CN103819445B - 小叶莲中两个具有降血脂活性的新异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法 - Google Patents

小叶莲中两个具有降血脂活性的新异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及小叶莲中两个具有降血脂活性的新异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法，有效解决快速从小叶莲中制备两个具有降血脂活性的新异戊烯基化黄酮的问题，包括如下步骤：（1）粗提取物的制备；（2）硅胶柱色谱初步分离；（3）高速逆流色谱纯化，两个新异戊烯基化黄酮类化合物的结构经高分辨率质谱、核磁共振氢谱、碳谱、二维谱进行鉴定，本发明方法稳定可靠，效率高，可快速从小叶莲中分离得到两个新的异戊烯基化黄酮类化合物，并经活性试验表明可加速细胞内胆固醇流出，降低细胞内胆固醇含量。

Description

小叶莲中两个具有降血脂活性的新异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是一种小叶莲中两个具有降血脂活性的新异戊烯基化黄酮类化合物桃儿七酮A（sinoflavonoid A）和桃儿七酮B（sinoflavonoid B）的制备方法。
背景技术
小叶莲是小檗科桃儿七属植物鬼臼Sinopodophyllum emodi(Wall.)Ying.的干燥成熟果实。鬼臼是一种具有悠久历史的药用植物，古代《神农本草经》中就有记载：杀大毒，疗咳嗽喉疾，风邪烦感，失魄妄见。不入汤。以后的历代本草亦多有记载，主要用于活血散结、祛风除湿、虫蛇咬伤、跌打、心胃痛、风寒咳嗽、月经不调、铁棒锤中毒、风湿筋骨痛及气管炎等症。鬼臼分布比较广泛，我国主要分布在四川、青海、西藏、甘肃、陕西。小叶莲作为传统藏药始载于《月王药诊》，具有悠久的药用历史。化学成分研究表明主要含有木脂素和黄酮类化合物，其中异戊烯基化黄酮类化合物是小叶莲中代表性的活性成分，具有重要而广泛的生物活性如抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗骨质疏松、预防老年痴呆、抗糖尿病、心脑血管保护、雌激素样等。中国发明专利CN102382092A和CN102335165A公开了小叶莲中异戊烯基化黄酮的分离方法，采用反复的色谱方法如硅胶柱色谱、离心薄层色谱、SephadexLH-20凝胶柱色谱、中低压液相色谱、半制备高效液相色谱等方法，这些方法的不足之处是：分离周期长，溶剂消耗量大，样品回收率低，分离效果不理想。高速逆流色谱是一种新型的无固相载体的连续液液分配色谱技术，近年来广泛应用于生命科学、中医药、现代农业等领域活性成分的分离纯化。高速逆流色谱技术不需要任何固态载体，避免样品与固相载体的作用而产生样品的变性、失活和不可逆吸附等，同时还具有高效、快速、样品制备量大、回收率高、费用低等优点。本发明首次采用硅胶柱色谱法富集目标成分，再用高速逆流色谱法分离纯化，建立了小叶莲中两个痕量的异戊烯基化黄酮类化合物（sinoflavonoid A和sinoflavonoid B）的快速制备方法。该方法分离效率高、时间短，溶剂消耗量小，样品回收率高，得到的目标成分纯度高。现有方法中，尚未见硅胶柱色谱法和高速逆流色谱法相结合用于小叶莲中异戊烯基化黄酮单体分离的有关技术报道。化合物sinoflavonoid A和sinoflavonoid B为未见文献报道的新化合物。
高脂血症是脑卒中、冠心病、心肌梗死、心脏猝死等独立而重要的危险因素，是严重威胁人类生命健康的疾病。目前临床上广泛使用的降血脂药物主要包括HMG-COA还原酶抑制剂、贝特类等。由于多数合成药基于单靶点的作用，对于高血脂症的复杂的病因，很难取得理想的治疗效果。中草药在降血脂方面的应用历史悠久，从中草药中寻找具有降血脂的活性物质，研制特异性强、毒副作用小的新型药物具有重要的社会效益和经济效益。
发明内容
针对上述情况，为克服现在技术缺陷，本发明之目的就是提供一种小叶莲中两个具有降血脂活性的新异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法，可有效解决快速从小叶莲中制备两个具有降血脂活性的新异戊烯基化黄酮类化合物的问题。
本发明解决的技术方案是，包括如下步骤：（1）粗提取物的制备；（2）硅胶柱色谱初步分离；（3）高速逆流色谱纯化，两个新异戊烯基化黄酮类化合物（sinoflavonoid A和sinoflavonoid B）的结构经高分辨率质谱（HR-ESI-MS）、核磁共振氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)、二维谱（HSQC、HMBC）进行鉴定，其中：
所述步骤（1）粗提取物的制备方法是，小叶莲粉碎，过40目筛，每次用小叶莲重量6-12倍量的体积浓度为95%的乙醇在55℃、40kHz、200w超声提取3次，每次60min,合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩物，加浓缩物重量体积10-15倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为小叶莲粗提取物；所述的重量体积是指固体物以g计，液体物以ml计，以下同，如浓缩物为1g时，蒸馏水为10-15ml；
所述步骤（2）硅胶柱色谱初步分离方法是：乙酸乙酯萃取部位的浸膏小叶莲粗提取物经硅胶柱色谱初步分离，采用体积比为10:1-5的石油醚-丙酮系统进行梯度洗脱，流速为15mLmin-1，每100mL为1个流份，收集含有目标成分的流份，45℃减压浓缩，得到含有目标成分的总样；
所述步骤（3）高速逆流色谱纯化方法是：取步骤（2）得的含有目标成分的总样，用总样重量体积10倍量的体积比为4:6:4:4的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水混合制成混合溶剂系统，等体积取该混合溶剂系统中的上相溶剂和下相溶剂，对总样进行超声溶解，得到样品溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，条件是：另取混合溶剂系统的上相为固定相、下相为流动相，恒温循环器的温度为22-30℃，高速逆流色谱仪主机转速750-1000r/min，流动相流速1.0-2.0mLmin-1，两相在高速逆流色谱仪的色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入样品溶液，检测波长254nm，记录色谱图，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，得到两个新的异戊烯基化黄酮类化合物sinoflavonoid A和sinoflavonoid B，经高分辨率质谱（HR-ESI-MS）、核磁共振氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)、二维谱（HSQC、HMBC）进行鉴定，两个新的异戊烯基化黄酮类化合物sinoflavonoid A和sinoflavonoid B的化学结构式分别为：
本发明方法稳定可靠，效率高，可快速从小叶莲中分离得到两个新的异戊烯基化黄酮类化合物，并经活性试验表明可加速细胞内胆固醇流出，降低细胞内胆固醇含量。
具体实施方式
以下结合实际情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本发明在具体实施时，可由以下步骤实现：
（1）粗提取物的制备方法是，小叶莲4.09kg粉碎，过40目筛，每次用小叶莲重量8倍量的体积浓度为95%乙醇在55℃、40kHz、200w条件下，超声提取3次，每次60min，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，加蒸馏水5L混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为小叶莲粗提取物；
（2）硅胶柱色谱初步分离方法是，取小叶莲粗提取物50.07g，加入80mL丙酮溶解后，再加入100-200目的硅胶60g，45℃减压回收丙酮，得到载有样品的硅胶，取200-300目的硅胶1.94kg，加入石油醚7.5L，转移到140cm长×8cm内径的色谱柱中，用体积比10:1的石油醚-丙酮平衡色谱柱，将液面降至距硅胶面20cm处，将上述载有样品的硅胶加入到色谱柱的液面上，依次加入体积比为10:1、10:3、10:5梯度的石油醚-丙酮系统，每个梯度15L，进行梯度洗脱，流速为15mLmin-1，每100mL作为1个流份收集，将收集的流份经过TLC分析，合并含有目标成分的流份，减压浓缩，得到含有目标成分的总样，所述的TLC分析中使用的吸附剂为GF254，展开剂为体积比1:1的石油醚-丙酮；
（3）高速逆流色谱纯化方法是，取步骤（2）得的含有目标成分的总样，用总样重量体积10倍量的体积比为4:6:4:4的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水混合制成混合溶剂系统，等体积取该混合溶剂系统中的上相溶剂和下相溶剂，对总样进行超声溶解，得到样品溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，条件是：另取混合溶剂系统的上相为固定相、下相为流动相，开启恒温循环器，温度为25℃，用流速9.99mLmin-1将固定相注入高速逆流色谱的色谱柱，待充满整个色谱柱后，开启高速逆流色谱仪主机，缓慢将主机转速调整为800r/min，再以1.7mLmin-1流速注入流动相，待流动相从柱出口流出，两相在色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入样品溶液，254nm下检测，记录色谱图，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，得到两种粉末状sinoflavonoid A（化合物1）和sinoflavonoid B（化合物2）。
化合物的纯度检测：
HPLC分析确定目标成分的纯度，HPLC条件如下，YMC-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相A：甲醇，流动相B：0.1%三氟乙酸，梯度洗脱程序：0-70min，流动相A由30%升至90%；流速1.0mLmin-1；柱温为35℃；检测波长254nm，经面积归一化法测定，sinoflavonoidA(1，17.25mg)和sinoflavonoid B(2，25.88mg)的纯度分别为98.47%和99.38%。
化合物的结构鉴定
上述两种粉末，经过核磁共振光谱（1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC）及高分辨质谱(HR-ESI-MS)光谱技术鉴定了其化学结构：
化合物1，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z467.1702[M﹢H]+(calcd for C26H27O8,467.1702)，确定分子式为C26H26O8。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)显示两组芳香质子偶合系统信号δ6.28(1H,s)、6.97(1H,d,J=8.4Hz)、6.80(1H,d,J=8.4Hz)分别归属于黄酮母核的A环和B环，提示结构中存在1,2,3,4-四取代和五取代苯环结构。由1个末端双键质子信号δ4.54(1H,s)、4.52(1H,s)，1个与季碳相连的甲基质子信号δ1.52(3H,s)，1个连氧碳上的次甲基质子信号δ4.13(1H,t,J=6.9Hz)，1个亚甲基质子信号δ2.73(2H,d,J=6.9Hz)，提示结构中存在1个2-羟基-3-甲基-3-丁烯基取代。由1组顺式双键上的烯氢质子信号δ6.29(1H,d,J=10.0Hz)、5.80(1H,d,J=10.0Hz)，两个季碳上的甲基质子信号δ1.40(3H,s)、1.39(3H,s)，表明结构中存在1个2,2-二甲基-吡喃环。1个甲氧基质子信号δ3.58(3H,s)。1个与羰基缔合的羟基质子信号δ12.62(1H,s)。13CNMR(125MHz,DMSO-d6)显示含有26个碳原子，除了1个OCH3的碳信号δ60.4，1组2-羟基-3-甲基-3-丁烯基碳信号δ29.2、73.8、148.3、110.1、17.5，1组2,2-二甲基-吡喃环的碳信号δ120.6、132.3、75.8、27.5、27.3之外，还给出12个芳香碳信号，1个羰基碳信号δ178.6，两个烯碳信号δ157.1、139.0，以上碳谱数据进一步表明化合物1为异戊烯基化黄酮衍生物。HMBC谱中，由亚甲基氢质子δ2.73(2H,d,J=6.9Hz)与δ162.7(C-7)、104.4(C-8)、155.2(C-9)的远程相关，表明2-羟基-3-甲基-3-丁烯基连接在C-8位。通过烯氢质子δ6.29(1H,d,J=10.0Hz,H-1′′′)与δ118.0(C-1′)、121.2(C-2′)、140.5(C-3′)的HMBC相关，表明2,2-二甲基-吡喃环连接在C-2′和C-3′位。通过δ3.58(3H,s)与δ139.0(C-3)的远程相关，表明未归属的甲氧基连接在C-3位。将化合物1的1H NMR、13C NMR信号通过HSQC、HMBC谱进行归属（见表1）。因此化合物1的结构为6′′,6′′-dimethylpyran(2′′,3′′:2′,3′)-8-(2-hydroxy-3-methyl-3-butenyl)-5,7,4′-trihydroxyl-3-methoxyflavone，命名为sinoflavonoid A。
化合物2，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z453.1910[M﹢H]+(calcd for C26H29O7,453.1913)，确定分子式为C26H28O7。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)显示两组芳香质子偶合系统信号δ6.12(1H,s)、6.77(1H,d,J=8.3Hz)、6.76(1H,d,J=8.3Hz)分别归属于黄酮母核的A环和B环，提示结构中存在1,2,3,4-四取代和五取代苯环结构。由1个烯氢质子信号δ5.01(1H,s)，2个与季碳相连的甲基质子信号δ1.43(3H,s)、1.26(3H,s)，1个亚甲基质子信号δ3.28(2H,d,J=6.8Hz)，提示结构中存在1个异戊烯基取代。由2组亚甲基质子信号δ2.59(2H,t,J=6.7Hz)、1.78(2H,t,J=6.7Hz)，两个季碳上的甲基质子信号δ1.29(6H,s)，表明结构中存在1个2,2-二甲基-二氢吡喃环。1个甲氧基质子信号δ3.57(3H,s)。1个与羰基缔合的羟基质子信号δ12.45(1H,s)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)显示含有26个碳原子，除了1个OCH3的碳信号δ60.2，1组异戊烯基碳信号δ26.2、123.5、130.5、17.5、25.5，1组2,2-二甲基-二氢吡喃环的碳信号δ16.0、31.3、76.6、26.6(×2)之外，还给出12个芳香碳信号，1个羰基碳信号δ178.6，两个烯碳信号δ159.8、139.5，以上碳谱数据进一步表明化合物2为异戊烯基化黄酮衍生物。HMBC谱中，由亚甲基质子信号δ3.28(2H,d,J=6.8Hz,H-1′′′)与δ121.4(C-1′)、143.7(C-3′)的远程相关，表明异戊烯基连接在C-2′位。通过亚甲基质子信号δ2.59(2H,t,J=6.7Hz,H-1′′)与δ159.1(C-7)、100.1(C-8)、154.3(C-9)的HMBC相关，表明2,2-二甲基-二氢吡喃环连接在C-7和C-8位。通过δ3.57(3H,s)与δ139.5(C-3)的远程相关，表明未归属的甲氧基连接在C-3位。将化合物2的1H NMR、13CNMR信号通过HSQC、HMBC谱进行归属（见表1）。因此化合物2的结构为6′′,6′′-dimethyldihydropyran(2′′,3′′:7,8)-2′-(γ,γ-dimethylallyl)-5,3′,4′-trihydroxyl-3-methoxyflavone，命名为sinoflavonoid B。
表1化合物sinoflavonoid A和B的核磁数据
aNMR spectroscopic data were recorded in DMSO-d6at500MHz(1H NMR)and125MHz(13C NMR)
实施例2
本发明在具体实施时，可由以下步骤实现：
（1）粗提取物的制备方法是，小叶莲4.05kg粉碎，过40目筛，每次用小叶莲重量10倍量的体积浓度为95%乙醇在55℃、40kHz、200w条件下，超声提取3次，每次60min，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，加蒸馏水5L混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为小叶莲粗提取物；
（2）硅胶柱色谱初步分离方法是，硅胶柱色谱初步分离方法是，取小叶莲粗提取物50.01g，加入50mL丙酮溶解后，再加入100-200目的硅胶50g，45℃减压回收丙酮，得到载有样品的硅胶，取200-300目的硅胶1.95kg，加入石油醚7.5L，转移到140cm长×8cm内径的色谱柱中，用体积比10:1的石油醚-丙酮平衡色谱柱，将液面降至距硅胶面20cm处，将上述载有样品的硅胶加入到色谱柱的液面上，依次加入体积比为10:1、10:3、10:5梯度的石油醚-丙酮系统，每个梯度15L，进行梯度洗脱，流速为15mLmin-1，每100mL作为1个流份收集，将收集的流份经过TLC分析，合并含有目标成分的流份，减压浓缩，得到含有目标成分的总样，所述的TLC分析中使用的吸附剂为GF254，展开剂为体积比1:1的石油醚-丙酮；
（3）高速逆流色谱纯化方法是，取步骤（2）得的含有目标成分的总样，用总样重量体积10倍量的体积比为4:6:4:4的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水混合制成混合溶剂系统，等体积取该混合溶剂系统中的上相溶剂和下相溶剂，对总样进行超声溶解，得到样品溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，条件是：另取混合溶剂系统的上相为固定相、下相为流动相，开启恒温循环器，温度为25℃，用流速9.99mLmin-1，将固定相注入高速逆流色谱的色谱柱，待充满整个色谱柱后，开启高速逆流色谱仪主机，缓慢将主机转速调整为800r/min，再以1.7mLmin-1流速注入流动相，待流动相从柱出口流出，两相在色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入样品溶液，254nm下检测，记录色谱图，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，得到两种粉末状sinoflavonoid A（化合物1）和sinoflavonoid B（化合物2）；
化合物的纯度检测
HPLC分析确定目标成分的纯度。HPLC条件如下，YMC-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相A：甲醇，流动相B：0.1%三氟乙酸，梯度洗脱程序：0-70min，流动相A有30%升至90%；流速1.0mLmin-1；柱温为35℃；检测波长254nm。经面积归一化法测定，sinoflavonoidA(1，17.04mg)和sinoflavonoid B(2，25.76mg)的纯度分别为98.45%和99.40%。
化合物的结构鉴定
上述两种粉末经过核磁共振光谱（1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC）及高分辨率质谱(HR-ESI-MS)等光谱学技术进行鉴定（鉴定过程同实施例1中的化合物的结构鉴定），其分别为sinoflavonoid A和sinoflavonoid B。
实施例3
本发明在具体实施时，可由以下步骤实现：
（1）粗提取物的制备方法是，小叶莲4.15kg粉碎，过40目筛，每次用小叶莲重量12倍量体积浓度为95%的乙醇在55℃、40kHz、200w条件下，超声提取3次，每次60min，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，加蒸馏水5L混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为小叶莲粗提取物；
（2）硅胶柱色谱初步分离方法是，取小叶莲粗提取物50.08g，加入100mL丙酮溶解后，再加入100-200目的80g硅胶，45℃减压回收丙酮，得到载有样品的硅胶，取200-300目的硅胶1.92kg，加入石油醚7.5L，转移到140cm长×8cm内径的色谱柱中，用体积比10:1的石油醚-丙酮平衡色谱柱，将液面降至距硅胶面20cm处，将上述载有样品的硅胶加入到色谱柱的液面上，依次加入体积比为10:1、10:3、10:5梯度的石油醚-丙酮系统，每个梯度15L，进行梯度洗脱，流速为15mLmin-1，每100mL作为1个流份收集，将收集的流份经过TLC分析，合并含有目标成分的流份，减压浓缩，得到含有目标成分的总样，所述的TLC分析中使用的吸附剂为GF254，展开剂为体积比1:1的石油醚-丙酮；
（3）高速逆流色谱纯化方法是，取步骤（2）得的含有目标成分的总样，用总样重量体积10倍量的体积比为4:6:4:4的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水混合制成混合溶剂系统，等体积取该混合溶剂系统中的上相溶剂和下相溶剂，对总样进行超声溶解，得到样品溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，条件是：另取混合溶剂系统的上相为固定相、下相为流动相，开启恒温循环器，温度为30℃，用流速9.99mLmin-1，将固定相注入高速逆流色谱的色谱柱，待充满整个色谱柱后，开启高速逆流色谱仪主机，缓慢将主机转速调整为1000r/min，再以2.0mLmin-1流速注入流动相，待流动相从柱出口流出，两相在色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入样品溶液，254nm下检测，记录色谱图，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，得到两种粉末状sinoflavonoid A（化合物1）和sinoflavonoid B（化合物2）；
化合物的纯度检测
HPLC分析确定目标成分的纯度。HPLC条件如下，YMC-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相A：甲醇，流动相B：0.1%三氟乙酸，梯度洗脱程序：0-70min，流动相A有30%升至90%；流速1.0mLmin-1；柱温为35℃；检测波长254nm。经面积归一化法测定，sinoflavonoid A(1，17.05mg)和sinoflavonoid B(2，25.78mg)的纯度分别为98.46%和99.39%。
化合物的结构鉴定
上述两种粉末经过核磁共振光谱（1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC）及高分辨率质谱(HR-ESI-MS)等光谱学技术进行鉴定（鉴定过程同实施例1中的化合物的结构鉴定），其分别为sinoflavonoid A和sinoflavonoid B。
实施例4
本发明在具体实施时，可由以下步骤实现：
（1）粗提取物的制备方法是，小叶莲4.10kg粉碎，过40目筛，每次用小叶莲重量6倍量的体积浓度为95%乙醇有55℃、40kHz、200w条件下，超声提取3次，每次60min、合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，加蒸馏水5L混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为小叶莲粗提取物；
（2）硅胶柱色谱初步分离方法是，取小叶莲粗提取物50.02g，加入70mL丙酮溶解后，再加入100-200目的硅胶100g，45℃减压回收丙酮，得到载有样品的硅胶，取200-300目的硅胶1.90kg，加入石油醚7.5L，转移到140cm长×8cm内径的色谱柱中，用体积比10:1的石油醚-丙酮平衡色谱柱，将液面降至距硅胶面20cm处，将上述载有样品的硅胶加入到色谱柱的液面上，依次加入体积比为10:1、10:3、10:5梯度的石油醚-丙酮系统，每个梯度15L，进行梯度洗脱，流速为15mLmin-1，每100mL作为1个流份收集，将收集的流份经过TLC分析，合并含有目标成分的流份，减压浓缩，得到含有目标成分的总样，所述的TLC分析中使用的吸附剂为GF254，展开剂为体积比1:1的石油醚-丙酮；
（3）高速逆流色谱纯化方法是，取步骤（2）得的含有目标成分的总样，用总样重量体积10倍量的体积比为4:6:4:4的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水混合制成混合溶剂系统，等体积取该混合溶剂系统中的上相溶剂和下相溶剂，对总样进行超声溶解，得到样品溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，条件是：另取混合溶剂系统的上相为固定相、下相为流动相，开启恒温循环器，温度22℃，用流速9.99mLmin-1，将固定相注入高速逆流色谱的色谱柱，待充满整个色谱柱后，开启高速逆流色谱仪主机，缓慢将主机转速调整为750r/min，再以1.2mLmin-1流速注入流动相，待流动相从柱出口流出，两相在色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入样品溶液，254nm下检测，记录色谱图，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，得到两种粉末状sinoflavonoid A（化合物1）和sinoflavonoid B（化合物2）；
化合物的纯度检测
HPLC分析确定目标成分的纯度。HPLC条件如下，YMC-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相A：甲醇，流动相B：0.1%三氟乙酸，梯度洗脱程序：0-70min，流动相A有30%升至90%；流速1.0mLmin-1；柱温为35℃；检测波长254nm。经面积归一化法测定，sinoflavonoid A(1，17.04mg)和，sinoflavonoid B(2，25.79mg)的纯度分别为98.45%和99.39%。
化合物的结构鉴定
上述两种粉末经过核磁共振（1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC）及高分辨率质谱(HR-ESI-MS)等光谱学技术进行鉴定（鉴定过程同实施例1中的化合物的结构鉴定），其分别为sinoflavonoid A和sinoflavonoid B。
本发明方法稳定可靠，其提取分离的sinoflavonoid A和sinoflavonoid B经试验，可有效降低血脂，有关实验资料如下：
1.3T3-L1小鼠脂肪前体细胞的培养与分化
3T3-L1小鼠脂肪前体细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，加入100U/mL的青霉素，0.1mg/mL的链霉素。待细胞汇合达70%时，胰蛋白酶消化，传代，至完全汇合后2天时开始诱导分化，将培养液换成含0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1μmol/L地塞米松和2mg/L胰岛素的完全培养液；48h后，使完全培养液只含有胰岛素2mg/L；48h后，用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，每隔48小时换培养液一次，直到95％以上的细胞都为成熟的脂肪细胞。
2.Sinoflavonoid A和Sinoflavonoid A B干预实验
细胞分化成熟后，用含1%胎牛血清的培养基行饥饿疗法24h后，加入不同浓度的测试化合物（0、0.5、0.1、0.2mmol/L）干预24h。
3.胆固醇流出率的测定
种植于24孔板的分化成熟的脂肪细胞用0.5μCi/孔3H-胆固醇和含0.2％牛血清白蛋白的DMEM培养液共同孵育24h之后，用DMEM培养液洗涤细胞，再用含0.2％牛血清白蛋白的DMEM培养液培养细胞24h，并在培养液中加各种影响因素。之后，再用培养液洗涤细胞，在含10μg/L载脂蛋白A-I无血清新培养液中培养细胞4h，闪烁计数法分别检测培养液和细胞中的3H-胆固醇，胆固醇流出率=培养液中CPM/总CPM×100％。Sinoflavonoid A和B可增加分化成熟的3T3-L1脂肪细胞中载脂蛋白A-I介导的胆固醇流出（P＜0.05）。
表2.测试物对载体蛋白A-I介导的脂肪细胞胆固醇流出的影响（%）
样品名 空白组 0.1mmol/L 0.2mmol/L 0.4mmol/L
sinoflavonoid A 2.58±0.15 2.97±0.13 3.26±0.21 3.98±0.35
sinoflavonoid B 2.58±0.11 2.73±0.16 3.04±0.19 3.85±0.32
由上述实验表明，本发明制备出的sinoflavonoid A和sinoflavonoid B可加速3T3-L1小鼠脂肪细胞内胆固醇流出，降低细胞内胆固醇含量，具有降血脂作用，开辟了小叶莲用于降血脂药物的新用途。

Claims (6)

1.一种小叶莲中两个具有降血脂活性的新异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，小叶莲中两个具有降血脂活性的新异戊烯基化黄酮类化合物桃儿七酮A和桃儿七酮B的化学结构式分别为：
制备方法如下：
(1)、制备粗提取物，方法是：小叶莲粉碎，过40目筛，每次用小叶莲重量6-12倍量的体积浓度为95％的乙醇在55℃、40kHz、200w超声提取3次，每次60min,合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩物，加浓缩物重量体积10-15倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为小叶莲粗提取物；所述的重量体积是指固体物以g计，液体物以ml计，以下同；
(2)、硅胶柱色谱初步分离，方法是：乙酸乙酯萃取部位的浸膏小叶莲粗提取物经硅胶柱色谱初步分离，采用体积比为10:1-5的石油醚-丙酮系统进行梯度洗脱，流速为15mLmin-1，每100mL为1个流份，收集含有目标成分的流份，45℃减压浓缩，得到含有目标成分的总样；
(3)、高速逆流色谱纯化，方法是：取步骤(2)得的含有目标成分的总样，用总样重量体积10倍量的体积比为4:6:4:4的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水混合制成混合溶剂系统，等体积取该混合溶剂系统中的上相溶剂和下相溶剂，对总样进行超声溶解，得到样品溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，条件是：另取混合溶剂系统的上相为固定相、下相为流动相，恒温循环器的温度为22-30℃，高速逆流色谱仪主机转速750-1000r/min，流动相流速1.0-2.0mLmin-1，两相在高速逆流色谱仪的色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入样品溶液，检测波长254nm，记录色谱图，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，得到两个新的异戊烯基化黄酮类化合物桃儿七酮A和桃儿七酮B。
2.根据权利要求1所述的小叶莲中两个具有降血脂活性的新异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
(1)、制备粗提取物，方法是：小叶莲4.09kg粉碎，过40目筛，每次用小叶莲重量8倍量的体积浓度为95％乙醇在55℃、40kHz、200w条件下，超声提取3次，每次60min，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，加蒸馏水5L混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为小叶莲粗提取物；
(2)、硅胶柱色谱初步分离，方法是：取小叶莲粗提取物50.07g，加入80mL丙酮溶解后，再加入100-200目的硅胶60g，45℃减压回收丙酮，得到载有样品的硅胶，取200-300目的硅胶1.94kg，加入石油醚7.5L，转移到140cm长×8cm内径的色谱柱中，用体积比10:1的石油醚-丙酮平衡色谱柱，将液面降至距硅胶面20cm处，将上述载有样品的硅胶加入到色谱柱的液面上，依次加入体积比为10:1、10:3、10:5梯度的石油醚-丙酮系统，每个梯度15L，进行梯度洗脱，流速为15mLmin-1，每100mL作为1个流份收集，将收集的流份经过TLC分析，合并含有目标成分的流份，减压浓缩，得到含有目标成分的总样，所述的TLC分析中使用的吸附剂为GF254，展开剂为体积比1:1的石油醚-丙酮；
(3)、高速逆流色谱纯化，方法是，取步骤(2)得的含有目标成分的总样，用总样重量体积10倍量的体积比为4:6:4:4的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水混合制成混合溶剂系统，等体积取该混合溶剂系统中的上相溶剂和下相溶剂，对总样进行超声溶解，得到样品溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，条件是：另取混合溶剂系统的上相为固定相、下相为流动相，开启恒温循环器，温度为25℃，用流速9.99mLmin-1将固定相注入高速逆流色谱的色谱柱，待充满整个色谱柱后，开启高速逆流色谱仪主机，缓慢将主机转速调整为800r/min，再以1.7mLmin-1流速注入流动相，待流动相从柱出口流出，两相在色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入样品溶液，254nm下检测，记录色谱图，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，得到两种粉末状的桃儿七酮A和桃儿七酮B。
3.根据权利要求1所述的小叶莲中两个具有降血脂活性的新异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
(1)、制备粗提取物，方法是：小叶莲4.05kg粉碎，过40目筛，每次用小叶莲重量10倍量的体积浓度为95％乙醇在55℃、40kHz、200w条件下，超声提取3次，每次60min，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，加蒸馏水5L混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为小叶莲粗提取物；
(2)、硅胶柱色谱初步分离，方法是，硅胶柱色谱初步分离方法是，取小叶莲粗提取物50.01g，加入50mL丙酮溶解后，再加入100-200目的硅胶50g，45℃减压回收丙酮，得到载有样品的硅胶，取200-300目的硅胶1.95kg，加入石油醚7.5L，转移到140cm长×8cm内径的色谱柱中，用体积比10:1的石油醚-丙酮平衡色谱柱，将液面降至距硅胶面20cm处，将上述载有样品的硅胶加入到色谱柱的液面上，依次加入体积比为10:1、10:3、10:5梯度的石油醚-丙酮系统，每个梯度15L，进行梯度洗脱，流速为15mLmin-1，每100mL作为1个流份收集，将收集的流份经过TLC分析，合并含有目标成分的流份，减压浓缩，得到含有目标成分的总样，所述的TLC分析中使用的吸附剂为GF254，展开剂为体积比1:1的石油醚-丙酮；
(3)、高速逆流色谱纯化，方法是，取步骤(2)得的含有目标成分的总样，用总样重量体积10倍量的体积比为4:6:4:4的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水混合制成混合溶剂系统，等体积取该混合溶剂系统中的上相溶剂和下相溶剂，对总样进行超声溶解，得到样品溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，条件是：另取混合溶剂系统的上相为固定相、下相为流动相，开启恒温循环器，温度为25℃，用流速9.99mLmin-1，将固定相注入高速逆流色谱的色谱柱，待充满整个色谱柱后，开启高速逆流色谱仪主机，缓慢将主机转速调整为800r/min，再以1.7mLmin-1流速注入流动相，待流动相从柱出口流出，两相在色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入样品溶液，254nm下检测，记录色谱图，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，得到两种粉末状的桃儿七酮A和桃儿七酮B。
4.根据权利要求1所述的小叶莲中两个具有降血脂活性的新异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
(1)、制备粗提取物，方法是：小叶莲4.15kg粉碎，过40目筛，每次用小叶莲重量12倍量体积浓度为95％的乙醇在55℃、40kHz、200w条件下，超声提取3次，每次60min，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，加蒸馏水5L混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为小叶莲粗提取物；
(2)、硅胶柱色谱初步分离，方法是，取小叶莲粗提取物50.08g，加入100mL丙酮溶解后，再加入100-200目的80g硅胶，45℃减压回收丙酮，得到载有样品的硅胶，取200-300目的硅胶1.92kg，加入石油醚7.5L，转移到140cm长×8cm内径的色谱柱中，用体积比10:1的石油醚-丙酮平衡色谱柱，将液面降至距硅胶面20cm处，将上述载有样品的硅胶加入到色谱柱的液面上，依次加入体积比为10:1、10:3、10:5梯度的石油醚-丙酮系统，每个梯度15L，进行梯度洗脱，流速为15mLmin-1，每100mL作为1个流份收集，将收集的流份经过TLC分析，合并含有目标成分的流份，减压浓缩，得到含有目标成分的总样，所述的TLC分析中使用的吸附剂为GF254，展开剂为体积比1:1的石油醚-丙酮；
(3)、高速逆流色谱纯化，方法是，取步骤(2)得的含有目标成分的总样，用总样重量体积10倍量的体积比为4:6:4:4的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水混合制成混合溶剂系统，等体积取该混合溶剂系统中的上相溶剂和下相溶剂，对总样进行超声溶解，得到样品溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，条件是：另取混合溶剂系统的上相为固定相、下相为流动相，开启恒温循环器，温度为30℃，用流速9.99mLmin-1，将固定相注入高速逆流色谱的色谱柱，待充满整个色谱柱后，开启高速逆流色谱仪主机，缓慢将主机转速调整为1000r/min，再以2.0mLmin-1流速注入流动相，待流动相从柱出口流出，两相在色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入样品溶液，254nm下检测，记录色谱图，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，得到两种粉末状的桃儿七酮A和桃儿七酮B。
5.根据权利要求1所述的小叶莲中两个具有降血脂活性的新异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
(1)、制备粗提取物，方法是：小叶莲4.10kg粉碎，过40目筛，每次用小叶莲重量6倍量的体积浓度为95％乙醇有55℃、40kHz、200w条件下，超声提取3次，每次60min、合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，加蒸馏水5L混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为小叶莲粗提取物；
(2)、硅胶柱色谱初步分离，方法是，取小叶莲粗提取物50.02g，加入70mL丙酮溶解后，再加入100-200目的硅胶100g，45℃减压回收丙酮，得到载有样品的硅胶，取200-300目的硅胶1.90kg，加入石油醚7.5L，转移到140cm长×8cm内径的色谱柱中，用体积比10:1的石油醚-丙酮平衡色谱柱，将液面降至距硅胶面20cm处，将上述载有样品的硅胶加入到色谱柱的液面上，依次加入体积比为10:1、10:3、10:5梯度的石油醚-丙酮系统，每个梯度15L，进行梯度洗脱，流速为15mLmin-1，每100mL作为1个流份收集，将收集的流份经过TLC分析，合并含有目标成分的流份，减压浓缩，得到含有目标成分的总样，所述的TLC分析中使用的吸附剂为GF254，展开剂为体积比1:1的石油醚-丙酮；
(3)、高速逆流色谱纯化，方法是，取步骤(2)得的含有目标成分的总样，用总样重量体积10倍量的体积比为4:6:4:4的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水混合制成混合溶剂系统，等体积取该混合溶剂系统中的上相溶剂和下相溶剂，对总样进行超声溶解，得到样品溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，条件是：另取混合溶剂系统的上相为固定相、下相为流动相，开启恒温循环器，温度22℃，用流速9.99mLmin-1，将固定相注入高速逆流色谱的色谱柱，待充满整个色谱柱后，开启高速逆流色谱仪主机，缓慢将主机转速调整为750r/min，再以1.2mLmin-1流速注入流动相，待流动相从柱出口流出，两相在色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入样品溶液，254nm下检测，记录色谱图，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，得到两种粉末状的桃儿七酮A和桃儿七酮B。
6.一种小叶莲中两个具有降血脂活性的新异戊烯基化黄酮类化合物在制备降血脂药物中的应用，所述的两个具有降血脂活性的新异戊烯基化黄酮类化合物分别为桃儿七酮A和桃儿七酮B，桃儿七酮A和桃儿七酮B的化学结构式分别为：
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