.14s、TT17.1±0.21s，P＜0.05；

②治疗前后对模型猪血脂的调节作用：阴性对照组的血胆固醇为9.7±0.29mmol/L，甘油三酯为2.5±0.24mmol/L，治疗组的血胆固醇为4.6±0.31mmol/L甘油三酯为1.3±0.16mmol/L，P＜0.05；

③治疗前后对模型猪血液粘稠度的改善情况：阴性对照组的低切全血黏度10.49±0.31，高切全血黏度7.36±0.21，中切全血黏度7.1±0.33，血液黏度1.9±0.23；治疗组的4.6±0.31mmol/L甘油三酯为1.3±0.16mmol/L，P＜0.05；

④治疗前后对模型猪体重增长速度的影响：阴性对照组的体重增加了3.2±0.32kg，治疗组的体重增加了1.7±0.35kg，P＜0.05；

⑤治疗前后对模型猪冠状动脉管径的影响：阴性对照组模型猪的冠状动脉管径是1.1±0.37cm，治疗组模型猪的冠脉动脉管径是1.8±0.27cm，P＜0.05，光镜下冠状动脉血管管径均未见血管平滑肌层的增殖。

实验例2：药理实验

取2月龄的乌克坦小型猪18只，随机分为阳对照组(9只)和治疗组(只)，两组均在GLP实验室饲养，高胆固醇、高脂肪饮食饲养，饲养时间为310±12d，经形态学显示，两组小型猪冠状动脉管径小于正常小型猪管径70％为冠状动脉狭窄动物模型造膜成功。根据冠脉狭窄情况，两组进行支架置入术治疗，术前及术中接受常规同等处置。术后，治疗组接受实施例1方法制备得到的本发明药物组合物灌胃，阳性对照组接受常量阿司匹林灌胃，灌胃10周，发现治疗前后：

①治疗前后对模型猪血液高凝状态的改善情况：阳性对照组的CT3.2±0.21min、PT12.1±0.34s、APTT37.5±0.56s、TT17.2±0.17s，治疗组的CT3.4±0.19min、PT12.6±0.31s、APTT34.3±0.14s、TT17.1±0.19s；

②治疗前后对模型猪血脂的调节作用：阳性对照组的血胆固醇为4.9±0.35mmol/L，甘油三酯为1.6±0.17mmol/L，治疗组的血胆固醇为4.5±0.37mmol/L甘油三酯为1.3±0.43mmol/L；

③治疗前后对模型猪血液粘稠度的改善情况：阳性对照组的低切全血黏度8.45±0.29，高切全血黏度4.63±0.37，中切全血黏度5.1±0.46，血液黏度1.2±0.07；治疗组的低切全血黏度8.11±0.23，高切全血黏度4.16±0.29，中切全血黏度4.88±0.33，血液黏度1.2±0.08；

④治疗前后对模型猪体重增长速度的影响：治疗5周后，阳性对照组的体重增加了2.6±0.32kg，治疗组的体重增加了1.9±0.69kg；

⑤治疗前后对模型猪冠状动脉管径的影响：阳性对照组模型猪的冠状动脉管径是1.5±0.45cm，治疗组模型猪的冠脉动脉管径是1.7±0.47cm，光镜下冠状动脉血管管径均未见血管平滑肌层的增殖。

通过上述实验结果可知，本发明药物组合物在改善冠状动脉支架置入术后再狭窄方面优于经典治疗的阿司匹林，且毒副作用少，价格相对低廉，更适于患者长期服用。

实验例3毒性试验研究

健康Beagle犬72只，6-8月龄，体重9.2±0.9kg，雌雄各半，在清洁实验室饲养，室温控制在22±1.8℃，湿度：60±8％，随机分为4组：高剂量组(正常人体服药剂量的20倍)、中剂量组(正常人体服药剂量的10倍)、低剂量组(正常人体服药剂量的5倍)和空白组。除空白组蒸馏水灌胃以外，其他组本发明药物组合灌胃，连续灌胃9个月，发现犬的一般生命体征平稳，包括体重、摄食、体温、行为活动、外观体征、二便及其他系统的功能均正常，且心电图、血常规、尿常规、凝血试验及其他生化指标均正常，尸解结果显示：机体重要脏器未见毒性反应。

SD雄性大鼠急性毒性试验结果表明，实验例1方法制备的本发明药物组合物灌胃，因无法测出LD₅₀，故进行了最大耐受量的测定，本发明药物组合物对大鼠灌胃的最大耐受量为124.9生药/kg，已远远超过临床用量的55倍，动物未发生不良反应及死亡，且一般状况(二便、呼吸、饮食、自主活动等情况)良好。

急性及长期毒性实验研究显示，本发明无毒副作用，长期服用安全。

实验例4：临床研究

1、方法

该试验研究选取具有冠心病症状、平板运动试验附性、核素心肌显像心肌缺血、冠脉造影显示血管狭窄＜75％，且排除低血压、EF＜30％、心率＜50次/min及伴有II度或III度房室传导阻滞的冠心病患者50例，随机分为两组，每组25例，分别记作A组阳性对照组和B组治疗组，两组治疗前一般资料没有明显差异。两组冠状动脉支架置入术术前3天及术后2个月均接受噻氯匹啶(250mg/次，2次/天)的治疗，其中A组加服肠溶阿司匹林(300mg/次，1次/天)，B组加服本发明药物组合物(1粒/次，两次/天)；术中均静脉注射肝素钠8000-10000U。

2、结果

治疗结束1个月后复查，患者胸闷、胸痛症状缓解率A组为62％，B组为87.3％，两组差异显著，提示本发明药物防止冠状动脉支架置入术后再狭窄引起心肌缺血的效果优于肠溶阿司匹林。治疗结束6个月后，两组患者进行活动平板运动试验，A组有4例患者为阳性，B组有1例患者为阳性，两组之间差异显著，提示本发明预防冠状动脉支架置入术后再狭窄引起心肌缺血的效果优于阿司匹林；两组患者进行超声心动图检测左室射血分数，A组治疗前后为43.3±3.1％/51.7±5.2％，B组治疗前后为44.1±2.7％/60.4±2.9％，两组之间差异不显著，提示本发明增加心脏射血功能方面略优于阿司匹林；两组患者进行冠状动脉造影显示冠状动脉支架置入术后再狭窄(为靶血管直径狭窄＞50％)的发生率，A组为10％，B组为6％，两组之间差异显著，提示本发明预防冠状动脉支架置入术后再狭窄的作用显著优于阿司匹林。

实验例5临床实验

1、实验总结

需行冠状动脉支架术的冠心病患者54例，男女各半，年龄在38-64岁，平均年龄49.3岁；其中不稳定型心绞痛27例，急性心肌梗塞27例，不同程度的伴有糖尿病和/或高血脂和/或脂肪肝等。

临床方法：冠状动脉支架置入术后，服用噻氯匹啶(0.25g/次，2次/日)及本发明药物组合(1粒/次，2次/日)6个月，

疗效评价：症状改善率100％，54例患者冠状动脉支架置入术后经本发明治疗均未发现冠脉再狭窄及心绞痛、心肌梗塞等心脏事件发生。

2、临床个案

1、郑××男44岁。主诉：高血脂病史5年，冠心病病史2酒精肝病史1年，阵发性胸闷、短气2年，阵发性胸痛0.5年，运动或劳累后心绞痛发作持续6min。心电图(静息、动态或负荷试验)显示ST段低平、T波倒置；放射性核素心肌显影(静息或负荷试验)；冠状动脉造影显示，单支冠脉狭窄达65％，病变长度14.2cm。冠状动脉支架置入术后，服用抵克力得(0.25g/次，2次/日)3个月及本发明药物组合(1粒/次，2次/日)7个月，症状完全缓解，超声心动图复查未见再狭窄改变。

2、张××女52岁。主诉：糖尿病病史9年，胸闷憋气、胸痛3年，急性心绞痛发作4次，每次持续3min，胸骨中下段压榨性绞痛，持续10min，近期服用硝酸甘油不缓解。冠状动脉造影显示，双支冠脉狭窄，其中一支血管狭窄达74％，病变长度14.9cm，冠状动脉支架置入术后，服用噻氯匹啶(0.25g/次，2次/日)及本发明药物组合(1粒/次，2次/日)10个月，治疗过程中无临床再狭窄症状及其他心脏事件出现，且心电图及超声心动图检查未见心肌缺血改变。

下述实施例均能实现上述实验例的效果。

实施例1肠溶缓释片剂的制备

黑豆8500g  葛根1300g  三七200g

1、精选8500g黑豆，蒸馏水清洗干净，27℃浸泡2h后，128℃高压蒸煮灭菌1h，冷却到35℃，干燥为豆渣；

2、按以下比例配置各种培养基：

斜面培养基(体积分数)：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂2％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为1000ml；

种子培养基(体积分数)：葡萄糖1％，蛋白胨1％，NaCl0，5％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为5000ml；

固体培养基：步骤1制备获得的所有豆渣，加入一定量PH值为7.8的水，使固体培养基的含水量为68％，125℃灭菌18min待用。

3、将20ml纳豆枯草芽孢杆菌(购自中国医学科学院微生物研究所，HL986，10⁶个/ml)接种到步骤2配置的斜面培养基中，34℃培养18h。取一环活化菌种，接入步骤2配置的种子培养基中，34℃，200r/min摇瓶培养18h，制成种子培养液。

4、取10％的上述种子培养液接种于步骤2所配置的固体培养基中，34℃培养110h，间时拍打，使其均匀生长。固体发酵培养物中按1∶16的体积加入0.9％的生理盐水，4℃浸提27h，5000r/min，离心12min，取上清夜，先加入硫酸铵使饱和度至24％，离心除去杂蛋白，再加入硫酸铵使饱和度至61％，搅拌溶解后冷处静置过夜，离心收集沉淀，沉淀用10mmol/LpH6.4的硫酸缓冲液溶解，后经硫酸铵盐析分离，进行Superdex75凝胶层析，收集活性部分进行SP Sepharose Fast Flow离子交换层析，采用梯度洗脱方法进行洗脱，最后得到高纯度的纳豆激酶回收液，经喷雾干燥后得高纯度纳豆激酶干粉；

5、精选葛根1300g，粉碎机粉碎，过80目筛，制成葛根粉，70％的(体积分数)乙醇溶液浸泡，使固液比为1∶12，75℃加热回流提取110min，回收乙醇后，浓缩得到葛根总黄酮组分的干粉。

6、精选三七200g，粉碎过8目-40目的药筛，9倍量72％的乙醇60℃回流提取2次，每次1.5h，回收乙醇后得三七总皂苷组分的干粉。

7、将黑豆、葛根和三七分别提取所得的各组分干粉混合均匀，添加肠溶型辅料，包裹制成片剂。

实施例2肠溶胶囊的制备

黑豆12000g  葛根2000g  三七80g

1、精选12000g黑豆，蒸馏水清洗干净，26℃浸泡2h后，123℃高压蒸煮灭菌1.5h，冷却到34℃，干燥为豆渣；

2、按以下比例配置各种培养基：

斜面培养基(体积分数)：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂2％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为10000ml；

种子培养基(体积分数)：葡萄糖1％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为50000ml；

固体培养基：步骤1制备获得的所有豆渣，加入一定量PH值为7.6的水，使固体培养基的含水量为66％，125℃灭菌25min待用。

3、将20ml纳豆枯草芽孢杆菌(购自中国医学科学院微生物研究所，HL986，10⁶个/ml)接种到步骤2配置的斜面培养基中，34℃培养20h。取一环活化菌种，接入步骤2配置的种子培养基中，34℃，220r/min摇瓶培养20h，制成种子培养液。

4、取10％的上述种子培养液接种于步骤2所配置的固体培养基中，34℃培养110h，间时拍打，使其均匀生长。固体发酵培养物中按1∶13的体积加入0.9％的生理盐水，4℃浸提30h，5000r/min，离心15min，取上清液，先加入硫酸铵使饱和度至25％，离心除去杂蛋白，再加入硫酸铵使饱和度至64％，搅拌溶解后冷处静置过夜，离心收集沉淀，沉淀用10mmol/LpH6.4的硫酸缓冲液溶解，后经硫酸铵盐析分离，进行Superdex75凝胶层析，收集活性部分进行SP Sepharose Fast Flow离子交换层析，采用梯度洗脱方法进行洗脱，最后得到高纯度的纳豆激酶回收液，经喷雾干燥后得高纯度纳豆激酶干粉；

5、精选葛根2000g，粉碎机粉碎，过80目筛，制成葛根粉，75％的(体积分数)乙醇溶液浸泡，使固液比为1∶12，80℃加热回流提取120min，回收乙醇后，浓缩得到葛根总黄酮组分的干粉。

6、精选三七80g，粉碎过8目-40目的药筛，10倍量68％的乙醇62℃回流提取3次，每次1.5h，回收乙醇后得三七总皂苷组分的干粉。

7、将黑豆、葛根和三七分别提取所得的各组分干粉混合均匀，添加淀粉和其它辅料，装肠溶型胶囊，抛光即成。

实施例3丸剂

黑豆10000g  葛根1500g  三七100g

1、精选10000g黑豆，蒸馏水清洗干净，27℃浸泡2.5h后，130℃高压蒸煮灭菌1h，冷却到36℃，干燥为豆渣；

2、按以下比例配置各种培养基：

斜面培养基(体积分数)：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂2％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为10000ml；

种子培养基(体积分数)：葡萄糖1％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为50000ml；

固体培养基：步骤1制备获得的所有豆渣，加入一定量PH值为7.4的水，使固体培养基的含水量为68％，125℃灭菌23min待用。

3、将20ml纳豆枯草芽孢杆菌(购自中国医学科学院微生物研究所，HL986，10⁶个/ml)接种到步骤2配置的斜面培养基中，33℃培养20h。取一环活化菌种，接入步骤2配置的种子培养基中，33℃，200r/min摇瓶培养20h，制成种子培养液。

4、取10％的上述种子培养液接种于步骤2所配置的固体培养基中，33℃培养110h，间时拍打，使其均匀生长。固体发酵培养物中按1∶14的体积加入0.9％的生理盐水，4℃浸提26h，5000r/min，离心11min，取上清液，先加入硫酸铵使饱和度至25％，离心除去杂蛋白，再加入硫酸铵使饱和度至62％，搅拌溶解后冷处静置过夜，离心收集沉淀，沉淀用10mmol/LpH6.4的硫酸缓冲液溶解，后经硫酸铵盐析分离，进行Superdex75凝胶层析，收集活性部分进行SP Sepharose Fast Flow离子交换层析，采用梯度洗脱方法进行洗脱，最后得到高纯度的纳豆激酶回收液，经喷雾干燥后得高纯度纳豆激酶干粉；

5、精选葛根1500g，粉碎机粉碎，过80目筛，制成葛根粉，75％的(体积分数)乙醇溶液浸泡，使固液比为1∶14，70℃加热回流提取130min，回收乙醇后，浓缩得到葛根总黄酮组分的干粉。

6、精选三七100g，粉碎过8目-40目的药筛，10倍量70％的乙醇65℃回流提取3次，每次1.5h，回收乙醇后得三七总皂苷组分的干粉。

7、将黑豆、葛根和三七分别提取所得的各组分干粉混合均匀后，添加肠溶剂进行包裹，按照常规方法制成肠溶型丸剂。

实施例4肠溶膜剂

黑豆12000g  葛根1000g  三七100g

1、精选12000g黑豆，蒸馏水清洗干净，22℃浸泡2h后，121℃高压蒸煮灭菌1h，冷却到33℃，干燥为豆渣；

2、按以下比例配置各种培养基：

斜面培养基(体积分数)：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂2％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为10000ml；

种子培养基(体积分数)：葡萄糖1％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为50000ml；

固体培养基：步骤1制备获得的所有豆渣，加入一定量PH值为7.5的水，使固体培养基的含水量为65％，120℃灭菌25min待用。

3、将20ml纳豆枯草芽孢杆菌(购自中国医学科学院微生物研究所，HL986，10⁶个/ml)接种到步骤2配置的斜面培养基中，35℃培养16h。取一环活化菌种，接入步骤2配置的种子培养基中，35℃，200r/min摇瓶培养16h，制成种子培养液。

4、取10％的上述种子培养液接种于步骤2所配置的固体培养基中，35℃培养90h，间时拍打，使其均匀生长。固体发酵培养物中按1∶16的体积加入0.9％的生理盐水，4℃浸提26h，5000r/min，离心12min，取上清夜，先加入硫酸铵使饱和度至25％，离心除去杂蛋白，再加入硫酸铵使饱和度至65％，搅拌溶解后冷处静置过夜，离心收集沉淀，沉淀用10mmol/LpH6.4的硫酸缓冲液溶解，后经硫酸铵盐析分离，进行Superdex75凝胶层析，收集活性部分进行SP Sepharose Fast Flow离子交换层析，采用梯度洗脱方法进行洗脱，最后得到高纯度的纳豆激酶回收液，经喷雾干燥后得高纯度纳豆激酶干粉；

5、精选葛根1000g，粉碎机粉碎，过80目筛，制成葛根粉，74％的(体积分数)乙醇溶液浸泡，使固液比为1∶13，75℃加热回流提取130min，回收乙醇后，浓缩得到葛根总黄酮组分的干粉。

6、精选三七100g，粉碎过8目-40目的药筛，8倍量75％的乙醇65℃回流提取3次，每次1.5h，回收乙醇后得三七总皂苷组分的干粉。

7、将黑豆、葛根和三七分别提取所得的各组分干粉混合均匀后制成颗粒，添加肠溶剂进行包裹，按照常规方法制成肠溶型膜剂。

实施例5口服液

黑豆8000g  葛根900g  三七200g

1、精选8000g黑豆，蒸馏水清洗干净，25℃浸泡2h后，120℃高压蒸煮灭菌1h，冷却到37℃，干燥为豆渣；

2、按以下比例配置各种培养基：

斜面培养基(体积分数)：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂2％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为10000ml；

种子培养基(体积分数)：葡萄糖1％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为50000ml；

固体培养基：步骤1制备获得的所有豆渣，加入一定量PH值为8.0的水，使固体培养基的含水量为70％，121℃灭菌20min待用。

3、将20ml纳豆枯草芽孢杆菌(购自中国医学科学院微生物研究所，HL986，10⁶个/ml)接种到步骤2配置的斜面培养基中，30℃培养14h。取一环活化菌种，接入步骤2配置的种子培养基中，30℃，200r/min摇瓶培养14h，制成种子培养液。

4、取10％的上述种子培养液接种于步骤2所配置的固体培养基中，30℃培养96h，间时拍打，使其均匀生长。固体发酵培养物中按1∶15的体积加入0.9％的生理盐水，4℃浸提24h，5000r/min，离心10min，取上清夜，先加入硫酸铵使饱和度至20％，离心除去杂蛋白，再加入硫酸铵使饱和度至60％，搅拌溶解后冷处静置过夜，离心收集沉淀，沉淀用10mmol/LpH6.4的硫酸缓冲液溶解，后经硫酸铵盐析分离，进行Superdex75凝胶层析，收集活性部分进行SP Sepharose Fast Flow离子交换层析，采用梯度洗脱方法进行洗脱，最后得到高纯度的纳豆激酶回收液，经喷雾干燥后得高纯度纳豆激酶干粉；

5、精选葛根900g，粉碎机粉碎，过80目筛，制成葛根粉，60％的(体积分数)乙醇回流提取，固液比为1g/25ml，700W微波间歇辐射3次，每次40s；大孔树脂吸附后，70％乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇，浓缩干燥。

6、精选三七200g，粉碎过8目-40目的药筛，9倍量80％的乙醇60℃回流提取2次，每次1.5h，回收乙醇后得三七总皂苷组分的干粉。

7、将黑豆、葛根和三七分别提取所得的各组分干粉混合均匀后，添加200ml蜂蜜和8000ml蒸馏灭菌水，按照常规方法制成口服液体制剂。

实施例6口服液

黑豆13000g  葛根1500g  水蛭130g

1、精选13000g黑豆，蒸馏水清洗干净，25℃浸泡2h后，120℃高压蒸煮灭菌1h，冷却到37℃，干燥为豆渣；

2、按以下比例配置各种培养基：

斜面培养基(体积分数)：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂2％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为10000ml；

种子培养基(体积分数)：葡萄糖1％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为50000ml；

固体培养基：步骤1制备获得的所有豆渣，加入一定量PH值为8.0的水，使固体培养基的含水量为70％，121℃灭菌20min待用。

3、将20ml纳豆枯草芽孢杆菌(购自中国医学科学院微生物研究所，HL986，10⁶个/ml)接种到步骤2配置的斜面培养基中，30℃培养14h。取一环活化菌种，接入步骤2配置的种子培养基中，30℃，200r/min摇瓶培养14h。

4、取10％的上述种子培养液接种于步骤2所配置的固体培养基中，30℃培养96h，间时拍打，使其均匀生长。固体发酵培养物中按1∶15的体积加入0.9％的生理盐水，4℃浸提24h，5000r/min，离心10min，取上清夜，先加入硫酸铵使饱和度至20％，离心除去杂蛋白，再加入硫酸铵使饱和度至60％，搅拌溶解后冷处静置过夜，离心收集沉淀，沉淀用10mmol/LpH6.4的硫酸缓冲液溶解，后经硫酸铵盐析分离，进行Superdex75凝胶层析，收集活性部分进行SP Sepharose Fast Flow离子交换层析，采用梯度洗脱方法进行洗脱，最后得到高纯度的纳豆激酶回收液，经喷雾干燥后得高纯度纳豆激酶干粉；

5、精选葛根1500g，粉碎机粉碎，过80目筛，制成葛根粉，60％的(体积分数)乙醇回流提取，固液比为1g/25ml，700W微波间歇辐射3次，每次40s；大孔树脂吸附后，70％乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇，浓缩干燥。

6、精选三七130g，粉碎过8目-40目的药筛，9倍量80％的乙醇60℃回流提取2次，每次1.5h，回收乙醇后得三七总皂苷组分的干粉。

7、将黑豆、葛根和三七分别提取所得的各组分干粉混合均匀后，添加200ml蜂蜜和800ml蒸馏灭菌水，按照常规方法制成口服液体制剂。

Claims (12)

1.一种防治冠状动脉支架置入术后再狭窄的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料组成为：

黑豆600～1200重量份葛根重量70～200份三七8～20重量份。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料组成为：

黑豆800～1000重量份葛根重量90～150份三七8～20重量份。

3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料组成为：

黑豆1200重量份葛根重量份100三七10重量份。

4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料组成为：

黑豆1000重量份葛根150重量份三七10重量份。

5.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料组成为：

黑豆1100重量份葛根140重量份三七12重量份。

6.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料组成为：

黑豆600重量份葛根120重量份三七20重量份。

7.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料组成为：

黑豆850重量份葛根130重量份三七18重量份。

8.如权利要求1-7任一所述的药物组合物，其特征在于取原料药经常规工艺提取有效组分后，加入常规辅料制成肠溶型片剂、胶囊剂、丸剂、膜剂和口服液体制剂。

9.如权利要求1-7任一所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

黑豆的制备：

A、精选黑豆，蒸馏水清洗干净，20-30℃浸泡1-3后，120-140℃高压蒸煮灭菌0.5-1.5h，冷却到30-40℃，干燥为豆渣；

B、按以下比例配置各种培养基：

斜面培养基：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，NaCL 0.5％，琼脂2％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为1000体积份；

种子培养基：葡萄糖1％，蛋白胨1％，NaCL 0.5％，pH值控制在7.2-7.4，总体积为5000体积份；

固体培养基：步骤A制备获得的所有豆渣，加入PH值为8.0的水，使固体培养基的含水量为70％，121℃灭菌20min待用；

C、将10⁶个/ml的2体积份纳豆枯草芽孢杆菌接种到步骤B配置的斜面培养基中，30℃培养14h；取该斜面培养基中培养活化菌种，接入步骤B配置的种子培养基中，30℃，200r/min摇瓶培养14h，制得种子培养液；

D、取10％的步骤C种子培养液接种于步骤B所配置的固体培养基中，30℃培养96h，间时拍打，使其均匀生长；固体发酵培养物中按1∶15的体积加入0.9％的生理盐水，4℃浸提24h，5000r/min，离心10min，取上清夜，先加入硫酸铵使饱和度至20％，离心除去杂蛋白，再加入硫酸铵使饱和度至60％，搅拌溶解后冷处静置过夜，离心收集沉淀，沉淀用10mmol/LpH6.4的硫酸缓冲液溶解，后经硫酸铵盐析分离，进行Superdex75凝胶层析，收集活性部分进行SP Sepharose Fast Flow离子交换层析，采用梯度洗脱方法进行洗脱，最后得到高纯度的纳豆激酶回收液，经喷雾干燥后得高纯度纳豆激酶干粉；

葛根的制备：

E、葛根粉碎机粉碎，过筛，制成葛根粉，60-80％的乙醇溶液浸泡，使固液比为1∶10-14，70-85℃加热回流提取110-130min，回收乙醇后，浓缩得到干粉；

的制备：

F、三七粉碎过8目-40目的药筛，8-12倍65-75％的乙醇50-70℃回流提取3次，每次1-2h，回收乙醇浓缩干燥得三七总皂苷干粉。

G、将黑豆、葛根和三七分别提取所得的各组分干粉混合均匀，备用。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于该方法中黑豆采用如下方法制备：

A、取黑豆，蒸馏水清洗干净，20-30℃浸泡1-3h后，120-140℃高压蒸煮灭菌0.5-1.5h，冷却到30-40℃，干燥为豆渣，作为配置各种培养基的原料；

B、按以下比例配置各种培养基：

斜面培养基：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂2％，pH值控制在7.0-7.4，总体积为1000体积份；

种子培养基：葡萄糖1％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，pH值控制在7.0-7.4，总体积为5000体积份；

基础发酵培养基：麦芽糖2％，蛋白胨2％，NaCl 0.5％或CaCl₂0.5％，pH7.0-7.4，总体积为10000体积份；

C、将10⁶个/ml 2体积份纳豆枯草芽孢杆菌接种到步骤B配置的斜面培养基中，30-37℃培养14-24h；取一环活化菌种，接入步骤B配置的种子培养基中，30-37℃，200r/min摇瓶培养14-24h，制成种子培养液；取2体积的种子培养液加入到步骤B配置的基础发酵培养基中，30-37℃，200r/min摇瓶培养3d，收集发酵液5000r/min离心10min，收集上清液；

D、收集的上清液中加入硫酸铵使饱和度至20％，离心除去杂蛋白，再加入硫酸铵使饱和度至60％，搅拌溶解后冷处静置过夜，离心收集沉淀，沉淀用10mmol/LpH6.4的硫酸缓冲液溶解，后经硫酸铵盐析分离，进行Superdex75凝胶层析，收集活性部分进行SP Sepharose Fast Flow离子交换层析，采用梯度洗脱方法进行洗脱，最后得到高纯度的纳豆激酶回收液，经喷雾干燥后得高纯度纳豆激酶干粉。

11.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于该方法中葛根采用如下方法制备：

葛根50-70％的乙醇回流提取，固液比为1g/25ml，600-800W微波间歇辐射2-4次，每次30-50s；大孔树脂吸附后，60-80％乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇，浓缩干燥得高纯度葛根总黄酮。

12.如权利要求1-7任一所述的药物组合物在制备具有溶栓、抗凝或抑制血管平滑肌增殖作用的药物中的应用。