CN109528817A - 傣药肾茶酚类提取物的制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种傣药肾茶酚类提取物的制备方法及应用。制备方法如下：选择的原料为紫花肾茶，开花期割取地上部分，切断、烘干、粉碎；原料投入提取罐中，加入重量比10~30倍量的0%~95%乙醇‑水溶液40~60℃回流提取1~3次；提取液过滤，减压浓缩，大孔吸附树脂吸附，0%~95%乙醇梯度洗脱纯化，得到肾茶酚类提取物。所得的提取物主要成分为黄酮类化合物和多酚类成分，二者的重量百分比不低于50.0%，其中主要酚类化合物迷迭香酸和泽兰黄素的含量分别不低于5.5%和0.8%。本发明肾茶提取物的制备工艺简单易行，所得的酚类提取物具有抑菌、抗炎活性，用于治疗泌尿系统感染和炎症等疾病，具有良好的应用前景。

Description

傣药肾茶酚类提取物的制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及一种傣药肾茶酚类提取物的制备方法及其应用，属于植物提取物技术领域。
背景技术
肾茶（Clerodendranthus spicatus（Thunb.）C.Y. Wu）为唇形科肾茶属植物，又名猫须草，主要分布于东南亚的印度尼西亚、马来西亚、澳大利亚及周边岛屿；国内主要分布于福建、台湾、广西、广东和云南。肾茶全草入药，具有清热利湿、排石通淋的功效，主治急慢性肾炎、膀胱炎、尿路结石、胆结石、胆囊炎、肝炎、高血压、风湿性关节炎、前列腺炎等疾病，尤其对泌尿系结石有特殊疗效，被誉为“国际利尿化石药”。西双版纳版纳药业生产的国药准字号产品肾茶袋泡茶具有清洗肾脏、抗炎利尿、抑菌排毒之功效。用于急慢性肾炎、膀胱炎、尿路结石及风湿等症。
肾茶为西双版纳地区傣族常用药，傣药名“雅糯妙”，在傣族医术“档哈雅”“贝叶经”中记载用于治疗小便热、涩、疼痛等泌尿系统疾病，已有两千多年应用历史，疗效确切。肾茶也是泰国、马来西亚、印度尼西亚等东南亚国家传统药物的重要组成部分，民间广泛用于治疗扁桃体炎、风湿病、糖尿病、淋病、癫痫、高血压、月经紊乱、梅毒感染、肾结石、胆结石、水肿、发疹、发热、流感、肝炎和黄疸病。引入欧洲和日本被当做保健茶使用。
现代研究显示，肾茶中含有多种化学成分，包括黄酮类、二萜类、木脂素类、甾体类、多酚类等。国内外药理学研究显示：肾茶提取物具有利尿、抑菌、抗炎、抗氧化、免疫调节、健肾、降血糖、抗血栓等功效，临床主要用于尿路感染、尿路结石、肾功能不全、肾病综合征等疾病的治疗。根据文献报道，肾茶所含的酚类物质（黄酮和多酚）为治疗慢性肾炎的有效部位。
国内对肾茶提取工艺的研究多以总黄酮（杨江媛，2015；汤须崇，2011；蓝伦礼，2017；）或总多酚（李晓花，2016；张素斌，2015；）含量为指标，采用水、乙醇-水系统回流、超声等方法进行，总酚类物质的提取和纯化工艺研究极少（薛松，2016；辛雪；2014）。国内对肾茶药理活性的研究主要集中于水煎液对肾脏相关疾病的治疗（高敏，2017；谢丽萍，2012；刘广建，2007；张少贵，2014；高南南，1996；王丽敏，2013；刘旭航，2014；王立强，2011）和降尿酸和利尿活性（黄幼霞，2016；陈珠，2016；黄荣贵，1999）、抗泌尿系结石活性（蔡华芳，2008；蒋维晟，2009）、提高免疫力活性（岑小波，1999）、抑菌活性（易富，2013）、改善记忆的作用（汪泽栋，2013）和降血糖活性（李光，2013）。除此以外，涉及肾茶总黄酮的抗肿瘤活性（龙贺明，2017）、抑菌活性（甘典辉，2013；陈涛，2016）、神经保护作用（游建军，2015）；肾茶醇提取物的抗氧化活性（苏德禹，2014）等。虽然国内外对肾茶的化学成分研究较多，但目前关于肾茶有效部位的制备鲜有文献报道；药理活性研究中也缺少化学成分与活性相关联的研究。
《国家中成药标准汇编内科肾系分册》收载了“肾茶袋泡茶”傣药制剂，其制法为：肾茶切断、粉碎成粗粉，过筛，混匀，灭菌后低温干燥制得。制剂较为粗糙，有效成分在制剂中的含量较低，增加了病人口服用药剂量。
本专利中，申请人在前期实验的基础上，为了获得一种更有效的肾茶提取物及其制剂，对肾茶中有效成分酚类物质（包括总黄酮和多酚类）的提取方法和活性进行了考察，通过本方法，提取物中总酚类物质含量不少于50.0%。提取物的药理活性显示其具有显著的抗炎和抑菌活性，为其临床应用和综合开发提供了科学依据。
发明内容
（一）要解决的技术问题
本发明提供了一种傣药肾茶酚类提取物的制备方法及其用途。本方法制备的样品酚类物质含量不少于50.0%，主要酚类化合物迷迭香酸和泽兰黄素的含量分别不低于5.5%和0.8%，两种化合物的结构式为图1所示：
本发明获得的肾茶酚类提取物可用于制备治疗泌尿系统感染和炎症等疾病的药物。
（二）技术方案
本发明的目的之一为提供一种肾茶酚类提取物，其特征在于，所述肾茶酚类提取物主要成分为黄酮类和多酚类成分，总酚类的质量百分含量不低于50.0%，主要酚类化合物迷迭香酸和泽兰黄素的含量分别不低于5.5%和0.8%。
本发明中酚类物质的含量测定采用文献报道的分光光度法（辛雪等，2014），以迷迭香酸为对照品，亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠为显色剂，检测波长为500nm。
本发明的第二个目的是提供一种肾茶酚类提取物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：原料处理：采收开花期紫花肾茶地上部分，切断，干燥，粉碎，过10~100目筛；
步骤2：提取：肾茶干燥全草，用10~30倍量的0%~90%乙醇-水溶剂浸泡过夜，60~80℃回流提取1~3次，过滤，得到提取液。
步骤3：浓缩：将步骤2获得的提取液浓缩，得到提取物；
所选用的浓缩方法为常压浓缩或减压浓缩。
步骤4：纯化：提取物用适量水溶解，按照物料比1:5~1:15进行大孔树脂吸附，0%~95%乙醇-水系统洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至相对密度为1.0~1.5。
所选用的大孔树脂为AB-8、D101、HPD100、HPD400、NKA-2和NKA-9。
步骤5：干燥：将浓缩液经薄膜干燥、高温喷雾干燥或低温冷冻干燥，得到肾茶酚类提取物。
优选地，步骤1中肾茶粉碎后过10~20目筛；
更优选地，肾茶粉碎后过20目筛。
优选地，步骤2中所述的液料比为10~20倍，乙醇浓度为50~70%，回流提取温度为70~80℃，回流提取2~3次；
更优选地，步骤2中所述的液料比为液料比10:1，乙醇浓度为50%，回流提取3次，每次2h。
优选地，步骤4中酚类物质的纯化工艺，上样量与大孔树脂的比值为1:10~1:15，先用纯水洗脱，再用的乙醇浓度为50%~70%，洗脱体积为3~4个柱体积，大孔吸附树脂为AB-8或D101型。
更优选地，步骤4中酚类物质的纯化工艺：选用AB-8大孔树脂，上样量与大孔树脂的比值为1:15，纯水洗脱3个柱体积后，50%乙醇洗脱3个柱体积。
优选地，该方法包括如下步骤：
步骤1：原料处理：采收开花期紫花肾茶地上部分，切断，干燥，粉碎，过20目筛；
步骤2：提取：肾茶干燥全草，用10倍量的50%乙醇-水溶剂浸泡过夜， 80℃回流提取3次，过滤，得到提取液。
步骤3：浓缩：将步骤2获得的提取液浓缩，得到提取物；
步骤4：纯化：提取物适量水混悬，采用AB-8大孔树脂，按照物料比1:15进行吸附，纯水洗脱3个柱体积后，50%乙醇-水洗脱，收集3个柱体积的洗脱液，减压浓缩至相对密度为1.0~1.5。
步骤5：干燥：将浓缩液经薄膜干燥、高温喷雾干燥或低温冷冻干燥，得到肾茶酚类提取物。
经上述步骤获得的肾茶酚类提取物中，总酚类成分的含量高达80.5%，其中迷迭香酸含量为16.8%，泽兰黄素含量为2.4%。
本发明的第三个目的是提供肾茶酚类提取物的用途，用于制备预治疗泌尿系统感染和炎症等疾病的药物。
本发明人将所制备的肾茶酚类提取物进行了体外抗炎和抑菌活性实验，并采用动物模型进行了药效学实验，结果证明肾茶酚类提取物具有良好的抗菌、抗炎活性，可用于制备治疗泌尿系统感染和炎症等疾病的药物，为肾茶的临床应用和新产品开发提供了依据。
附图说明
图1泽兰黄素和迷迭香酸的结构式
图2 肾茶酚类提取物对RAW264.7细胞炎症因子释放的影响
具体实施方式：
实施例1：肾茶酚类物质的提取工艺
1.1 实验材料
1.1.1 仪器设备XL-5型流水式粉碎机（上海润实电器有限公司）；721型分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；DRRH-S4数显恒温水浴锅（上海双捷仪器设备有限公司）；PL 203型电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）等。
1.1.2 试剂
对照品：迷迭香酸对照品（产品编号：CFN99103，纯度≥98%，武汉天植生物技术有限公司），泽兰黄素对照品（产品编号：CFN90418，纯度≥98%，武汉天植生物技术有限公司），没食子酸（批号：110831-201204，纯度89.9%，中国食品药品检定研究院）。
试剂：亚硝酸钠、硝酸铝、甲醇（AR，天津市大茂化学试剂厂）；氢氧化钠（AR，天津市风船化学试剂科技有限公司）；无水乙醇（AR，成都市科龙化工试剂厂），福林酚试剂（BR，南京奥多尼生物科技有限公司）。
1.2 实验操作和实验结果
采用回流提取法，进行进行单因素试验和L9（34）正交试验，确定肾茶酚类化合物的最佳提取工艺。总酚类物质的检测方法采用Folin-Ciocalteu法；迷迭香酸和泽兰黄素的检测方法采用文献（薛松，2016）中报道的亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法进行。
1.2.1 标准曲线的建立
没食子酸标准曲线：准确称取没食子酸对照品，蒸馏水溶解定容。用移液管分别移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的标准没食子酸溶液于100 mL容量瓶中摇匀定容。分别移取不同浓度的没食子酸溶液与水（做空白对照）1 mL于10 mL棕色容量瓶中，加入10%福林酚试剂5mL摇匀后反应3~8 min，加入7.5%碳酸钠溶液4 mL，混匀。将反应体系室温反应2 h，在765nm处测定吸光值。以为吸光度（A）横坐标，为没食子酸浓度纵坐标绘制标准曲线。回归方程为：y = 47.175x - 0.4903（γ= 0.999）。
迷迭香酸和泽兰黄素标准曲线：精密称取迷迭香酸和泽兰黄素对照品，加入50%甲醇配置成一定浓度的对照品溶液。分别准确吸取各对照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，分别移入10 mL比色管中，补加50%乙醇至5.0 mL，各加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，振摇后放置5 min，加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀后放置60 min，加入1.0 mol/L氢氧化钠溶液2.0 mL，用50%乙醇定容至刻度，以零管作为空白，在500nm和510 nm处测定迷迭香酸和泽兰黄素的吸光度值，绘制含量(mg/mL)与吸光度的标准曲线。回归方程为y迷迭香酸 =11.854x +0.9524（γ= 0.998）和Y泽兰黄素=7354.3x - 6.9524（γ= 0.999）。
1.2.2 肾茶酚类化合物的提取
在其他因素一致的条件下，分别考察溶剂浓度、液料比、提取时间和提取次数等因素对肾茶酚类化合物提取效率的影响。在此基础上，为了进一步优化提取条件，采用四因素三水平正交实验进行最佳提取工艺考察。实验结果见表1。
表1 肾茶多酚提取工艺正交实验结果分析
通过以上实验结果，肾茶中酚类物质的最佳提取工艺为：10倍量50%乙醇回流提取2次，每次2h，得到的提取物中总酚类物质的含量为45.42%，主要酚类化合物迷迭香酸和泽兰黄素的含量分别为6.35%和0.88%
实施例2：肾茶酚类提取物的制备
1.1 实验材料
1.1.1 仪器
同实施例1
1.1.2 试剂耗材
大孔树脂HPD-100、HPD-200A、HPD-400A、HPD-500、HPD-600、HPD-826（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；D101和AB-8（天津浩聚树脂科技有限公司）。
对照品：同实施例1.
1.2 实验操作和实验结果
1.2.1 肾茶酚类化合物的提取
同实施例1中1.2.2实验编号4的操作，制备肾茶酚类提取物。将提取物浓缩，备用。
1.2.2 不同型号大孔树脂静态吸附量和解吸率实验
肾茶提取物加50%乙醇溶液溶解，配制成1g/mL的溶液，备用。
称取预处理的大孔树脂各1g，置于具塞三角瓶中编号，分别加入10mL提取液，置摇床室温震荡24h，抽滤，取滤液测定酚类化合物含量。用去离子水清洗树脂2次，滤纸吸干树脂表面水分后，将树脂转入具塞三角瓶中，加入50%乙醇10mL，室温震荡解吸24h，取上清液测定酚类化合物含量，按照下列公式计算吸附率和解吸率。
式中：C0—起始浓度（mg/mL）
C1—平衡浓度（mg/mL）
V1—吸附溶液体积（mL）
W—树脂重量（g）
C2—解吸后溶液中酚类物质含量
V2—解吸溶液体积。
实验结果见表2。结果显示：静态吸附和解吸效果较好的树脂为HPD-100、HPD-826和AB-8。综合考虑成本、常用性等因素，选择AB-8作为纯化肾茶酚类提取物的树脂型号。
表2不同型号树脂的静态吸附量和解吸率测定结果
肾茶提取物中迷迭香酸和泽兰黄素的含量与总酚含量对比，数量较低，因此，动态吸附和解吸的参数确定以总酚为指标进行考察。
1.2.3 洗脱机乙醇浓度的考察
AB-8大孔树脂预处理，各取1g，三组，每组3份，置于100mL具塞三角瓶中，精密加入1g/mL肾茶提取物10mL，按照1.2.2项下方法震荡24h，达到饱和吸附，分离树脂，吸干表面水分。分别加入30%、50%和70%乙醇溶液各10mL，震荡24h过滤，测定洗脱液中酚类化合物含量，结果显示50%乙醇解析率最高，选择50%乙醇为洗脱剂。
1.2.4 上样浓度的考察
称取3组（每组3份）处理好的大孔树脂10g，装柱，分别加入浓度为1.0g/mL、0.5g/mL和0.25g/mL的提取溶液各1mL、10mL和20mL。完全吸附后用4BV的去离子水除去多糖、蛋白质等物质后，10倍树脂量的50%乙醇恒流状态下洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中酚类物质含量，计算转移率，分别为76.6%、89.5%和53.2%，因此选择0.5g/mL提取物上样。
1.2.5 泄露曲线的绘制
取预处理的AB-8大孔树脂10g湿法装柱，量取上样液（0.5g/mL）50mL上样，以1mL/min的体积流量动态吸附，收集流份，10mL/份，收集10管，以5%为限，计算泄漏率，确定最大上样量。结果表明，第5份流出液开始大量泄露，扣除树脂间水分，树脂上样量应小于0.20g提取物。
1.2.6 洗脱剂用量
预处理AB-8大孔树脂10g湿法装柱，0.5g/mL的提取液5mL上样，4BV去离子水除杂后，50%乙醇1mL/min体积流量洗脱，每个BV收集1份，测定每份洗脱液中分类化合物的含量，计算累积洗脱量。结果显示：3BV后，洗脱液中酚类物质含量基本不再增加，故选择3BV的50%乙醇洗脱。
1.2.7 验证实验
称取已处理好的AB-8型大孔树脂100g湿法装柱，取0.5g/mL肾茶提取液100mL上柱，4BV去离子水洗脱后，3BV50%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，测定纯化后样品中总酚及两个主要酚类物质的含量，分别为总酚80.5%，其中迷迭香酸含量为16.8%，泽兰黄素含量为2.4%。验证实验结果表明该纯化工艺稳定可行。
实施例3：肾茶酚类提取物抗炎作用实验
1.1 实验材料
1.1.1 试剂与耗材：
肾茶酚类提取物（按照1.2.7方法制备）；DMEM培养基、胎牛血清、磷酸盐缓冲液（PBS）（美国gibco公司）；DMSO、胰酶、脂多糖、地塞米松（美国sigma公司）；NO检测试剂盒（碧云天生物技术公司）。
1.1.2 仪器设备
CO2培养箱（美国赛默飞），恒温数显水浴锅（上海一恒），超净工作台（苏州安泰），多功能酶标仪（美国博腾）等。
1.2实验方法
1.2.1 肾茶多酚提取物的配制：称取多酚样品10mg，加0.5%DMSO-培养基1mL溶解，0.22µm滤膜过滤，-20℃冰箱避光保存，备用。
1.2.2 阳性对照药的配制：称取地塞米松0.2mg，完全培养基配制成200µg/mL的溶液，-20℃冰箱避光保存，备用。
1.2.3 建立细胞炎症模型
LPS（脂多糖）诱导的RAW264.7细胞炎症模型。
1）MTT法检测肾茶多酚提取物对RAW264.7细胞的毒性
取对数生长期的RAW246.7细胞，消化后吹打均匀，用培养基稀释至RAW264.7细胞密度为4~5×104个/mL。每孔100µL接种于96孔板中，于37℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，每孔加入不同浓度的肾茶多酚提取物溶液100µL，使DMSO最终质量分数低于0.1%，肾茶酚类提取物的终浓度分别为0、25、50、100µg/mL，每孔设置5个重复，轻轻震荡后，置培养箱中培养24h，每孔避光加入150µLMTT溶液，培育4h后，吸除各孔中溶剂，分别于每孔中加入150µLDMSO，振荡器震荡10min使各孔中的结晶充分溶解，570nm处酶标仪测定OD值。
实验结果显示：各浓度肾茶酚类提取物对小鼠细胞系RAW264.7没有表现出毒性，且随着浓度的增加，细胞存活率有增长的趋势，说明肾茶酚类提取物在一定浓度范围内可以提高RAW264.7细胞的活力。
2）细胞炎症因子NO含量的检测
按照试剂盒说明书，采用Griess法检测，如图2所示：
图2实验结果显示，肾茶酚类提取物具有明显的抑制NO释放量的作用，以LPS处理的细胞中NO含量100%计，随着肾茶样品浓度的增加，对NO释放的抑制作用显著增加，浓度为100µg/mL时，NO的释放量降低至43.7%，抑制率达到57.3%。
实施例3 肾茶酚类提取物体外抑菌活性
1.1 实验材料
耗材：选取泌尿系炎症主要致病菌大肠埃希菌、常见菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌（北京克瑞斯博生物科技有限公司），MH培养基（自制）。
设备：生化培养箱、超净工作台，二氧化碳培养箱等。
1.2 实验方法—抑菌圈的测定
采用纸片琼脂平板扩散法进行提取物抑菌圈测定。取各提取物样品各25 mg,溶于1 mL的DMSO中，混合均匀制成25 mg/mL的初始药液备用。取灭菌双层圆形滤纸片(直径6 mm ) ，10μL移液器定量量取8μL各样品(25 mg/mL)至纸片上，轻轻放在含菌平板相应位置(注意不要拖动纸片)，然后轻轻按压使纸片紧贴在培养基表面，每个样品设3个对角平行组。贴好纸片的含菌平板倒置放入4 ℃冰箱静置2 h后，再置于恒温培养箱进行培养， 37℃培养16-18h。培养结束后，用精确度为1/10 mm的游标卡尺十字交叉测量抑菌圈直径，实验结果取三个平行组的平均值。DMSO为空白对照，对羟基苯甲酸乙酯为阳性对照。实验结果重复三次取平均值。
表3肾茶酚类提取物的平均抑菌圈（mm）
由上表实验数据显示：肾茶酚类提取物对三种菌均有一定的抑制作用，为肾茶临床用于泌尿系统疾病提供了理论支持。

Claims (3)

1.一种肾茶酚类提取物，其特征在于，所述肾茶酚类提取物主要成分为黄酮类和多酚类成分，总酚类的质量百分含量不低于50.0%，主要酚类化合物迷迭香酸和泽兰黄素的含量分别不低于5.5%和0.8%；
所述的肾茶酚类提取物的制备方法包括以下步骤：
步骤1：原料处理：采收开花期紫花肾茶地上部分，切断，干燥，粉碎，过10~100目筛；
步骤2：提取：肾茶干燥全草，用10~30倍量的0%~90%乙醇-水溶剂浸泡过夜，60~80℃回流提取1~3次，过滤，得到提取液；
步骤3：浓缩：将步骤2获得的提取液浓缩，得到提取物；
所选用的浓缩方法为常压浓缩或减压浓缩；
步骤4：纯化：提取物用适量水溶解，按照物料比1:5~1:15进行大孔树脂吸附， 0%~95%乙醇-水系统洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至相对密度为1.0~1.5；
所选用的大孔树脂为非极性大孔树脂HPD-100、HPD-200A、HPD-400A、HPD-500、HPD-600、HPD-826、D101和AB-8；
步骤5：干燥：将浓缩液经薄膜干燥、高温喷雾干燥或低温冷冻干燥，得到肾茶酚类提取物。
2.根据权利要求1所述的肾茶提取物，其特征在于，所述的提取物中酚类成分的含量不低于50.0%，主要酚类化合物迷迭香酸和泽兰黄素的含量分别不低于5.5%和0.8%。
3.根据权利要求1所述的制备方法获得的肾茶酚类提取物在制备治疗泌尿系统感染和炎症的药剂；所制药剂为药剂学上允许的口服制剂。
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