CN114558065B - 一种降尿酸的肾茶发酵组合物及其制备方法 - Google Patents
一种降尿酸的肾茶发酵组合物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于药物技术领域，具体涉及一种降尿酸的肾茶发酵组合物及其制备方法，本发明的组合物采用植物乳杆菌肾茶发酵产物与陈皮提取物进行混合制备得到，其中本发明的肾茶发酵产物中总酚酸含量高达10.26％、总黄酮含量高达6.5％，均比未经植物乳杆菌发酵的肾茶发酵产物含量高，尤其发酵产物中的迷迭香酸甲酯的含量显著增加；本发明的肾茶组合物可用于制备治疗高尿酸血症药物，与陈皮水提物进行复配有效的降低血尿酸值，相比别嘌醇药物，本发明的肾茶发酵产物不会引起血肌酐值和血尿素氮值的增加，可有效保护肾脏组织。
Description
技术领域
本发明属于药物制备技术领域，具体涉及一种降尿酸的肾茶发酵组合物及其制备方法。
技术背景
肾茶为唇形科肾茶属(Clerodendranthus spicatus(Thunb.)C.Y.Wu)多年生草本植物，又名为猫须草、猫须公，傣药称“芽糯妙”，是傣族医药中清利下盘，通畅水道的主要解药之一。我国仅有的一种肾茶品种，主产区为云南、海南、广东、广西、台湾、福建，其余的几种肾茶多数分布于东南亚国家。肾茶，性凉，味甘、淡、微苦，具有清湿热、利尿排石的功效，可用于治疗急慢性肾炎、膀胱炎、尿路结石等泌尿系统疾病，还可防治痛风、风湿。现有技术公开了肾茶成分中含有的化合物种类，包括黄酮类，酚酸类和萜类等，其中黄酮类化合物包括鼠尾草素、异橙黄酮、异槲皮素等，酚酸类化合物包含迷迭香酸、咖啡酸等，上述所公开的肾茶成分主要通过传统天然产物提取方法制备得到，中国专利CN102240347A公开了一种治疗高尿酸血症的药物组合物及其制法，该药物组合物由藤茶10～50g、肾茶10～50g、盾翅藤10～50g、紫金藤5～50g组成，通过将原料粉碎或提取制备得到的，该专利仍采取常规的提取方法得到植物提取物，且并未记载该药物组合物的疗效；为了更好的探究肾茶中成分的生物学活性，以及更好的增加肾茶对人体健康的有益效果，有必要采用其他途径和手段进一步解析和获取肾茶中含有的活性成分。
中药发酵技术是借助微生物和酶的催化分解作用，改变药物原有的特性，可增强或产生新的药效一种有效的中药炮制方法之一。基于微生物的转化作用，通过微生物发酵改性中药材及其成分的转化研究日益受到重视。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)属于乳酸菌的一种，是一种革兰氏阳性菌，其最适生长温度为30～35℃，在自然界中分布很广泛，其大量存在于人体、动植物发酵产品中。植物乳杆菌具有调节免疫功能、调节胃肠道功能、防治腹泻等作用，其在代谢过程中能产生多种酶，使由纤维素、半纤维素等构成的细胞壁发生裂解，从而促进中药有效成分的释放，产生新的活性物质。因此，融合现代微生物发酵技术，利用植物乳杆菌发酵肾茶，探究肾茶发酵后化学成分的变化，优化植物乳杆菌发酵肾茶的生产工艺，填补了现有技术中微生物发酵肾茶工艺的空缺，为研发肾茶发酵产品提供重要的参考依据，并深入影响中医药研究及相关产业领域。
发明内容
针对上述现有的技术问题，本发明提供了一种降尿酸的肾茶发酵组合物及其制备方法，本发明以傣族药肾茶为研究对象，引入植物乳杆菌对肾茶进行液体发酵，并对发酵工艺进行优化，制备了肾茶发酵产物，经与陈皮提取物进行混合后制备得到的肾茶发酵组合物，产生优异的降尿酸作用；
本发明制备的肾茶发酵产物可用于制备治疗高尿酸症药物，但不仅限于该症状药物，还包括肾脏等其他症状；
进一步地，所述药物包含肾茶发酵产物和陈皮提取物混合物；
优选地，所述肾茶发酵产物和陈皮提取物以质量比为1.2～4:1:1混合，进一步可优选为2:1；
进一步地，所述肾茶发酵组合物还包括药学上可接受的载体或药用辅料。
进一步地，所述肾茶组合物为茶饮、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、栓剂或滴剂。
本发明中所涉及的肾茶Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C.Y.Wu均采自西双版纳药用植物园；
本发明中所涉及的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)购买自山东中科嘉亿生物工程有限公司，批号20201024，保藏号：CGMCC NO.18038；
本发明采用植物乳杆菌的对肾茶进行液态发酵，所述液态发酵过程中的氮源为蛋白胨；
所述发酵培养基：葡萄糖30g/ml，酵母浸粉7％，大豆蛋白胨7％，柠檬酸三铵0.4％，磷酸氢二钾0.8％，硫酸镁0.16％，吐温80 1％，硫酸锰0.04％，pH＝6.0～6.5；
所述肾茶发酵产物的制备步骤如下：
S1、肾茶水提物的制备
称取肾茶粉末在水中经室温浸泡，然后加热提取，将提取液进行浓缩，备用；
S2、植物乳杆菌的活化
取植物乳杆菌冻干粉与无菌水混合制备菌悬液，将菌悬液稀释后接种至琼脂平皿培养基培养后接种至斜面培养基，冷藏备用；
取出冷藏的斜面培养基，将该培养基中的植物乳杆菌接种至种子培养基中，置于37℃恒温培养箱中进行培养活化，得到细菌种子液，备用；
S3、植物乳杆菌菌悬液的制备
将细菌种子液倒入灭菌离心管中，离心去除上清液，向离心管中加入无菌水，充分混匀制备菌悬液，备用；
S4、肾茶的发酵
量取S1中的肾茶水提物置于发酵装置中，灭菌，冷却后，加入发酵培养基，将植物乳杆菌菌悬液接入发酵装置中，发酵得到发酵产物；
S5肾茶发酵组合物的制备
将陈皮切成丝状，加入溶剂浸泡，然后升温、保温，将提取液过滤，干燥，得到陈皮提取物干粉，按照质量比，将肾茶发酵产物与陈皮提取物混合，制备得到肾茶发酵组合物。
所述S1中的肾茶粉末为肾茶干燥后经粉碎能通过10目筛且不能通过50目筛的肾茶粉末，所述肾茶粉末和蒸馏水的质量体积比为1g:1～50ml；
所述S2中植物乳杆菌冻干粉与无菌水的质量体积比为1g:1～10ml；接种后的琼脂平皿培养基在37℃下培养24～48h；所述种子培养基组成为：葡萄糖2％，牛肉膏1％，酵母浸粉0.5％，柠檬酸三铵0.1％，磷酸氢二钾0.2％，无水乙酸钠0.5％，硫酸镁0.2％，吐温800.058％，硫酸锰0.025％，pH＝6.2；
所述S3通过平板菌落计数法得到菌悬液浓度为6.9×109CFU/mL；
所述S4中的发酵条件为30～40℃，培养时间24～96h；
所述S4中植物乳杆菌菌悬液接种量为2～5％；
所述S4中得到的发酵产物进行灭菌，过滤后，将液体和固体分别进行干燥处理，用甲醇溶解、离心、过滤，进一步通过高效液相色谱分析方法，采用分析柱C18-S，250mm×4.6mm，经甲酸水-甲醇洗脱后，对发酵产物的成分进行分析；
所述S5中的溶剂选自水、甲醇、乙醇中的一种或组合；
优选地，所述S5中的陈皮切成丝状后，以料液比1:23(g/ml)加入溶剂，浸泡45min后升温至95℃，提取时间为90min，加热提取2次，提取完毕后，合并两次提取液，过滤，干燥，得到陈皮提物干粉，备用提取物。
所述的植物乳杆菌在制备肾茶发酵产物中的应用。
本发明采用液体发酵，相比固体发酵，具有物质传递效率高，通过植物乳杆菌发酵，可进一步提高肾茶有效成分的生物转化效果甚至是有效成分的含量，且生产成本低、生产条件可量化、产物稳定性高等优势，对于本发明而言，更容易实现大规模工业化生产。
本发明选取植物乳杆菌接种量、发酵温度和发酵时间三个因素进行探究，考察所述因素对肾茶水提物成分的影响，确定植物乳杆菌发酵肾茶水提物的最佳工艺条件；
植物乳杆菌的接种量在发酵过程中对培养基的分解、代谢产生不同含量和种类的酶，进一步影响肾茶细胞壁的裂解过程，从而促进肾茶中的有效成分释放甚至产生新的活性物质的可能；
发酵温度影响代谢过程中酶的反应速率、菌株的生长速率、培养基中的氧容量、氧的传递速率，因而发酵温度对菌株的生长代谢过程产生重要影响，另外，采用植物乳杆菌的最适生长温度之外的温度条件，进一步影响肾茶中的有效成分的溶出和转化。
发酵时间影响发酵过程中酶含量、与培养基的接触时间，因而发酵时间的调控对菌株的生长代谢过程产生重要影响，进一步影响肾茶中的有效成分的溶出和转化。
本发明肾茶发酵产物与陈皮提取物在特定比例下混合，可产生显著的降尿酸作用，且不会引起肾脏的损伤，具有良好的稳定性。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明首次对肾茶采用植物乳杆菌液体发酵方法得到肾茶发酵产物，与陈皮水提取物混合用于制备治疗高尿酸血症药物，在特定的混合比例下产生协同药效，可显著降低血尿酸值，同时相比别嘌醇药物，本发明的肾茶发酵产物不会引起血肌酐值和血尿素氮值的增加，可有效保护肾脏组织。
(2)本发明采用植物乳杆菌液体发酵技术对肾茶进行液体发酵，进一步提高了肾茶有效成分的生物转化效果甚至是有效成分的含量，该发酵方法促进了肾茶水提物中黄酮成分的溶出或转化，得到发酵产物中的总黄酮含量升高，该发酵方法也促进了肾茶酚酸类成分的改变，尤其促进了肾茶水提物中迷迭香酸甲酯的溶出和转化，得到的发酵产物中迷迭香酸甲酯的含量增加。
(3)本发明优化了植物乳杆菌对肾茶水提物进行液态发酵条件，当超过植物乳杆菌的最适生长温度(30～35℃)，如37℃、40℃时得到的发酵产物成分以及成分含量都有较大的变化，实施例6、8、9发酵产物中的迷迭香酸含量增加，同时伴随有新的化合物出现；
(4)本发明对植物乳杆菌发酵肾茶后得到的发酵产物进行定量分析，以采用 C18-S，250mm×4.6mm的分离效果较好，定量结果更准确；
(5)本发明采用微生物发酵技术，建立了一种植物乳杆菌对肾茶水提物进行液体发酵的工艺路线，相比传统的水热提取法，本发明通过植物乳杆菌发酵肾茶，提高了产物中总酚酸和总黄酮的含量，其含量分别高达10.26％、6.5％，同时还产生了新的化合物，本发明的肾茶发酵产物及其制备方法对傣族药肾茶中的成分分析做出了进一步的挖掘和研究，对天然产物的成分研究和药物开发有一定的影响。
附图说明
图1为实施例1中16组肾茶发酵产物的HPLC图谱。
图2为迷迭香酸、迷迭香酸甲酯、咖啡酸、丹参素对照样品的HPLC图谱。
图3为肾茶水提物、实施例1中编号4的肾茶发酵产物、对比例、对照样品的HPLC图谱。
图4为实施例1中16组肾茶发酵产物、肾茶水提物的相似度分析结果。
图5为实施例1中16组肾茶发酵产物的聚类分析。
图6为30℃下实施例1中编号2、3、5、7的4组肾茶发酵产物的拉曼光谱。
图7为34℃下实施例1中编号1、4、10、11的4组肾茶发酵产物的拉曼光谱。
图8为37℃实施例1中编号6、14、15、16的4组肾茶发酵产物的拉曼光谱。
图9为40℃实施例1中编号8、9、12、13的4组肾茶发酵产物的拉曼光谱。
图10为对比例1～4的肾茶自然发酵(即不加植物乳杆菌，让其自然发酵)产物的拉曼光谱。
图11为各组小鼠血尿酸值，其中1是正常组，2是模型组，3是别嘌醇组，4是肾茶水提物组，5是肾茶发酵物组，6是肾茶水提物陈皮饮低剂量组，7是肾茶水提物陈皮饮中剂量组，8是肾茶水提物陈皮饮高剂量组，9是肾茶发酵物陈皮饮低剂量组，10是肾茶发酵物陈皮饮中剂量组，11是肾茶发酵物陈皮饮高剂量组。
图12为各组小鼠血肌酐值，其中1是正常组，2是模型组，3是别嘌醇组，4是肾茶水提物组，5是肾茶发酵物组，6是肾茶水提物陈皮饮低剂量组，7是肾茶水提物陈皮饮中剂量组，8是肾茶水提物陈皮饮高剂量组，9是肾茶发酵物陈皮饮低剂量组，10是肾茶发酵物陈皮饮中剂量组，11是肾茶发酵物陈皮饮高剂量组。
图13为各组小鼠血尿素氮值，其中1是正常组，2是模型组，3是别嘌醇组，4是肾茶水提物组，5是肾茶发酵物组，6是肾茶水提物陈皮饮低剂量组，7是肾茶水提物陈皮饮中剂量组，8是肾茶水提物陈皮饮高剂量组，9是肾茶发酵物陈皮饮低剂量组，10是肾茶发酵物陈皮饮中剂量组，11是肾茶发酵物陈皮饮高剂量组。
图14为肾茶发酵产物陈皮饮对高尿酸血症小鼠肾组织的病理变化影响，其中A:正常组B:模型组C:阳性对照药别嘌醇组D:肾茶水提物组E:肾茶发酵物组F:肾茶水提物陈皮饮低剂量组G:肾茶水提物陈皮饮中剂量组H:肾茶水提物陈皮饮高剂量组I:肾茶发酵物陈皮饮低剂量组J:肾茶发酵物陈皮饮中剂量组K:肾茶发酵物陈皮饮中剂量组。
图15为肾茶水提物与肾茶乳双歧杆菌发酵产物的HPLC对比图谱，A是肾茶水提物，B是肾茶乳双歧杆菌发酵24h，C是肾茶乳双歧杆菌发酵48h，D是肾茶乳双歧杆菌发酵72h，E是肾茶乳双歧杆菌发酵96h。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
以下实施例对本发明做进一步的描述，但该实施例并非用于限制本发明的保护范围。
实施例1肾茶发酵产物的制备
S1肾茶水提物制备
将肾茶在摆式高速万能粉碎机(DFY-1000)上进行粉碎，过10目筛后得到肾茶粉末，称取20g肾茶粉末浸泡于460mL蒸馏水中，浸泡45min后升温至95℃，保温90min，热提2次，合并两次提取液，浓缩至23mL，备用；
S2植物乳杆菌的活化
取2.0g植物乳杆菌冻干粉与8mL无菌水混合均匀制备菌悬液，将菌悬液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9梯度稀释至不同浓度，用接种环分别接种至琼脂平皿培养基，培养24～48h时后，通过平板菌落计数法得知菌悬液浓度为6.9×109CFU/mL，将所得菌悬液再接种至斜面培养基，冷藏备用；
取出冷藏的斜面培养基，将植物乳杆菌接种至MRS液体培养基(培养基配方为：葡萄糖2％，牛肉膏1％，酵母浸粉0.5％，柠檬酸三铵0.1％，磷酸氢二钾0.2％，无水乙酸钠0.5％，硫酸镁0.2％，吐温80 0.058％，硫酸锰0.025％，pH＝6.2)中，放置在37℃恒温培养箱中进行培养活化45h，得到细菌种子液，备用；
S3植物乳杆菌菌悬液制备
将细菌种子液倒入10mL灭菌离心管中，在转速3000r/min下离心5min，去除上清液，向离心管中加入无菌水，充分混匀制备菌悬液，通过平板菌落计数法得到浓度为6.9×109CFU/mL的菌悬液，备用；
S4肾茶发酵
将步骤S1中得到的23mL肾茶水提物置于250mL锥形瓶中，灭菌，冷却后，加入发酵培养基(培养基组成为：葡萄糖30g/ml，酵母浸粉7％，大豆蛋白胨7％，柠檬酸三铵0.4％，磷酸氢二钾0.8％，硫酸镁0.16％，吐温80 1％，硫酸锰0.04％，pH＝6.0-6.5)，将步骤S3得到的菌悬液接入锥形瓶中，在振荡培养箱中发酵得到发酵产物，将进行灭菌、过滤，分别将液体和固体进行干燥，并混合即可。
对上述S4步骤中的肾茶发酵条件优化如下：
对植物乳杆菌接种量(A)、发酵温度(B)和发酵时间(C)三个因素进行正交试验，因素水平见表1，正交设计表件表2；
表1：因素水平表
表2：正交设计表
对比例1
肾茶发酵产物的制备与实施例1的区别在于，步骤S4中不接种植物乳杆菌菌悬液，并置于30℃振荡培养箱中发酵；
其余步骤均与实施例1相同。
对比例2
肾茶发酵产物的制备与实施例1的区别在于，步骤S4中的不接种植物乳杆菌菌悬液，并置于34℃振荡培养箱中发酵；
其余步骤均与实施例1相同。
对比例3
肾茶发酵产物的制备与实施例1的区别在于，步骤S4中不接种植物乳杆菌菌悬液，并置于37℃振荡培养箱中发酵；
其余步骤均与实施例1相同。
对比例4
肾茶发酵产物的制备与实施例1的区别在于，步骤S4中不接种植物乳杆菌菌悬液，并置于40℃振荡培养箱中发酵；
其余步骤均与实施例1相同。
试验例一、肾茶发酵产物的HPLC分析
(1)对照样品溶液的制备
分别精密称取2.00mg迷迭香酸、咖啡酸、迷迭香酸甲酯、丹参素对照品，分别置10ml容量瓶，30％甲醇定容至刻度，摇匀，制成0.2000mg/ml的四种对照品溶液，备用。
(2)供试样品溶液的制备
分别精密称取50.00mg干燥的肾茶水提物、16组肾茶发酵产物以及对比例1～4制备的肾茶发酵产物，分别置于10mL容量瓶中，用30％甲醇溶解定容至刻度，充分摇匀，在3000r/min离心5min，用0.22μm滤膜过滤，作为供试样品。
(3)采用高效液相分析方法对肾茶发酵产物进行分析，具体分析方法如下：
样品：供试样品、对照样品；
色谱柱：C18-S，250mm×4.6mm；
流动相：含有0.1％甲酸水-甲醇；
洗脱程序：采用梯度洗脱，洗脱程序见表3；
流速：1ml/min；
检测波长：254nm；
柱温：35℃；
进样量：20μl；
表3：HPLC洗脱程序
按上述的分析方法，得到的结果见附图1～3；
由色谱图1～3所示，与图3中的4个对照样品的保留时间对比，确认实施例4制备的发酵产物中化合物1为迷迭香酸，化合物3为迷迭香酸甲酯；相比未发酵的肾茶水提物，肾茶发酵产物中的化合物1含量降低，而出现了新的化合物2、3、4，因此，表明，通过植物乳杆菌对肾茶进行发酵后，成分有明显的变化。
试验例二、相似度分析
对实施例1中的肾茶水提物和肾茶发酵产物进行产物相似性分析，采用中药色谱指纹图谱相似度评价16组肾茶发酵产物和水提物的色谱图，并进行比较，导入目标谱图文件，设定水提物为参照图谱进行匹配，计算相似度，结果见附图4；
由附图4结果显示，本发明的16组肾茶发酵产物与肾茶水提物之间相似度在0.091～1.000之间，相似度远低于标准的正常值，说明肾茶经植物乳杆菌发酵后化学成分变化较大。
试验例三、聚类分析
对实施例1中的16组肾茶发酵产物进行聚类分析，对得到的HPLC图谱采用聚类分析，具体分析方法如下：
将16组肾茶发酵产物与丹参素、咖啡酸、迷迭香酸和迷迭香酸甲酯所对应的峰面积进行计算，通过计算各样品之间的平方Euclidean距离对样品进行聚类，结果见附图5；
从聚类分析结果看出，7、9、13、8、1、4、2、3、14号是一大类，7、9、13、8、1、4、2、3号为中类，14号单独为另一中类，7、9、13、8号是其中的小类之一，1、4、2、3号是另一小类。
11、16、10、12、6、15、5号又是一大类，11、16号为其中的一个中类，10、12、6、15、5号为另一中类，5号单独为另一中类，10、12、6、15号是小类；
从分类来看，发酵时间、菌株接种量和发酵温度对肾茶中成分的含量均有影响，其中发酵时间对肾茶成分含量的影响最大，其次是温度。
试验例四、肾茶发酵产物的成分及含量分析
对实施例1中的16组肾茶发酵产物以及对比例1～4的产物进行HPLC测定，测定方法同试验例一，采用紫外光谱法对样品中的总酚酸和总黄酮含量进行测定：
样品分别在波长为500nm和765nm时测定吸光度值，计算发酵产物总黄酮和总酚酸的含量；
以迷迭香酸为对照品，在765nm紫外分光光度计下测定其吸光值，绘制迷迭香酸浓度标准曲线y＝106.66x+0.0476(R2＝0.9995)，y为吸光值，x为浓度；
以芦丁为对照品，在波长为500nm的紫外分光光度计下测量其吸光值，绘制芦丁浓度标准曲线y＝20.4x+0.0282(R2＝0.9995)，y为吸光值，x为浓度；
通过上述迷迭香酸和芦丁的标准曲线，可得到肾茶发酵产物中总黄酮和总酚酸的含量。
另一方面，与迷迭香酸、迷迭香酸甲酯、咖啡酸、丹参素四个对照样品的HPLC进行对比，通过峰面积计算出16组肾茶发酵产物和对比例1～4样品中的迷迭香酸、迷迭香酸甲酯、咖啡酸、丹参素含量，得到的结果见表4；
表4：肾茶发酵产物中4种对照品的含量
由表4结果可看出，在相同的发酵温度下，对比实施例1中的16组肾茶发酵产物与对比例1～4的产物成分和含量，实施例1中的部分肾茶发酵产物的总酚酸含量下降，16组发酵产物的总黄酮含量均升高，其中当接种量为4％，发酵温度为34℃，发酵时间为24h时得到的发酵产物(编号4)中总酚酸含量最高为10.26％，总黄酮含量为5.59％，当接种量为5％，发酵温度为37℃，发酵时间为24h时得到的发酵产物(编号15)中总黄酮含量最高为6.50％，总酚酸含量为7.18％。
另一方面，在相同的发酵温度下，对比16组肾茶发酵产物与对比例1～4的产物成分，结果由表4数据可知：
(1)编号1、2、3、4、6、13发酵产物中的丹参素含量与对比例之间的变化不大，实施例15发酵产物中的丹参素含量增加，其余发酵组得到的丹参素含量下降；
(2)编号1～4发酵产物中的咖啡酸含量增加，编号11、13发酵产物中的咖啡酸含量变化不大，其余发酵组得到的咖啡酸含量下降；
(3)编号1～4发酵产物中的迷迭香酸含量变化不大，编号6、8、9发酵产物中的迷迭香酸含量增加，其余发酵组得到的迷迭香酸含量下降；
(4)发酵产物中有16个发酵条件下得到的迷迭香酸甲酯的含量均显著增加。
试验例五、拉曼光谱分析
对实施例1中16组肾茶发酵产物以及对比例1～4在30℃、34℃、37℃、40℃发酵温度下的肾茶发酵产物进行拉曼光谱测定和分析，在波长785nm时测定拉曼光谱，得到的结果见附图6～10；
根据拉曼光谱图6～10显示，对照酚酸类和黄酮类拉曼的特征频率表，确定16组肾茶发酵产物的拉曼光谱归属：
1100cm-1峰为C-O-C醚键的对称拉伸振动峰，1165cm-1峰为C-O-C醚键的不对称拉伸振动峰，1675cm-1有C＝C振动峰出现，波数为803cm-1时出现的拉曼峰是C＝C的甲基对称变形振动峰，1662cm-1峰为C＝O伸缩振动峰，上述特征峰均出现在肾茶发酵产物的图谱上，证明肾茶发酵产物中含有黄酮类成分；
901cm-1峰为COOH羧基平面外变形峰，541cm-1峰为-COO-羧酸根的摇摆振动峰，615cm-1峰是C-CHO的平面内变形振动峰，721cm-1峰为碳氧拉伸和氧氢平面外变形振动峰，1675cm-1C＝C伸缩吸收带，上述特征峰在肾茶发酵产物的图谱中均有出现，证明肾茶发酵液中含有酚酸类成分；
据结果得知不同温度的发酵产物都有改变，肾茶经发酵后其成分有变化，发酵肾茶组与未发酵对照组有较大的区别。
试验例六、药理实验
采用酵母联合尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾建立小鼠高尿酸血症动物模型，以肾茶发酵产物和陈皮配伍，制成肾茶发酵产物陈皮饮干预小鼠高尿酸血症，通过检测各组小鼠血清尿酸、尿素氮，观察肾茶发酵产物陈皮饮对高尿酸血症小鼠生化指标的影响；通过HE染色观察肾茶对高尿酸血症小鼠肾脏病理组织的影响，综合评价肾茶发酵产物对高尿酸血症小鼠模型的影响实验方法：
1.实验方法：
1.1实验用药
(1)肾茶水提物：将肾茶粉碎，按料液比1:23(g/ml)加入蒸馏水，浸泡45min后升温至95℃，提取时间为90min，加热提取2次，提取完毕后，合并两次肾茶提取液，过滤，干燥，得到肾茶水提物干粉，备用。
(2)肾茶水提物-陈皮组合物：按照质量比肾茶水提物：陈皮提取物＝2:1的比例进行配伍，肾茶提取物通过将肾茶切碎，料液比1:23(g/ml)加入蒸馏水，浸泡45min后升温至95℃，提取时间为90min，加热提取2次，提取完毕后，合并两次提取液，过滤，干燥，得到肾茶水提物干粉，备用；陈皮提取物与肾茶水提物的制备类似，将陈皮切成丝状，其余步骤与肾茶水提物制备步骤相同。
(3)肾茶发酵产物：采用实施例1中编号4得到的肾茶发酵产物。
(4)肾茶发酵-陈皮组合物：将实施例1中编号4得到的肾茶发酵产物与陈皮提取物(提取方法同(2))以质量比2:1混合。
1.2实验动物分组及高尿酸血症小鼠模型的构建
动物分组：雄性昆明种小鼠110只(18g-22g/只)于SPF级动物房适应性饲养7天后，按照体重随机分为11组，分别为正常对照组，模型组，阳性对照药别嘌醇组，肾茶水提物组，肾茶发酵物组，肾茶水提物-陈皮组合物低、中、高剂剂量组，肾茶发酵-陈皮组合物低、中、高剂量组。采用酵母与尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾联合造模的方法：用酵母30g/kg对小鼠连续灌胃14天，第15天腹腔注射氧嗪酸钾200mg/kg一次，造成高尿酸血症小鼠模型。
1.3治疗给药
采用边造模边给药的方法，即每日上午予小鼠灌胃给药，下午以酵母30g/kg的剂量对小鼠连续灌胃14天，第15天腹腔注射氧嗪酸钾200mg/kg一次，构建小鼠高尿酸血症模型。其中正常组小鼠上下午灌胃等体积的蒸馏水，不给药也不造模；模型组小鼠上午灌胃等体积的蒸馏水，下午灌胃酵母混悬液建立高尿酸血症模型，造模14天；阳性对照药组小鼠给予别嘌醇0.04g/kg，肾茶水提物组小鼠给予9.33g/kg，肾茶发酵物组分别给予9.33g/kg，肾茶水提物-陈皮组合物低、中、高剂量组小鼠分别给与3.5g/kg，7.0g/kg，14.0g/kg，肾茶发酵-陈皮组合物低、中、高剂量组分别给予3.5g/kg，7.0g/kg，14.0g/kg。
1.4数据统计处理
采用SPSS22.0统计软件进行数据处理，本次试验所涉及的数据为计量资料，数据用(均数±标准差)表示，多组间资料比较采用单因素ANOVE方差分析进行检验，组间比较P<0.05，P<0.01视为差异有统计学意义。
2.检测指标
各组小鼠于实验结束前，禁食不禁水24小时。以10％乌拉坦0.2ml/10g腹腔注射麻醉后，从腹主动脉取血，4000rpm离心10min后吸取上清液，选用尿酸(UA)测试盒，尿素氮(BUN)测试盒(脲酶法)，肌酐(Cr)测定试剂盒(肌氨酸氧化酶法)(微板法)均购于南京建成生物工程研究所。检测血清中尿酸，尿素氮，肌酐含量检测，根据试剂盒说明书来操作。
小鼠肾脏组织苏木精－伊组(HE)染色摘取右肾组织以10％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，行5μm连续切片，HE染色，在光镜下观察肾小管、肾小球及肾脏病理改变。
3.结果
3.1肾茶发酵-陈皮组合物(肾茶发酵产物与陈皮提取物以质量比2:1混合)对小鼠高尿酸血症血尿酸，肌酐，尿素氮水平的影响结果见表5和图11～14；
表5：
注：与正常组相比#P<0.05,##P<0.01；与模型组相比，*P<0.05,**P<0.01
由表5数据和图11～13可知，别嘌醇可显著降低血尿酸值，但同时也增加了血肌酐值和血尿素氮值，相比别嘌醇，肾茶水提物、肾茶发酵物组、肾茶水提物-陈皮组合物以及肾茶发酵物-陈皮组合物均可降低血尿酸值，同时也不会引起血肌酐值和血尿素氮值的升高。另一方面，相比肾茶水提物，肾茶发酵产物的降血尿酸作用更显著，且与陈皮水提物配伍后的药效更好，表明本发明采用植物乳杆菌对肾茶进行液体发酵后得到的成分对保护肾脏组织的药效明显增加。
肾茶水提物-陈皮组合物对高尿酸血症小鼠肾组织的病理变化影响(HE×200)由图14可知，正常组小鼠可见皮质中肾小球及周围肾小管，未见明显病理改变；模型组可见皮质中肾小球及周围肾小管，肾小管中有些坏死的上皮细胞；别嘌醇组可见皮质中肾小球及周围肾小管，肾小管上皮细胞明显发生坏死，管腔扩张明显；肾茶水提物-陈皮组合物低、中剂量组小鼠可见皮质中肾小球及周围肾小管，未见明显病理改变；肾茶水提物-陈皮组合物高剂量组可见皮质中肾小球及周围肾小管，肾小管中有少量蛋白管型，未见明显病理改变；综上所述，本发明的肾茶发酵物-陈皮组合物能保护高尿酸血症小鼠的肾脏组织。
3.2肾茶发酵产物与陈皮水提物的质量混合比对小鼠高尿酸血症血尿酸的影响
肾茶水提物-陈皮组合物的组成含量对小鼠高尿酸血症血尿酸的影响对结果见表6，实验小鼠的给药组剂量采用高剂量14.0g/kg方式给药；
表6：
注：与正常组相比#P<0.05，##P<0.01；与模型组相比，*P<0.05,**P<0.01
由表6结果可知，本发明的肾茶发酵物与陈皮水提物的混合质量比为2:1时，对于血尿酸症的治疗效果最佳。
3.3陈皮提取方式对肾茶水提物-陈皮组合物影响小鼠高尿酸血症血尿酸的效果
与1.1实验用药中的(2)类似，陈皮提取物采用醇提法，将陈皮切成丝状，用70％的乙醇加热回流45min，过滤，干燥，得到陈皮提取物干粉；实验小鼠的给药品剂量采用高剂量组方式给药；
将实施例1中编号4得到的肾茶发酵产物与上述醇提法制备的陈皮提取物以质量比2:1混合，对小鼠高尿酸血症血尿酸的影响结果为：血尿酸值为101.60±8.96**mmol/L，表明相比陈皮醇提物，本发明制备的肾茶发酵物与陈皮水提物的复配对于制备治疗高尿酸血症效果更好。
对比例5、乳双歧杆菌发酵肾茶制备的肾茶发酵组合物降尿酸效果
(1)乳双歧杆菌发酵肾茶的制备步骤如下
S1、肾茶水提液的制备
将肾茶在摆式高速万能粉碎机(DFY-1000)上进行粉碎，过10目筛后得到肾茶粉末，称取20g肾茶粉末浸泡于460mL蒸馏水中，浸泡45min后升温至95℃，保温90min，热提2次，合并两次提取液，肾茶提取液需进行三次过滤，依次是纱布、棉花、滤纸，滤液浓缩至153.3mL，备用；
S2、乳双歧杆菌的活化
取乳双歧杆菌冻干粉2.0g加入20ml无菌水混合均匀制备菌悬液，将菌悬液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9梯度稀释至不同浓度，用双层倾注法接种至琼脂TPY平皿培养基，用接种环将平皿培养基上分布均匀的菌落中的乳双歧杆菌接种至斜面培养基，冷藏储存，备用；从冰箱取出冷藏的斜面培养基，用接种环将乳双歧杆菌接种至TPY液体培养基(水解酪蛋白10g，植物胨5g，酵母粉2g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾(K2HPO4·7H2O)2g，氯化镁(MgCl2·6H2O)0.5g，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.25g，氯化钙(CaCl2)0.15g，氯化铁(FeCl3)0.1mg，半胱氨酸-盐酸0.5g，吐温-80 1mL溶于1000mL蒸馏水中，最终pH为6.5±0.2)，放置在37℃恒温培养箱中培养活化30h，得到细菌种子液，备用；
S3、乳双歧杆菌菌悬液制备
将上述培养乳双歧杆菌的TPY液体培养基置于水浴恒温振荡器使得细菌和液体培养基充分混合均匀，将细菌种子液倒入50mL灭菌离心管中，离心5min，离心条件为2000r/min。离心完成，去除上清液后，将无菌水加入只含有细菌的离心管中，制备菌悬液，通过平板菌落计数法得知菌悬液浓度为1.19×106CFU/mL，所得菌悬液备用；
S4、肾茶水提液发酵
量取步骤S1中得到的153.3mL肾茶水提液置于250mL的锥形瓶中，在121℃下灭菌20min，冷却后，向其中再加入31mL已灭菌的TPY培养基(水解酪蛋白10g，植物胨5g，酵母粉2g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾(K2HPO4·7H2O)2g，氯化镁(MgCl2·6H2O)0.5g，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.25g，氯化钙(CaCl2)0.15g，氯化铁(FeCl3)0.1mg，半胱氨酸-盐酸0.5g，吐温-801mL溶于1000mL蒸馏水中，最终pH为6.5±0.2)，将步骤S3得到的乳双歧杆菌菌悬液按4％的接种量接入锥形瓶中，在34℃振荡培养箱中分别发酵24h、48h、72h、96h得到发酵产物，发酵结束后在121℃下灭菌20min，减压抽滤，所得滤液直接干燥，即得实验组样品；
(2)空白对照组样品处理：将上述步骤S4不加入乳双歧杆菌进行自然发酵72h，其他步骤一致得到的发酵液从自振荡培养箱取出后，在121℃灭菌20min后，减压抽滤，所得滤液直接干燥，即发酵干燥物，备用。
(3)乳双歧杆菌发酵肾茶发酵产物成分指标分析
称取肾茶水提物、实验组样品、空白对照组样品50.00mg，精密称定，分别置于10mL容量瓶中，用30％甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，在离心条件为3000r/min下离心5分钟，用0.22μm滤膜过滤上清液，所得滤液采用高效液相分析方法对肾茶发酵产物进行分析，具体分析方法为：C18-S,250mm×4.6mm；流动相：含有0.1％甲酸水溶液-甲醇，采用表7的梯度洗脱程序；流速：1mL/min；检测波长：254nm；柱温：35℃；进样量：20μL。
表7：
上述分析结果见表8和图15，从HPLC图谱可看出水提物与乳双歧杆菌发酵产物的组成成分没有显著变化，通过HPLC图谱比较乳双歧杆菌发酵的肾茶产物，以峰面积大于20000的峰计算，肾茶水体物有89个峰，肾茶乳双歧杆菌发酵24h有93个峰，肾茶乳双歧杆菌发酵48h有94个峰，肾茶乳双歧杆菌发酵72h有96个峰，肾茶乳双歧杆菌发酵96h有82个峰，说明用乳双歧杆菌发酵肾茶可产生新的成分，发酵72小时后达到最高值，随着发酵的继续进行发酵96h后成分反而较发酵前减少，因此，本发明中后续的实施例中采用72h发酵的肾茶乳双歧杆菌发酵产物进行实验。
(3)乳双歧杆菌肾茶发酵产物陈皮饮的制备
将乳双歧杆菌肾茶发酵产物(发酵72h)与陈皮提取物以质量比为2:1混合，陈皮提取方法见试验例六的水提法制备，其对小鼠高尿酸血症血尿酸、血肌酐、血尿素氮水平的影响结果见表8；
表8：
/>
注：与正常组相比#P<0.05,##P<0.01；与模型组相比，*P<0.05,**P<0.01
结论：从表8可知，植物乳杆菌、乳双歧杆菌两种细菌发酵肾茶得到的肾茶发酵物-陈皮组合物低、中、高剂量组均能一定程度的降低高尿酸血症小鼠的血尿酸值，血尿素氮值，与高尿酸血症模型组小鼠比较，差别具有统计学意义(P<0.01)，肾茶发酵物-陈皮组合物低剂量组能降低高尿酸血症小鼠血肌酐值，差别具有统计学意义(P<0.05)，肾茶发酵物-陈皮组合物中、高剂量组能降低高尿酸血症小鼠血肌酐值，差别具有统计学意义(P<0.05)。但从高血尿酸血症小鼠的血尿酸值、血尿素氮值、血肌酐值数值可知，肾茶植物乳杆菌发酵产物-陈皮组合物优于肾茶乳双歧杆菌发酵产物-陈皮组合物。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (4)
1.一种降尿酸的肾茶发酵组合物，其特征在于，所述肾茶发酵组合物由肾茶发酵产物、陈皮提取物组成，所述的肾茶发酵产物和陈皮提取物的混合质量比为1.2~4:1；所述肾茶采自西双版纳药用植物园；
所述肾茶发酵组合物的制备步骤为：
S1、肾茶水提物的制备
称取肾茶粉末浸泡于水中，然后加热提取，将提取液进行浓缩，备用；
S2、植物乳杆菌的活化
取植物乳杆菌冻干粉与无菌水混合制备菌悬液，将菌悬液稀释后接种至琼脂平皿培养基培养后接种至斜面培养基，冷藏备用；所述植物乳杆菌保藏号：CGMCC NO.18038；
取出冷藏的斜面培养基，将该培养基中的植物乳杆菌接种至种子培养基中，置于恒温培养箱中进行培养活化，得到细菌种子液，备用；
S3、植物乳杆菌菌悬液的制备
将细菌种子液倒入灭菌离心管中，离心去除上清液，向离心管中加入无菌水，充分混匀制备菌悬液，备用；
S4、肾茶的发酵
量取S1中的肾茶水提物置于发酵装置中，灭菌，冷却后，加入发酵培养基，接入植物乳杆菌菌悬液，接种量为2~5%，发酵后得到发酵产物；所述发酵培养基组成为：葡萄糖30g/ml，酵母浸粉7%，大豆蛋白胨7%，柠檬酸三铵0.4%，磷酸氢二钾0.8%，硫酸镁0.16%，吐温80 1%，硫酸锰0.04%，pH=6.0~6.5；所述发酵条件为30~40℃，培养时间24~96h；
S5、肾茶发酵组合物的制备
将陈皮加入水浸泡提取，将提取液过滤，干燥，得到陈皮提取物干粉，加入肾茶发酵产物混合得到肾茶发酵组合物。
2.根据权利要求1所述的肾茶发酵组合物，其特征在于，所述肾茶发酵组合物为茶饮、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、栓剂或滴剂。
3.根据权利要求2所述的肾茶发酵组合物，其特征在于，所述肾茶发酵组合物还包括药学上可接受的载体或药用辅料。
4.根据权利要求1所述的肾茶发酵组合物，其特征在于，所述S1中的肾茶粉末为肾茶干燥后经粉碎能通过10目筛且不能通过 50 目筛的肾茶粉末，所述肾茶粉末和蒸馏水的质量体积比为1g:1~50ml。
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