CN103113434B - 一种从油用牡丹籽饼粕中制备单萜苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种从油用牡丹籽饼粕中一种制备单萜苷类化合物的方法，本发明以油用牡丹籽榨油后剩余的籽饼粕为原料，经过粉碎，有机溶剂脱脂，采用乙醇回流提取，分离手段包括有机溶剂脱脂、溶剂提取、大孔吸附树脂层析等方法，从油用牡丹籽饼粕中制备分离得到单萜苷类化合物，本发明简便，快捷，所得到单萜苷类化合物纯度高，收率高，为油用牡丹籽榨油后剩余饼粕的开发研究奠定基础。

Description

一种从油用牡丹籽饼粕中制备单萜苷的方法

技术领域

本发明涉及一种制备单萜苷的方法，具体的说是涉及一种从油用牡丹籽饼粕中制备单萜苷化合物的方法，属于中药有效成分提取分离及应用技术。

背景技术

单萜苷是一类在芍药科中分布很广泛的一类化合物，同时也是一类具有非常广泛生物活性的化合物，对免疫、心血管、中枢神经系统以及平滑肌等方面均有肯定的药理作用。单萜苷类化合物大量存在于芍药属植物中，是芍药属植物特征性活性成分。

牡丹籽油含有多种不饱和脂肪酸，尤其是罕见的奇数脂肪酸，是一种具有重要开发价值的食用油脂来源。2011年3月22日，中华人民共和国卫生部批准自丹凤牡丹(Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang)和紫斑牡丹(Paeonia rockii)的籽经过经压榨、脱色、脱臭等工艺制成的牡丹籽油作为新资源食品可以生产及食用【中华人民共和国卫生部公告，2011年第9号：卫生部关于批准元宝枫籽油和牡丹籽油作为新资源食品的公告】。这将为牡丹籽油的生产和使用起到非常大的促进作用。

由于牡丹籽油的高营养价值，我国油用牡丹籽的种植量在逐渐增多，油用牡丹籽的产量也逐年增加。按照目前的产量，油用牡丹籽产量为3万吨，按照出油率为30%计算，榨油后将会产生大约2万吨的牡丹籽饼粕，这些牡丹籽饼粕的开发利用将会是一个非常重要且任务艰巨的研究课题。

发明内容

本发明的目的是提供一种从牡丹籽榨油后剩余的籽饼粕中制备分离单萜苷的方法。该方法过程简单，所提取得到的单萜苷纯度较高，具有多种生物活性。

本发明所采用的技术方案是：一种从油用牡丹籽饼粕中制备单萜苷的方法，包括以下步骤：

（1）制备原料：将榨油后的油用牡丹籽饼粕粉碎、干燥，制得原料，备用；

（2）有机溶剂脱脂：向步骤（1）制取的原料中加入占原料重量6~8倍的有机溶剂，回流3~5小时，冷却至50℃后过滤出有机溶剂，继续向原料中加入占原料重量6~8倍的有机溶剂，回流3~5小时，冷却至50℃后过滤出有机溶剂，得到脱脂后的牡丹籽饼粕备用；

（3）回流提取：向步骤（2）制取的脱脂后的牡丹籽饼粕中加入占原料重量10~12倍的浓度为70~90%的乙醇，加热回流3~5小时，过滤得残渣，继续向残渣中加入占原料重量10~12倍的浓度为70~90%的乙醇，加热回流3~5小时，过滤得残渣，如此提取三次，合并滤液，将滤液减压至-0.08~-0.10MPa蒸发浓缩至无醇味，得溶液备用；

（4）溶剂提取： 在步骤（3）得到的溶液中加入占原料质量4~6倍的无水乙醇，静止12~24小时后过滤，弃去不溶物，滤液在40~60℃减压至-0.08~-0.10MPa浓缩至无溶剂挥出，得混合物备用；

（5）大孔吸附树脂层析：在温度为50~60℃、300W的超声条件下，向步骤（4）制取的混合物中加入占其质量15~20倍的浓度为30%的乙醇，使混合物充分溶解，过滤，弃去不溶物，将溶解部分用质量为混合物的80~100倍的大孔吸附树脂充分吸附，然后依次用浓度为30%、40%、60%、70%、90%的乙醇水溶液进行脱洗，每个体系脱洗3~4倍柱体积，采用HPLC测定，收集单萜苷含量大于30%的馏分段，即得到单萜苷化合物。

所述的油用牡丹籽饼粕为凤丹籽饼粕或紫斑牡丹籽饼粕。

所述的步骤（2）中采用的有机溶剂是石油醚、正己烷、环己烷中的一种或几种混合。

所述的过滤采用离心、抽滤、超滤或者压滤。

所述的大孔吸附树脂采用弱极性或中等极性中的任何一种。

本发明的有益效果是：本发明是从油用牡丹，主要是凤丹牡丹(Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang)和紫斑牡丹(Paeonia rockii)籽榨油后的下脚料牡丹籽饼粕中制备分离单萜苷，采用的原料为制备牡丹籽油(Peony Seed Oil)后的下脚料，为资源的进一步开发利用，不会影响到原植物的其它功能和价值。本发明采用有机溶剂脱脂(石油醚或正己烷或环己烷)、有机溶剂乙醇提取、醇沉、大孔吸附树脂吸附等工艺较大规模的制备纯度高的单萜苷，单萜苷纯度达到55%以上，其中主要成分芍药苷含量大于35%。可以单独或与适宜的赋形剂等结合，按照常规方法制成口服或非口服剂型的药物。

具体实施方式

实施例1

（1）原料制备：将榨油后的油用牡丹籽饼粕粉碎、干燥，制得原料，取1Kg备用；

（2）有机溶剂脱脂：向步骤（1）制取的原料中加入8倍的石油醚，回流5小时，冷却至50℃后过滤出石油醚，继续向原料中加入6倍的石油醚，回流3小时，冷却至50℃后过滤出石油醚，得到脱脂后的牡丹籽饼粕备用；

（3）回流提取：向步骤（2）制取的脱脂后的牡丹籽饼粕中加入占原料质量12倍的浓度为90%的乙醇加热回流，过滤残渣，继续向残渣中加入占原料质量12倍的浓度为90%的乙醇加热回流，过滤残渣，如此提取三次，合并滤液，滤液减压至-0.08MPa蒸发浓缩至无醇味；

（4）溶剂提取： 在步骤（3）得到的溶液中加入占原料质量6倍的无水乙醇，静止24小时后过滤，弃去不溶物，滤液在60℃减压至-0.10MPa浓缩至无溶剂挥出，称重，得样品275g；

（5）大孔吸附树脂层析：在温度为60℃、超声功率为300W的条件下向步骤（4）制取的混合物中加入占混合物质量20倍的浓度为30%的乙醇，使混合物充分溶解，过滤，弃去不溶物，将溶解部分用质量为步骤（4）制取的混合物的质量的100倍的大孔吸附树脂充分吸附，然后依次用浓度为30%、40%、60%、70%、90%的乙醇-水溶液进行洗脱，每个体系洗脱3-4倍柱体积，采用HPLC测定，收集芍药苷含量大于30%的馏分段，即得到单萜苷化合物，称重，得样品65 g，经过检测，芍药苷含量41.5%，总单萜苷含量63.8%。

实施例2

（1）原料制备：将榨油后的油用牡丹籽饼粕粉碎、干燥，制得原料，取2Kg备用；

（2）有机溶剂脱脂：向步骤（1）制取的原料中加入6倍的正己烷，回流3小时，冷却至50℃后过滤出正己烷，继续向原料中加入4倍的正己烷，回流3小时，冷却至50℃后过滤出正己烷，得到脱脂后的牡丹籽饼粕备用；

（3）回流提取：向步骤（2）制取的脱脂后的牡丹籽饼粕中加入占原料质量10倍的浓度为70%的乙醇加热回流，过滤残渣，继续向残渣中加入占原料质量10倍的浓度为70%的乙醇加热回流，过滤残渣，如此提取三次，合并滤液，滤液减压至-0.08MPa蒸发浓缩至无醇味；

（4）溶剂提取： 在步骤（3）得到的溶液中加入占原料4倍的无水乙醇，静止18小时后过滤，弃去不溶物，滤液在40℃减压至-0.10MPa浓缩至无溶剂挥出，称重，得样品257g；

（5）大孔吸附树脂层析：在温度为60℃、超声功率为300W的条件下向步骤（4）制取的混合物中加入占混合物质量15倍的浓度为30%的乙醇，使混合物充分溶解，过滤，弃去不溶物，将溶解部分用质量为步骤（4）制取的混合物的质量的80倍的大孔吸附树脂充分吸附，然后依次用浓度为30%、40%、60%、70%、90%的乙醇-水溶液进行洗脱，每个体系洗脱3-4倍柱体积，采用HPLC测定，收集芍药苷含量大于30%的馏分段，即得到单萜苷化合物，称重，得样品57.3 g，经过检测，芍药苷含量38.7%，总单萜苷含量60.8%。

实施例3

（1）原料制备：将榨油后的油用牡丹籽饼粕粉碎、干燥，制得原料，取2Kg备用；

（2）有机溶剂脱脂：向步骤（1）制取的原料中加入6倍的环己烷，回流3小时，冷却至50℃后过滤出环己烷，继续向原料中加入6倍的正己烷，回流3小时，冷却至50℃后过滤出正己烷，得到脱脂后的牡丹籽饼粕备用；

（3）回流提取：向步骤（2）制取的脱脂后的牡丹籽饼粕中加入占原料质量10倍的浓度为70%的乙醇加热回流，过滤残渣，继续向残渣中加入占原料质量10倍的浓度为70%的乙醇加热回流，过滤残渣，如此提取三次，合并滤液，滤液减压至-0.08MPa蒸发浓缩至无醇味；

（4）溶剂提取： 在步骤（3）得到的溶液中加入占原料质量4倍的无水乙醇，静止12小时后过滤，弃去不溶物，滤液在40℃减压至-0.10MPa浓缩至无溶剂挥出，称重，得样品287g；

（5）大孔吸附树脂层析：在温度为60℃、超声功率为300W的条件下向步骤（4）制取的混合物中加入占混合物质量15倍的浓度为30%的乙醇，使混合物充分溶解，过滤，弃去不溶物，将溶解部分用质量为步骤（4）制取的混合物的质量的80倍的大孔吸附树脂充分吸附，然后依次用浓度为30%、40%、60%、70%、90%的乙醇-水溶液进行洗脱，每个体系洗脱3-4倍柱体积，采用HPLC测定，收集芍药苷含量大于30%的馏分段，即得到单萜苷化合物，称重，得样品71.3g，经过检测，芍药苷含量36.2%，总单萜苷含量57.8%。

实施例4

（1）原料制备：将榨油后的油用牡丹籽饼粕粉碎、干燥，制得原料，取1Kg备用；

（2）有机溶剂脱脂：向步骤（1）制取的原料中加入8倍的正己烷，回流5小时，冷却至50℃后过滤出正己烷，继续向原料中加入6倍的石油醚，回流3小时，冷却至50℃后过滤出石油醚，得到脱脂后的牡丹籽饼粕备用；

（3）回流提取：向步骤（2）制取的脱脂后的牡丹籽饼粕中加入占原料质量12倍的浓度为90%的乙醇加热回流，过滤残渣，继续向残渣中加入占原料质量12倍的浓度为90%的乙醇加热回流，过滤残渣，如此提取三次，合并滤液，滤液减压至-0.09MPa蒸发浓缩至无醇味；

（4）溶剂提取： 在步骤（3）得到的溶液中加入占原料质量6倍的无水乙醇，静止24小时后过滤，弃去不溶物，滤液在60℃减压至-0.09MPa浓缩至无溶剂挥出，称重，得样品268g；

（5）大孔吸附树脂层析：在温度为60℃、超声功率为300W的条件下向步骤（4）制取的混合物中加入占混合物质量20倍的浓度为30%的乙醇，使混合物充分溶解，过滤，弃去不溶物，将溶解部分用质量为步骤（4）制取的混合物的质量的100倍的大孔吸附树脂充分吸附，然后依次用浓度为30%、40%、60%、70%、90%的乙醇-水溶液进行洗脱，每个体系洗脱3-4倍柱体积，采用HPLC测定，收集芍药苷含量大于30%的馏分段，即得到单萜苷化合物，称重，得样品61g，经过检测，芍药苷含量37.9%，总单萜苷含量58.1%。

实施例5

（1）原料制备：将榨油后的油用牡丹籽饼粕粉碎、干燥，制得原料，取1Kg备用；

（2）有机溶剂脱脂：向步骤（1）制取的原料中加入7倍的环己烷烷，回流4小时，冷却至50℃后过滤出环己烷，继续向原料中加入7倍的石油醚，回流4小时，冷却至50℃后过滤出石油醚，得到脱脂后的牡丹籽饼粕备用；

（3）回流提取：向步骤（2）制取的脱脂后的牡丹籽饼粕中加入占原料质量11倍的浓度为83%的乙醇加热回流，过滤残渣，继续向残渣中加入占原料质量11倍的浓度为83%的乙醇加热回流，过滤残渣，如此提取三次，合并滤液，滤液减压至-0.09MPa蒸发浓缩至无醇味；

（4）溶剂提取： 在步骤（3）得到的溶液中加入占原料质量5倍的无水乙醇，静止18小时后过滤，弃去不溶物，滤液在50℃减压至-0.09MPa浓缩至无溶剂挥出，称重；

（5）大孔吸附树脂层析：在温度为55℃、超声功率为300W的条件下向步骤（4）制取的混合物中加入占混合物质量17倍的浓度为30%的乙醇，使混合物充分溶解，过滤，弃去不溶物，将溶解部分用质量为步骤（4）制取的混合物的质量的90倍的大孔吸附树脂充分吸附，然后依次用浓度为30%、40%、60%、70%、90%的乙醇-水溶液进行洗脱，每个体系洗脱3-4倍柱体积，采用HPLC测定，收集芍药苷含量大于30%的馏分段，即得到单萜苷化合物。

实施例6

（1）原料制备：将榨油后的油用牡丹籽饼粕粉碎、干燥，制得原料，取1Kg备用；

（2）有机溶剂脱脂：向步骤（1）制取的原料中加入7倍的环己烷烷，回流4小时，冷却至50℃后过滤出环己烷，继续向原料中加入8倍的环己烷，回流5小时，冷却至50℃后过滤出环己烷，得到脱脂后的牡丹籽饼粕备用；

（3）回流提取：向步骤（2）制取的脱脂后的牡丹籽饼粕中加入占原料质量10倍的浓度为90%的乙醇加热回流，过滤残渣，继续向残渣中加入占原料质量11倍的浓度为70%的乙醇加热回流，过滤残渣，如此提取三次，合并滤液，滤液减压至-0.09MPa蒸发浓缩至无醇味；

（4）溶剂提取： 在步骤（3）得到的溶液中加入占原料质量4倍的无水乙醇，静止12小时后过滤，弃去不溶物，滤液在50℃减压至-0.09MPa浓缩至无溶剂挥出，称重；

（5）大孔吸附树脂层析：在温度为50℃、超声功率为300W的条件下向步骤（4）制取的混合物中加入占混合物质量17倍的浓度为30%的乙醇，使混合物充分溶解，过滤，弃去不溶物，将溶解部分用质量为步骤（4）制取的混合物的质量的90倍的大孔吸附树脂充分吸附，然后依次用浓度为30%、40%、60%、70%、90%的乙醇-水溶液进行洗脱，每个体系洗脱3-4倍柱体积，采用HPLC测定，收集芍药苷含量大于30%的馏分段，即得到单萜苷化合物。

实施例7

（1）原料制备：将榨油后的油用牡丹籽饼粕粉碎、干燥，制得原料，取1Kg备用；

（2）有机溶剂脱脂：向步骤（1）制取的原料中加入6倍的环己烷烷，回流3小时，冷却至50℃后过滤出正己烷，继续向原料中加入7倍的石油醚，回流4小时，冷却至50℃后过滤出正己烷，得到脱脂后的牡丹籽饼粕备用；

（3）回流提取：向步骤（2）制取的脱脂后的牡丹籽饼粕中加入占原料质量12倍的浓度为83%的乙醇加热回流，过滤残渣，继续向残渣中加入占原料质量10倍的浓度为70%的乙醇加热回流，过滤残渣，如此提取三次，合并滤液，滤液减压至-0.10MPa蒸发浓缩至无醇味；

（4）溶剂提取： 在步骤（3）得到的溶液中加入占原料质量6倍的无水乙醇，静止24小时后过滤，弃去不溶物，滤液在50℃减压至-0.08MPa浓缩至无溶剂挥出，称重；

（5）大孔吸附树脂层析：在温度为55℃、超声功率为300W的条件下向步骤（4）制取的混合物中加入占混合物质量15倍的浓度为30%的乙醇，使混合物充分溶解，过滤，弃去不溶物，将溶解部分用质量为步骤（4）制取的混合物的质量的90倍的大孔吸附树脂充分吸附，然后依次用浓度为30%、40%、60%、70%、90%的乙醇-水溶液进行洗脱，每个体系洗脱3-4倍柱体积，采用HPLC测定，收集芍药苷含量大于30%的馏分段，即得到单萜苷化合物。

芍药苷含量的测定方法：采用Agilent Zorbax SB C₁₈色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈-磷酸二氢钾缓冲盐(PH=2.5) 20：80等度洗脱，流速1 mL·min^-1，检测波长230 nm，柱温30℃。

总单萜苷含量测定方法：采用苯甲酸作为标准对照品，利用紫外-可见分光光度法，在230 nm处测试：称取10毫克苯甲酸，采用85%乙醇配置成100 μg/mL的苯甲酸储备液，在取一定量的储备液稀释成5.00，4.00，3.00，2.00，1.00，0.50 μg/mL，在230nm处测定紫外吸收，以吸光度A和浓度C进行线性回归分析，得标准曲线。由测定的样品吸光度A，按照下列公式计算出总单萜苷的含量。

总单萜苷(%)=(苯甲酸质量×480.27×提取液稀释倍数)/(样品粉末质量×122.12×10⁶)。

Claims (1)

1.一种从油用牡丹籽饼粕中制备单萜苷的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）原料制备：将榨油后的油用牡丹籽饼粕粉碎、干燥，制得原料，取1Kg备用；

（2）有机溶剂脱脂：向步骤（1）制取的原料中加入占原料重量8倍的石油醚，回流5小时，冷却至50℃后过滤出石油醚，继续向原料中加入占原料重量6倍的石油醚，回流3小时，冷却至50℃后过滤出石油醚，得到脱脂后的牡丹籽饼粕备用；

（3）回流提取：向步骤（2）制取的脱脂后的牡丹籽饼粕中加入占原料质量12倍的浓度为90%的乙醇加热回流，过滤得残渣，继续向残渣中加入占原料质量12倍的浓度为90%的乙醇加热回流，过滤残渣，如此提取三次，合并滤液，滤液减压至-0.08MPa蒸发浓缩至无醇味；

（4）溶剂提取：在步骤（3）得到的溶液中加入占原料质量6倍的无水乙醇，静止24小时后过滤，弃去不溶物，滤液在60℃减压至-0.10MPa浓缩至无溶剂挥出，称重，得样品275g，备用；

（5）大孔吸附树脂层析：在温度为60℃、超声功率为300W的条件下向步骤（4）制取的混合物中加入占混合物质量20倍的浓度为30%的乙醇，使混合物充分溶解，过滤，弃去不溶物，将溶解部分用质量为步骤（4）制取的混合物的质量的100倍的大孔吸附树脂充分吸附，然后依次用浓度为30%、40%、60%、70%、90%的乙醇-水溶液进行洗脱，每个体系洗脱3-4倍柱体积，采用HPLC测定，收集芍药苷含量大于30%的馏分段，即得到单萜苷化合物，称重，得样品65 g，经过检测，芍药苷含量41.5%，总单萜苷含量63.8%。