CN107998313A - 一种治疗痛风病的中药酵素及其制备方法 - Google Patents

一种治疗痛风病的中药酵素及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种治疗痛风病的中药酵素，是由中药原料经复合菌发酵制成的酵素，所述中药原料包括：东革阿里、薏苡仁、黄柏、牛膝、苍术、威灵仙、车前子、川芎、珠子草、桂枝8‑15重量份、红花、鸡矢藤、丹参、土茯苓、金钱草、五加皮、乳香、千年健份、没药、连翘；所述复合菌包括浓度为1.0×108～2.5×108CFU/mL的酵母菌和浓度为2.0×108～3.2×108CFU/mL的醋酸菌。本发明还公开了一种治疗痛风病的中药酵素的制备方法。本发明通过引入多菌共生技术，对多种中药发酵后制成中药酵素，改进治疗直肠的中药的用药方式，得到小分子中药酵素，降低中药对肠胃的刺激作用、提高中药中有益成分的吸收率。

Description

一种治疗痛风病的中药酵素及其制备方法
技术领域
本发明属于生物酶制剂技术领域，具体涉及一种治疗痛风病的中药酵素及其制备方法。
背景技术
痛风是嘌呤代谢紊乱致尿酸生成增多和/或尿酸排泄减少所引起的一组疾病。人之所以发生痛风是人类缺乏尿酸分解酶的结果。人由于缺乏将尿酸再分解的分解酶,故不可能将尿酸氧化成可溶解的尿囊素，嘌呤分解代谢的最终产物是尿酸，他是一种在体液中溶解度极低的的化合物。当嚓吟代谢发生紊乱时，就必然会导致尿酸生成过多，从而引起高尿酸血症，而痛风发病的先决条件是高尿酸血症。痛风的一切临床表现，皆由其钠盐从超饱和的细胞外液析出并沉积于组织引起。目前公认急性痛风性关节炎的发作是由于尿酸浓度过高，并超过了尿酸的溶解度而呈过和状态，致使尿酸钠微晶体在软骨、关节滑膜及周围组织沉淀而引起的非特异性炎症反应。通风病的主要危害是痛风性关节炎反复发作、痛风石形成引起关节破坏，丧失功能活动，严重时可造成残疾并引发肾脏损害，痛风还常伴腹型肥胖、高脂血症、高血压、2型糖尿病及心血管病等表现。。近些年来，痛风的发病率不断升高，并出现年轻化趋势而治疗方面并未有较大突破。
在临床治疗上，西医常用的药物有秋水仙碱、非甾体类抗炎药、糖皮质激素和促肾上腺皮质激素和抑制剂等，由于这些药物的不良反应多，临床使用受到限制。中医中药因其辨证论治、灵活多变、副作用小等特点在痛风治疗上显示出较大优势并取得良好效果；目前许多学者致力于中药治疗痛风的药效研究，以期寻求高效低毒的抗痛风药物。传统的中药大多是采用汤药或颗粒制剂等形式，传统的药剂方式导致中药利用率低、中药苦口、气味难闻、农药残留等弊端。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种治疗痛风病的中药酵素，通过引入多菌共生技术，对多种中药发酵后制成中药酵素，改进治疗痛风病中药的用药方式，得到小分子中药酵素，改善中药的口感、降低中药对肠胃的刺激作用、提高中药中有益成分的吸收率。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种治疗痛风病的中药酵素，是由中药原料经复合菌发酵制成的酵素；
所述中药原料包括：东革阿里3-10重量份、薏苡仁15～30重量份、黄柏8-15重量份、牛膝5-15重量份、苍术10-20重量份、威灵仙5-15重量份、车前子15-30重量份、川芎12-20重量份、珠子草10-20重量份、桂枝8-15重量份、红花5-15重量份、鸡矢藤10-25重量份、丹参12-25重量份、土茯苓15-30重量份、金钱草10-25重量份、五加皮10-20重量份、乳香5-15重量份、千年健8-15重量份、没药5-15重量份、连翘5-15重量份；
所述复合菌包括浓度为1.0×108～2.5×108CFU/mL的酵母菌和浓度为2.0×108～3.2×108CFU/mL的醋酸菌。
作为进一步的方案，本发明所述的中药原料还包括追地风8～18重量份、延胡索5-15重量份、肾茶8-15重量份。
作为进一步的方案，本发明所述的东革阿里为红东革阿里、黄东革阿里、黑东革阿里中的一种或两种以上混合。
作为进一步的方案，本发明所述的中药原料包括：东革阿里5-8重量份、薏苡仁20～25重量份、黄柏10-15重量份、牛膝8-12重量份、苍术12-18重量份、威灵仙8-12重量份、车前子18-25重量份、川芎15-18重量份、珠子草12-18重量份、桂枝10-12重量份、红花8-12重量份、鸡矢藤15-20重量份、丹参15-20重量份、土茯苓20-25重量份、金钱草15-20重量份、五加皮12-18重量份、乳香8-12重量份、千年健10-15重量份、没药8-12重量份、连翘8-12重量份、追地风10～15重量份、延胡索8-12重量份、肾茶10-15重量份。
作为进一步的方案，本发明所述的中药原料包括：红东革阿里5重量份、黑东革阿里5份、薏苡仁22重量份、黄柏12重量份、牛膝10重量份、苍术15重量份、威灵仙10重量份、车前子20重量份、川芎15重量份、珠子草15重量份、桂枝10重量份、红花10重量份、鸡矢藤18重量份、丹参18重量份、土茯苓22重量份、金钱草18重量份、五加皮15重量份、乳香10重量份、千年健12重量份、没药10重量份、连翘10重量份、追地风12重量份、延胡索10重量份、肾茶12重量份。
作为进一步的方案，本发明所述的复合菌还包括浓度为1.2×108～2.5×108CFU/mL乳酸菌。
本发明的另一目的在于提供一种治疗痛风病的中药酵素的制备方法，通过该方法获得口感好、胃肠刺激作用小的中药酵素。具体方案如下。
一种治疗痛风病的中药酵素的制备方法，包括
超声萃取步骤：按照比例将所述中药原料经过干燥后再分别粉碎得到中药粉末，中药粉末中加水搅拌均匀，然后将每种中药粉末单独用超声萃取，得到中药萃取物；
酶解步骤：将上述得到的每种中药萃取物混合后加入复合酶进行酶解，得到酶解液；
灭菌步骤：将上述酶解液在灭菌器中进行灭菌处理；
菌种活化和培养步骤：分别用液体培养基溶解酵母菌粉和醋酸菌，振荡使菌体溶解成悬浮液状态，然后将菌液在YDP培养基上进行涂布，酵母菌接种于PDA培养基在30℃恒温培养箱内培养2-3天，经过2次继代培养，菌液待用；醋酸菌接种于基础培养基活化1-2天，经过2次继代培养，菌液待用；
接种、发酵步骤：将上述酶解液浓缩至可溶性固形物含量为30-37％，在浓缩后的酶解液接种1.2-2.0％的酵母菌和1.0-1.2％醋酸菌后先在20-25℃温度下摇床发酵，然后在28-30℃温度下静置发酵，得到发酵液；
真空冷冻干燥：上述发酵液浓缩至重量为15-22％后转入到真空干燥器中进行真空冷冻干燥；得到粉末状的中药酵素。
作为进一步的方案，本发明所述的超声萃取步骤中，采用20kHz的低频超声萃取8-12分钟，所述中药粉末与水的料液比为1：(100-400)。
作为进一步的方案，本发明所述的酶解步骤中，采用的复合酶的加酶量为100-150μg/g，所述复合酶是质量比为1:1：(2-5)的果胶酶、蛋白酶、纤维素酶；酶解的时间为8-12小时，酶解的温度控制在45-52℃，酶解液的pH值为5.5-5.8。
一种治疗痛风病的中药酵素的制备方法，包括
超声萃取步骤：按照比例将所述中药原料经过干燥后再分别粉碎得到中药粉末，中药粉末中加水搅拌均匀，然后在每种中药粉末单独用超声萃取，得到中药萃取物；
酶解步骤：将上述得到的每种中药萃取物混合后加入复合酶进行酶解，得到酶解液；
菌种活化和培养步骤：分别用液体培养基溶解酵母菌粉和醋酸菌，振荡使菌体溶解成悬浮液状态，然后将菌液在YDP培养基上进行涂布，酵母菌接种于PDA培养基在30℃恒温培养箱内培养2-3天，经过2次继代培养，菌液待用；醋酸菌接种于基础培养基活化1-2天，经过2次继代培养，菌液待用；乳酸菌接种于MRS培养基在温度37℃下活化l-2天，经过2次继代培养，菌液待用；
接种、发酵步骤：将上述酶解液浓缩至可溶性固形物含量为30-37％，在浓缩后的酶解液接种1.2-2.0％的酵母菌、1.0-1.2％醋酸菌、1.2-1.5％乳酸菌后先在20-25℃温度下摇床发酵，然后在28-30℃温度下静置发酵，最后在35-40℃温度下继续发酵得到发酵液；
真空冷冻干燥：上述发酵液浓缩至重量为15-22％后转入到真空干燥器中进行真空冷冻干燥；得到粉末状的中药酵素。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明所述的中药酵素，改进治疗痛风病中药的用药方式，得到小分子中药酵素，改善了传统中药苦涩的口感，降低中药对肠胃的刺激作用、提高了中药中有益成分的吸收率；
2.本发明所述的中药酵素，用于治疗或防止痛风病，同时相对于西药具有成本低、副作用小、易吸收等优点；
3.本发明所述的中药酵素也可以联合治疗痛风病的西药用药。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
本发明所述的治疗痛风病的中药酵素，是由中药原料经复合菌发酵制成的酵素；
所述中药原料包括：东革阿里3-10重量份、薏苡仁15～30重量份、黄柏8-15重量份、牛膝5-15重量份、苍术10-20重量份、威灵仙5-15重量份、车前子15-30重量份、川芎12-20重量份、珠子草10-20重量份、桂枝8-15重量份、红花5-15重量份、鸡矢藤10-25重量份、丹参12-25重量份、土茯苓15-30重量份、金钱草10-25重量份、五加皮10-20重量份、乳香5-15重量份、千年健8-15重量份、没药5-15重量份、连翘5-15重量份；
所述复合菌包括浓度为1.0×108～2.5×108CFU/mL的酵母菌和浓度为2.0×108～3.2×108CFU/mL的醋酸菌。
作为进一步的方案，本发明所述的中药原料还包括追地风8～18重量份、延胡索5-15重量份、肾茶8-15重量份。
在本发明中，所采用的东革阿里(Eurycoma longifolia)又名Tongkat Ali，为苦木科野生灌木植物，主要分布于东南亚，性凉，味苦，具有强肾、促进生育、抗癌、治疗前列腺炎、退热和抗疟疾等功效；是马来西亚的民间用药历史显示东革阿里具有较好的治疗痛风作用；研究发现东革阿里提取物可降低尿酸钠诱致的大鼠痛风性关节炎模型的大鼠痛感。薏苡仁富含淀粉、蛋白质、多种维生素及人体所需的多种氨基酸，从薏苡仁热提取物分得的中性多糖葡聚糖混合物及酸性多糖均具有示抗补体活性。黄柏水浸液对二甲苯所致的鼠肿胀有明显的抗炎作用，而且在健康豚鼠化腐生肌实验中发现，黄柏冷敷剂对金黄色葡萄球菌感染的破脶皮肤也有明显的抗炎作用；研究发现，黄柏及其不同炮制品均能明显降低高尿酸血症模型大鼠的尿酸和肌酐水平，并能抑制急性痛风关节炎模型大鼠的关节肿胀。苍术中的有效成分芹烷二烯酮、苍术烯内酯Ⅰ有毛细管透过性亢进的抑制作用和抗炎作用，苍术烯内酯Ⅱ、Ⅲ也具有抗炎活性。牛膝，别名：牛磕膝，(Achyranthes bidentata Blume.)苋科、牛膝属多年生草本，根入药，生用，活血通经；治产后腹痛，月经不调，闭经，鼻衄，虚火牙痛，脚气水肿；熟用，补肝肾，强腰膝；治腰膝酸痛，肝肾亏虚，跌打瘀痛；现代医学研究发现牛膝不同炮制品均具有镇痛抗炎作用。威灵仙(学名Clematis chinensis Osbeck)是毛茛科，铁线莲属多年生木质藤本，其根及茎入药具有祛风湿、通经络、消骨梗之功效；威灵仙中的总皂苷具有显著降低动物血清尿酸水平的作用，可用于制备抗高尿酸血症及痛风的药物。车前子的种子含多量黏液、车前子酸(Planterolic acid)、车前子甙(Plantaginin)、车前烯醇酸(Plantenolic acid)、琥珀酸(Succinic acid)、腺嘌呤(Adenine或6-Aminopurine)、胆碱(Choline)、梓醇(Catalpol)、蛋白质及各种脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸、花生酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等)，黏液中含酸性黏多糖车前聚糖(Plantasan)，车前子能使水分、氯化钠、尿素及尿酸排出增多而有利尿作用，研究发现车前草有促使家兔关节囊滑膜结缔组织增生作用，从而使松弛了的关节囊恢复原有的紧张度。川芎(学名：Ligusticumchuanxiong hort)，常用于活血行气，祛风止痛。珠子草拉丁学名：Phyllanthus niruriLinn.属名：叶下珠属科名：大戟科俗名别名：蛇仔草，珠子草额提取物对氧嗪酸钾及尿酸诱导的高尿酸血症大鼠有显著的降血尿酸作用，进一步研究其降血尿酸作用主要是通过促进尿酸排泄，抑制黄嘌呤氧化酶活性这两个途径实现的。桂枝是肉桂的干燥嫩枝，桂枝辛温，可祛风寒；桂枝能发汗解表，温经通脉，助阳化气，散寒止痛。红花，(拉丁学名：Carthamustinctorius L.)，别名：红蓝花、刺红花，菊科、红花属植物，有活血化瘀，散湿去肿的功效。鸡矢藤，又名鸡屎藤，为茜草科植物鸡矢藤的全草，夏季采收全草，晒干。其味甘、微苦，性平；具有祛风利湿，止痛解毒，消食化积，活血消肿之功效；用于风湿筋骨痛，跌打损伤，外伤性疼痛；其主要活性成份为鸡矢藤苷、鸡矢藤次苷、车叶草苷、γ-谷甾醇及挥发油等；现代中研究发现鸡矢藤可有效保护滑膜组织的炎性损伤而到抗痛风的作用。丹参，为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈之功效；丹参根部提取出紫草酸，体外实验证实该成分可抑制黄嘌呤氧化酶活性，并且对氧嗓酸盐引起的尿酸升高及尿酸盐引起的大鼠足垫肿胀具有治疗作用。金钱草，别名：过路黄、镜面草、翠屏草、荷苞草、肉馄饨草、金锁匙、连钱草、对座草、叶金钱草、钱叶草，钱芊金等，有清热利尿、祛风止痛、止血生肌、消炎解毒、杀虫之功；金钱草水提取物给予高尿酸血症模型小鼠给药，结果表明金钱草水提物对高尿酸血症小鼠具有降低血清尿酸水平的作用。五加皮为五加科植物细柱五加的干燥根皮有祛风湿，补益肝肾，强筋壮骨，利水消肿的作用。乳香，为橄榄科植物乳香树同属植物树皮渗出的树脂，活血行气止痛，消肿生肌之功效。肾茶，又名猫须草、猫须公、苞须花，“牙努秒”，属于唇形科肾茶属，多年生草本；全草含三萜类，甾醇类，黄酮类，其中肾茶所含的主要活性成分为迷迭香酸、熊果酸、黄酮类及肌醇等，其抗炎的特效成分为迷迭香酸；研究发现，肾茶的抗炎作用主要与迷迭香酸和熊果酸成分有关，肾茶具有明显的抗炎作用，抗炎机制可能与抑制花生四烯酸代谢中的5-脂氧酶和对补体依赖性PGI的合成有抑制作用相关；猫须草中含丰富的多酚，可提高车前子提取物的亲水性，从而提高利尿和排尿酸的作用。千年键，为天南星科植物，有祛风湿，壮筋骨的功效。没药为橄榄科植物地丁树的干燥树脂，具有散瘀定痛，消肿生肌之功效。连翘是木樨科连翘属植物，具有清心解热，消肿散结，利尿等功效。追地风又名桐叶藤、利筋藤、地风皮，是木兰科八角属常绿灌木，具有祛风除湿，行气止痛之功效。在本发明中，通过上述多种中药配伍，其功能之间存在相互协同增效的作用。
在本发明中所采用的东革阿里为红东革阿里、黄东革阿里、黑东革阿里中的一种或两种以上混合。黄东革阿里入脾胃和补益之功效；黑东革阿里又名野山黑金刚，红东革阿里和黑东革阿里均具有可补中益神、壮阳、助肾强、利尿、治水肿的功效，对腰腿疼痛、关节炎、体弱乏力者效果显著。这三者中其中数黑东革阿里的功效最为显著。因此在本发明中选择黑东革阿里与黄东革阿里或红东革阿里混合使用效果最佳。
作为进一步的方案，本发明所述的中药原料包括：东革阿里5-8重量份、薏苡仁20～25重量份、黄柏10-15重量份、牛膝8-12重量份、苍术12-18重量份、威灵仙8-12重量份、车前子18-25重量份、川芎15-18重量份、珠子草12-18重量份、桂枝10-12重量份、红花8-12重量份、鸡矢藤15-20重量份、丹参15-20重量份、土茯苓20-25重量份、金钱草15-20重量份、五加皮12-18重量份、乳香8-12重量份、千年健10-15重量份、没药8-12重量份、连翘8-12重量份、追地风10～15重量份、延胡索8-12重量份、肾茶10-15重量份。
作为进一步的方案，本发明所述的中药原料包括：红东革阿里5重量份、黑东革阿里5份、薏苡仁22重量份、黄柏12重量份、牛膝10重量份、苍术15重量份、威灵仙10重量份、车前子20重量份、川芎15重量份、珠子草15重量份、桂枝10重量份、红花10重量份、鸡矢藤18重量份、丹参18重量份、土茯苓22重量份、金钱草18重量份、五加皮15重量份、乳香10重量份、千年健12重量份、没药10重量份、连翘10重量份、追地风12重量份、延胡索10重量份、肾茶12重量份。
作为进一步的方案，本发明所述的复合菌还包括浓度为1.2×108～2.0×108CFU/mL乳酸菌。
本发明的另一目的在于提供一种治疗痛风病的中药酵素的制备方法，通过该方法获得口感好、胃肠刺激作用小的中药酵素。具体方案如下。
一种治疗痛风病的中药酵素的制备方法，包括
超声萃取步骤：按照比例将所述中药原料经过干燥后再分别粉碎得到中药粉末，中药粉末中加水搅拌均匀，然后将每种中药粉末单独用超声萃取，得到中药萃取物；
酶解步骤：将上述得到的每种中药萃取物混合后加入复合酶进行酶解，得到酶解液；
灭菌步骤：将上述酶解液在灭菌器中进行灭菌处理；
菌种活化和培养步骤：分别用液体培养基溶解酵母菌粉和醋酸菌，振荡使菌体溶解成悬浮液状态，然后将菌液在YDP培养基上进行涂布，酵母菌接种于PDA培养基在30℃恒温培养箱内培养2-3天，经过2次继代培养，菌液待用；醋酸菌接种于基础培养基活化1-2天，经过2次继代培养，菌液待用；
接种、发酵步骤：将上述酶解液浓缩至可溶性固形物含量为30-37％，在浓缩后的酶解液接种1.2-2.0％的酵母菌和1.0-1.2％醋酸菌后先在20-25℃温度下摇床发酵，然后在28-30℃温度下静置发酵，得到发酵液；
真空冷冻干燥：上述发酵液浓缩至重量为15-22％后转入到真空干燥器中进行真空冷冻干燥；得到粉末状的中药酵素。
作为进一步的方案，本发明所述的超声萃取步骤中，采用20kHz的低频超声萃取8-12分钟，所述中药粉末与水的料液比为1：(100-400)。优选的，料液比为1:300。
作为进一步的方案，本发明所述的酶解步骤中，采用的复合酶的加酶量为100-150μg/g，所述复合酶是质量比为1:1：(2-5)的果胶酶、蛋白酶、纤维素酶；酶解的时间为8-12小时，酶解的温度控制在45-52℃，酶解液的pH值为5.5-5.8。
一种治疗痛风病的中药酵素的制备方法，包括
超声萃取步骤：按照比例将所述中药原料经过干燥后再分别粉碎得到中药粉末，中药粉末中加水搅拌均匀，然后在每种中药粉末单独用超声萃取，得到中药萃取物；
酶解步骤：将上述得到的每种中药萃取物混合后加入复合酶进行酶解，得到酶解液；
菌种活化和培养步骤：分别用液体培养基溶解酵母菌粉和醋酸菌，振荡使菌体溶解成悬浮液状态，然后将菌液在YDP培养基上进行涂布，酵母菌接种于PDA培养基在30℃恒温培养箱内培养2-3天，经过2次继代培养，菌液待用；醋酸菌接种于基础培养基活化1-2天，经过2次继代培养，菌液待用；乳酸菌接种于MRS培养基在温度37℃下活化l-2天，经过2次继代培养，菌液待用；
接种、发酵步骤：将上述酶解液浓缩至可溶性固形物含量为30-37％，在浓缩后的酶解液接种1.2-2.0％的酵母菌、1.0-1.2％醋酸菌、1.2-1.5％乳酸菌后先在20-25℃温度下摇床发酵，然后在28-30℃温度下静置发酵，最后在35-40℃温度下继续发酵得到发酵液；
真空冷冻干燥：上述发酵液浓缩至重量为15-22％后转入到真空干燥器中进行真空冷冻干燥；得到粉末状的中药酵素。
本发明中，采用复合的乳酸菌进行发酵，由于酵母菌和醋酸菌共生发酵时，先于20℃条件下酵母菌成为优势菌，使得酵液中的酶活性和总酸含量上升，但酵母菌活菌数达到饱和程度时，酵母菌因营养物质消耗受到限制不能继续扩增；当温度转到25℃时，醋酸菌大量繁殖，醋酸菌利用糖源或酵母菌代谢产物继续发酵产生大量有机酸，间接的使发酵液的总酸含量较单菌发酵要高，这样利于酵液的发酵。作为进一步的方案，本发明所述的复合菌还包括浓度为1.2×108～2.5×108CFU/mL乳酸菌。乳酸菌是在37℃是开始大量繁殖，可以有效持续发酵液的发酵过程。
本发明采用复合菌进行发酵，随着发酵天数增加，酵母菌活菌数增加，代谢产物增加，为乳酸菌提供氨基酸、维生素和丙酮酸盐等营养因子，由于两种菌种协同发酵，相互促进了生长。因此，在本发明中酵母菌的发酵时间为6-8天，醋酸菌的发酵时间为8-10天最佳发酵时间。
以下是本发明具体的实施方式，在下述实施例中所采用的原料、试剂以及设备均可以通过商业方式获得。
实施例1
一种治疗痛风病的中药酵素，是由中药原料经复合菌发酵制成的酵素；
所述中药原料包括：东革阿里3重量份、薏苡仁15重量份、黄柏8重量份、牛膝5重量份、苍术10重量份、威灵仙5重量份、车前子15重量份、川芎12重量份、珠子草10重量份、桂枝8重量份、红花5重量份、鸡矢藤10重量份、丹参12重量份、土茯苓15重量份、金钱草10重量份、五加皮10重量份、乳香5重量份、千年健8重量份、没药5重量份、连翘5重量份；
所述复合菌包括浓度为1.0×108CFU/mL的酵母菌和浓度为2.0×108CFU/mL的醋酸菌；
治疗痛风病的中药酵素的制备方法，包括
超声萃取步骤：按照比例将所述中药原料经过干燥后再分别粉碎得到中药粉末，中药粉末中加水搅拌均匀，中药粉末与水的料液比为1：100-400，然后将每种中药粉末单独用20kHz的低频超声萃取8分钟，得到中药萃取物；
酶解步骤：将上述得到的每种中药萃取物混合后加入复合酶进行酶解，得到酶解液，复合酶的加酶量为100μg/g，所述复合酶是质量比为1：1：2的果胶酶、蛋白酶、纤维素酶；酶解的时间为8小时，酶解的温度控制在52℃，酶解液的pH值为5.5；
灭菌步骤：将上述酶解液在灭菌器中进行灭菌处理；
菌种活化和培养步骤：分别用液体培养基溶解酵母菌粉和醋酸菌，振荡使菌体溶解成悬浮液状态，然后将菌液在YDP培养基上进行涂布，酵母菌接种于PDA培养基在30℃恒温培养箱内培养2天，经过2次继代培养，菌液待用；醋酸菌接种于基础培养基活化1天，经过2次继代培养，菌液待用；
接种、发酵步骤：将上述酶解液浓缩至可溶性固形物含量为30％，在浓缩后的酶解液接种1.2％的酵母菌和1.0％醋酸菌后先在20℃温度下摇床发酵，然后在28℃温度下静置发酵，得到发酵液；
真空冷冻干燥：上述发酵液浓缩至重量为15％后转入到真空干燥器中进行真空冷冻干燥；得到粉末状的中药酵素。实施例2
一种治疗痛风病的中药酵素，是由中药原料经复合菌发酵制成的酵素；
所述中药原料包括：东革阿里10重量份、薏苡仁30重量份、黄柏15重量份、牛膝15重量份、苍术10重量份、威灵仙15重量份、车前子30重量份、川芎20重量份、珠子草20重量份、桂枝15重量份、红花15重量份、鸡矢藤25重量份、丹参25重量份、土茯苓30重量份、金钱草25重量份、五加皮20重量份、乳香15重量份、千年健15重量份、没药15重量份、连翘15重量份；
所述复合菌包括浓度为1.2×108CFU/mL的酵母菌和浓度为2.0×108CFU/mL的醋酸菌；
治疗痛风病的中药酵素的制备方法，包括
治疗痛风病的中药酵素的制备方法，包括
超声萃取步骤：按照比例将所述中药原料经过干燥后再分别粉碎得到中药粉末，中药粉末中加水搅拌均匀，中药粉末与水的料液比为1：200，然后将每种中药粉末单独用20kHz的低频超声萃取12分钟，得到中药萃取物；
酶解步骤：将上述得到的每种中药萃取物混合后加入复合酶进行酶解，得到酶解液，复合酶的加酶量为150μg/g，所述复合酶是质量比为1：1：5的果胶酶、蛋白酶、纤维素酶；酶解的时间为12小时，酶解的温度控制在45℃，酶解液的pH值为5.5；
灭菌步骤：将上述酶解液在灭菌器中进行灭菌处理；
菌种活化和培养步骤：分别用液体培养基溶解酵母菌粉和醋酸菌，振荡使菌体溶解成悬浮液状态，然后将菌液在YDP培养基上进行涂布，酵母菌接种于PDA培养基在30℃恒温培养箱内培养3天，经过2次继代培养，菌液待用；醋酸菌接种于基础培养基活化1天，经过2次继代培养，菌液待用；
接种、发酵步骤：将上述酶解液浓缩至可溶性固形物含量为37％，在浓缩后的酶解液接种2.0％的酵母菌和1.2％醋酸菌后先在25℃温度下摇床发酵，然后在30℃温度下静置发酵，得到发酵液；
真空冷冻干燥：上述发酵液浓缩至重量为22％后转入到真空干燥器中进行真空冷冻干燥；得到粉末状的中药酵素。
实施例3
一种治疗痛风病的中药酵素，是由中药原料经复合菌发酵制成的酵素；
所述的中药原料包括：东革阿里5重量份、薏苡仁20重量份、黄柏10重量份、牛膝8重量份、苍术12重量份、威灵仙8重量份、车前子18重量份、川芎15重量份、珠子草12重量份、桂枝10重量份、红花8重量份、鸡矢藤15重量份、丹参15重量份、土茯苓20重量份、金钱草15重量份、五加皮12重量份、乳香8重量份、千年健10重量份、没药8重量份、连翘8重量份、追地风10重量份、延胡索8重量份、肾茶10重量份。所述复合菌包括浓度为2.2×108CFU/mL的酵母菌、浓度为2.5×108CFU/mL的醋酸菌以及1.2×108CFU/mL乳酸菌；
治疗痛风病的中药酵素的制备方法，包括
超声萃取步骤：按照比例将所述中药原料经过干燥后再分别粉碎得到中药粉末，中药粉末中加水搅拌均匀，中药粉末与水的料液比为1：300，然后将每种中药粉末单独用20kHz的低频超声萃取10分钟，得到中药萃取物；
酶解步骤：将上述得到的每种中药萃取物混合后加入复合酶进行酶解，得到酶解液，复合酶的加酶量为120μg/g，所述复合酶是质量比为1:1：3的果胶酶、蛋白酶、纤维素酶；酶解的时间为10小时，酶解的温度控制在47℃，酶解液的pH值为5.5；
灭菌步骤：将上述酶解液在灭菌器中进行灭菌处理；
菌种活化和培养步骤：分别用液体培养基溶解酵母菌粉和醋酸菌，振荡使菌体溶解成悬浮液状态，然后将菌液在YDP培养基上进行涂布，酵母菌接种于PDA培养基在30℃恒温培养箱内培养2天，经过2次继代培养，菌液待用；醋酸菌接种于基础培养基活化2天，经过2次继代培养，菌液待用；
接种、发酵步骤：将上述酶解液浓缩至可溶性固形物含量为35％，在浓缩后的酶解液接种1.2-2.0％的酵母菌和1.0-1.2％醋酸菌后先在22℃温度下摇床发酵，然后在28℃温度下静置发酵，得到发酵液；
真空冷冻干燥：上述发酵液浓缩至重量为20％后转入到真空干燥器中进行真空冷冻干燥；得到粉末状的中药酵素。
实施例4
一种治疗痛风病的中药酵素，是由中药原料经复合菌发酵制成的酵素；所述的中药原料包括：东革阿里8重量份、薏苡仁25重量份、黄柏15重量份、牛膝12重量份、苍术18重量份、威灵仙12重量份、车前子25重量份、川芎18重量份、珠子草18重量份、桂枝12重量份、红花12重量份、鸡矢藤20重量份、丹参20重量份、土茯苓25重量份、金钱草20重量份、五加皮18重量份、乳香12重量份、千年健15重量份、没药12重量份、连翘12重量份、追地风15重量份、延胡索12重量份、肾茶15重量份；
所述复合菌包括浓度为2.5×108CFU/mL的酵母菌、浓度为2.8×108CFU/mL的醋酸菌以及2.0×108CFU/mL乳酸菌；
治疗痛风病的中药酵素的制备方法，包括
超声萃取步骤：按照比例将所述中药原料经过干燥后再分别粉碎得到中药粉末，中药粉末中加水搅拌均匀，中药粉末与水的料液比为1：350，然后将每种中药粉末单独用20kHz的低频超声萃取10分钟，得到中药萃取物；
酶解步骤：将上述得到的每种中药萃取物混合后加入复合酶进行酶解，得到酶解液，复合酶的加酶量为100-150μg/g，所述复合酶是质量比为1:1：4的果胶酶、蛋白酶、纤维素酶；酶解的时间为9小时，酶解的温度控制在50℃，酶解液的pH值为5.8；
灭菌步骤：将上述酶解液在灭菌器中进行灭菌处理；
菌种活化和培养步骤：分别用液体培养基溶解酵母菌粉和醋酸菌，振荡使菌体溶解成悬浮液状态，然后将菌液在YDP培养基上进行涂布，酵母菌接种于PDA培养基在30℃恒温培养箱内培养2天，经过2次继代培养，菌液待用；醋酸菌接种于基础培养基活化1天，经过2次继代培养，菌液待用；
接种、发酵步骤：将上述酶解液浓缩至可溶性固形物含量为32％，在浓缩后的酶解液接种1.5％的酵母菌和1.5％醋酸菌后先在25℃温度下摇床发酵，然后在30℃温度下静置发酵，得到发酵液；
真空冷冻干燥：上述发酵液浓缩至重量为20％后转入到真空干燥器中进行真空冷冻干燥；得到粉末状的中药酵素。
实施例5
一种治疗痛风病的中药酵素，是由中药原料经复合菌发酵制成的酵素；
所述的中药原料包括：红东革阿里5重量份、黑东革阿里5份、薏苡仁22重量份、黄柏12重量份、牛膝10重量份、苍术15重量份、威灵仙10重量份、车前子20重量份、川芎15重量份、珠子草15重量份、桂枝10重量份、红花10重量份、鸡矢藤18重量份、丹参18重量份、土茯苓22重量份、金钱草18重量份、五加皮15重量份、乳香10重量份、千年健12重量份、没药10重量份、连翘10重量份、追地风12重量份、延胡索10重量份、肾茶12重量份；
所述复合菌包括浓度为2.0×108CFU/mL的酵母菌和浓度为3.2×108CFU/mL的醋酸菌；
治疗痛风病的中药酵素的制备方法，包括
超声萃取步骤：按照比例将上述中药原料经过干燥后再分别粉碎得到中药粉末，中药粉末中加水搅拌均匀，药粉末与水的料液比为1：400，然后在每种中药粉末单独采用20kHz的低频超声萃取10分钟，得到中药萃取物；
酶解步骤：将上述得到的每种中药萃取物混合后加入复合酶进行酶解，得到酶解液；
灭菌步骤：将上述酶解液在灭菌器中进行灭菌处理；
菌种活化和培养步骤：分别用液体培养基溶解酵母菌粉和醋酸菌，振荡使菌体溶解成悬浮液状态，然后将菌液在YDP培养基上进行涂布，酵母菌接种于PDA培养基在30℃恒温培养箱内培养2天，经过2次继代培养，菌液待用；醋酸菌接种于基础培养基活化2天，经过2次继代培养，菌液待用；
接种、发酵步骤：将上述酶解液浓缩至可溶性固形物含量为35％，在浓缩后的酶解液接种1.5％的酵母菌和1.0％醋酸菌后先在22℃温度下摇床发酵8天，然后在30℃温度下静置发酵8天，得到发酵液；
真空冷冻干燥：上述发酵液浓缩至重量为20％后转入到真空干燥器中进行真空冷冻干燥；得到粉末状的中药酵素。
效果评价
1.急毒性试验
1)小鼠口服急毒性试验：选取60只小鼠，雌雄各半，在人工照明12h、通风良好的条件下饲养观察3d后，随机分成5个试验组(对应实施例1-5)和1个对照组，每组10只，给药前24h和给药后4h内禁食，但不禁水。口服按0.2mL/20g剂量灌胃给药；连续观察10d，记录小鼠中毒症状，小鼠死亡或试验结束后进行剖解，观察各组织器官的变化，取心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏及肠组织做病理切片，并计算半数致死量(LD50)。
结果显示：用灌胃针经口腔灌入复方苦木注射液后，个别小鼠蜷缩在角落，活动减少，但第3d观察，发现有38只小鼠活动、饮水和采食恢复正常；连续观察10天后，50只小鼠均健康存活，且全部小鼠的精神、食欲、肤色、分泌物、呼吸、食欲、肌肉运动等方面均未观察到异常变化。试验结束后剖检，发现各试验组小鼠脏器变化与对照组无明显眼观差异。按照毒理学安全性评价标准得知，LD50＞10000mg/kg，属无毒性物质。
2.药效试验
试验材料：SPF级雄性SD大鼠60只，体质量(200±20)，购自广州中医药大学实验动物中心，实验动物饲养于暨南大学实验动物中心SPF级实验室，室温(20±2)，相对湿度40-70％，给予灭菌清洁饮水、饲料；笼具、垫料均经高温高压灭菌处理；尿酸、肌酐、尿素氮、黄嘌呤氧化酶、腺苷脱氨酶及考马斯亮蓝试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；氧嗪酸钾购自山东中科泰斗化学有限公司；羧甲基纤维素钠购自上海赛璐珞厂；别嘌醇片购自广东彼迪药业有限公司；戊巴比妥钠，购自德国merck公司。
试验方法：SPF级雄性SD大鼠除正常对照组10只外，造模组大鼠(50只)按10mL/kg灌胃给予氧嗪酸钾2g/(kg.d)构建高尿酸血症模型，正常对照组大鼠灌胃等体积溶媒，连续10后，腹腔注射3％戊巴比妥钠麻醉大鼠，眼眶后静脉丛采血(0.5mL)，以4℃、3000r/min离心15min，取上层血清用钨酸法测定血清尿酸含量，将尿酸含量高于110μmol/L的大鼠确定为造模成功。
将造模成功的大鼠按血清尿酸含量均衡原则分为模型组、别嘌醇(25mg/kg)阳性对照组及给实施例1-5中药酵素的给药组1-5，分别对应实施例1-5的中药酵素，每组10只，除对照组外，给眼组各组动物每天上午灌胃氧嗪酸钾(2g/kg)维持模型，下午按10mL/kg灌胃给予受试药物，对照组与给药组大鼠给予等体积蒸馏水，连续处理7、14天后3％巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉，眼眶后静脉丛取血(0.5mL)，4℃、3000r/min离心15min，取上层血清采用钨酸法并严格按试剂盒说明书操作测定血清尿酸含量；药物处理21d后，3％巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，后腹腔动脉取血％0G，测定血清尿酸水平(取适量0.2-1g肝脏组织，加入9倍体积生理盐水，用眼科剪快速剪碎组织块(冰上操作)，组织匀浆机制作10％肝匀浆，考马斯亮蓝蛋白定量，检测肝匀浆和血清中黄嘌呤氧化酶和腺苷脱氨酶的含量；大鼠肾脏经4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱水，苏木素染色，镜检拍片，显微镜下观察大鼠肾脏组织病理学变化。实验结果均以表示，采用SPP16.0统计软件进行数据处理，以p＜0.05为差异有统计学意义。实验结果参见下表1。
表1：实施例1-5的中药酵素对大鼠血清尿酸含量的影响
表1结果显示：与对照组比较，给药组组大鼠在给药后各时间点血清尿酸含量均显著降低(p＜0.01)。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种治疗痛风病的中药酵素，其特征在于，是由中药原料经复合菌发酵制成的酵素；
所述中药原料包括：东革阿里3-10重量份、薏苡仁15～30重量份、黄柏8-15重量份、牛膝5-15重量份、苍术10-20重量份、威灵仙5-15重量份、车前子15-30重量份、川芎12-20重量份、珠子草10-20重量份、桂枝8-15重量份、红花5-15重量份、鸡矢藤10-25重量份、丹参12-25重量份、土茯苓15-30重量份、金钱草10-25重量份、五加皮10-20重量份、乳香5-15重量份、千年健8-15重量份、没药5-15重量份、连翘5-15重量份；
所述复合菌包括浓度为1.0×108～2.5×108CFU/mL的酵母菌和浓度为2.0×108～3.2×108CFU/mL的醋酸菌。
2.根据权利要求1所述的治疗痛风病的中药酵素，其特征在于，所述中药原料还包括追地风8～18重量份、延胡索5-15重量份、肾茶8-15重量份。
3.根据权利要求2所述的治疗痛风病的中药酵素，其特征在于，所述东革阿里为红东革阿里、黄东革阿里、黑东革阿里中的一种或两种以上混合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的治疗痛风病的中药酵素，其特征在于，所述中药原料包括：东革阿里5-8重量份、薏苡仁20～25重量份、黄柏10-15重量份、牛膝8-12重量份、苍术12-18重量份、威灵仙8-12重量份、车前子18-25重量份、川芎15-18重量份、珠子草12-18重量份、桂枝10-12重量份、红花8-12重量份、鸡矢藤15-20重量份、丹参15-20重量份、土茯苓20-25重量份、金钱草15-20重量份、五加皮12-18重量份、乳香8-12重量份、千年健10-15重量份、没药8-12重量份、连翘8-12重量份、追地风10～15重量份、延胡索8-12重量份、肾茶10-15重量份。
5.根据权利要求2所述的治疗痛风病的中药酵素，其特征在于，所述中药原料包括：红东革阿里5重量份、黑东革阿里5份、薏苡仁22重量份、黄柏12重量份、牛膝10重量份、苍术15重量份、威灵仙10重量份、车前子20重量份、川芎15重量份、珠子草15重量份、桂枝10重量份、红花10重量份、鸡矢藤18重量份、丹参18重量份、土茯苓22重量份、金钱草18重量份、五加皮15重量份、乳香10重量份、千年健12重量份、没药10重量份、连翘10重量份、追地风12重量份、延胡索10重量份、肾茶12重量份。
6.根据权利要求1-4任一项所述的治疗痛风病的中药酵素，其特征在于，所述复合菌还包括浓度为1.2×108～2.0×108CFU/mL乳酸菌。
7.一种如权利要求1所述的治疗痛风病的中药酵素的制备方法，其特征在于，包括
超声萃取步骤：按照比例将所述中药原料经过干燥后再分别粉碎得到中药粉末，中药粉末中加水搅拌均匀，然后将每种中药粉末单独用超声萃取，得到中药萃取物；
酶解步骤：将上述得到的每种中药萃取物混合后加入复合酶进行酶解，得到酶解液；
灭菌步骤：将上述酶解液在灭菌器中进行灭菌处理；
菌种活化和培养步骤：分别用液体培养基溶解酵母菌粉和醋酸菌，振荡使菌体溶解成悬浮液状态，然后将菌液在YDP培养基上进行涂布，酵母菌接种于PDA培养基在30℃恒温培养箱内培养2-3天，经过2次继代培养，菌液待用；醋酸菌接种于基础培养基活化1-2天，经过2次继代培养，菌液待用；
接种、发酵步骤：将上述酶解液浓缩至可溶性固形物含量为30-37％，在浓缩后的酶解液接种1.2-2.0％的酵母菌和1.0-1.2％醋酸菌后先在20-25℃温度下摇床发酵，然后在28-30℃温度下静置发酵，得到发酵液；
真空冷冻干燥：上述发酵液浓缩至重量为15-22％后转入到真空干燥器中进行真空冷冻干燥；得到粉末状的中药酵素。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述超声萃取步骤中，采用20kHz的低频超声萃取8-12分钟，所述中药粉末与水的料液比为1：(100-400)。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述酶解步骤中，采用的复合酶的加酶量为100-150μg/g，所述复合酶是质量比为1:1：(2-5)的果胶酶、蛋白酶、纤维素酶；酶解的时间为8-12小时，酶解的温度控制在45-52℃，酶解液的pH值为5.5-5.8。
10.一种如权利要求1所述的治疗痛风病的中药酵素的制备方法，其特征在于，包括
超声萃取步骤：按照比例将所述中药原料经过干燥后再分别粉碎得到中药粉末，中药粉末中加水搅拌均匀，然后在每种中药粉末单独用超声萃取，得到中药萃取物；
酶解步骤：将上述得到的每种中药萃取物混合后加入复合酶进行酶解，得到酶解液；
菌种活化和培养步骤：分别用液体培养基溶解酵母菌粉和醋酸菌，振荡使菌体溶解成悬浮液状态，然后将菌液在YDP培养基上进行涂布，酵母菌接种于PDA培养基在30℃恒温培养箱内培养2-3天，经过2次继代培养，菌液待用；醋酸菌接种于基础培养基活化1-2天，经过2次继代培养，菌液待用；乳酸菌接种于MRS培养基在温度37℃下活化l-2天，经过2次继代培养，菌液待用；
接种、发酵步骤：将上述酶解液浓缩至可溶性固形物含量为30-37％，在浓缩后的酶解液接种1.2-2.0％的酵母菌、1.0-1.2％醋酸菌、1.2-1.5％乳酸菌后先在20-25℃温度下摇床发酵，然后在28-30℃温度下静置发酵，最后在35-40℃温度下继续发酵得到发酵液；
真空冷冻干燥：上述发酵液浓缩至重量为15-22％后转入到真空干燥器中进行真空冷冻干燥；得到粉末状的中药酵素。
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